本发明属于蛋白质检测
技术领域：
，特别涉及基于抗体与质谱技术用于对生物样品中蛋白质分析的试剂盒制备方法。
背景技术：
：不论是细胞的正常功能还是病理特性都在一定程度上取决于细胞所表达的蛋白质功能。因此，鉴定人体内表达的蛋白质的区别，可用于体外疾病样本诊断及筛查，并最终用于药物开发和疾病治疗。而要进行蛋白质表达和功能的差异化分析，要求能够达到分辨细胞内分子的复杂混合物的程度。但细胞内许多物质往往以微量存在，目前用于分析蛋白的方法在上述各方面都有局限，用这些常规手段难以进行化学结构及蛋白质序列鉴定分析。用抗体和质谱联合可克服这一技术缺点。免疫质谱(IMS)的概念是利用磁珠等将血清样本中的相关蛋白质固定在磁珠表面的特异性抗体上，通过洗提液获取目的蛋白质并点样于钢芯片上，由蛋白指纹图谱仪(质谱仪)以图谱形式读取钢芯片上的样本所含蛋白信息(许洋，蛋白质指纹图谱技术在实验诊断与临床医学中的研究进展，基础医学与临床，2007，27(2)：134-142)。传统用于蛋白质检测试剂盒及制备方法为ELISA等传统免疫分析技术。ELISA等传统免疫分析技术主要依靠间接的化学或放射测定法，因而无法直接鉴定抗原的变异。举例讲，β2微球蛋白的检测试剂盒制备方法为先将抗β2微球蛋白抗体(第一个抗体)结合至固相表面(如玻璃)，然后将含β2微球蛋白的样品(如血清)，加至这个已标有抗β2微球蛋白抗体的容器中；这样，β2微球蛋白就会结合至抗体上，然后洗脱未结合的物质。再加上已标有酶、放射性或化学发光性的抗β2微球蛋白抗体(第二个抗体)，这样就可以检测出β2微球蛋白的总含量。这种方法学的缺点是无法测出β2微球蛋白的变异(如β2微球蛋白的N或C端丢失了一个或数个氨基酸，β2微球蛋白被甲基，酰基等修饰，β2微球蛋白的异构体)。即通常被用于传统检测β2微球蛋白试验是检测所谓的总β2微球蛋白，而不是β2微球蛋白变异或β2微球蛋白亚单位等浓度。传统β2微球蛋白检测试剂盒无法同时检测差别性的β2微球蛋白异构体。目前在进行蛋白质质谱分析时还缺乏标准化、优化的免疫质谱试剂盒。在临床工作中发现有相当比例的变异的或修饰的蛋白质无法被检测出，这对于肿瘤患者的预后评估则缺乏有效的早期监测手段。技术实现要素：科学上把含有6.02×1023个微粒的集体作为一个单位，叫摩尔或摩。摩尔是表示物质的量(符号是n)的单位，简称为摩，单位符号是mole(mol)。1mol的碳原子含6.02×1023个碳原子，质量为12g。1mol的硫原子含6.02×1023个硫原子，质量为32g，同理，1摩任何原子的质量都是以克为单位，数值上等于该种原子的相对原子质量。同样我们可以推算出，1摩任何物质的质量，都是以克为单位，数值上等于该种物质的分子量。水的分子量是18，1mol的质量为18g，含6.02×1023个水分子。通常把1mol物质的质量，叫做该物质的摩尔质量(符号是M)，摩尔质量的单位是克/摩(符号是“g/mol”)例如，水的摩尔质量为18g/mol，写成M(H2O)＝18g/mol。等质量(或重量)的不同的原子或分子，其摩任数不同；如12g的碳原子和12g的硫原子的摩任数不同。等摩任的不同的原子或分子，其数量相同；如1mol的碳原子和1mol的硫原子的原子数量相同，均为6.02×1023个原子。本发明的目的是克服已有技术的不足之处，提出一种用于检测七种、变异的蛋白质(转甲状腺素蛋白、载脂蛋白A、β2微球蛋白、转铁蛋白、补体C3a、纤维蛋白肽A、载脂蛋白C亚基标志物)的免疫质谱试剂盒及制备方法，该试剂盒为肿瘤早期转移检测提供了新的途径，并为进一步发现新的标志提供了基础。本发明的免疫质谱试剂盒(蛋白指纹法)采用磁珠-多种已知等摩尔抗体组(转甲状腺素蛋白、载脂蛋白A、β2微球蛋白、转铁蛋白、补体C3a、纤维蛋白肽A、载脂蛋白C亚基的抗体)特异性结合血清中的、变异的疾病相关标志物(转甲状腺素蛋白、载脂蛋白A、β2微球蛋白、转铁蛋白、补体C3a、纤维蛋白肽A、载脂蛋白C亚基)；用等摩尔抗体组(转甲状腺素蛋白、载脂蛋白A、β2微球蛋白、转铁蛋白、补体C3a、纤维蛋白肽A、载脂蛋白C亚基的抗体)标记的磁珠用比等重量或等量(如等μg)抗体组(转甲状腺素蛋白、载脂蛋白A、β2微球蛋白、转铁蛋白、补体C3a、纤维蛋白肽A、载脂蛋白C亚基的抗体)标记的磁珠更好。等摩尔抗体的结合蛋白质或抗原的位点是一致的或相等的；而等重量(如等μg)抗体，由于每种或每个抗体的重量不同，故等重量抗体(如每种抗体糖基化的量不同、故重量不同)结合蛋白质或抗原的位点数不一定相等的，造成结合力不均匀。科学研究发现，蛋白质标志物的变异、修饰是常见肿瘤早期转移的标志物(许洋，蛋白质指纹图谱技术在实验诊断与临床医学中的研究进展，基础医学与临床，2007，27(2)：134-142)。故本试剂盒适用于常见肿瘤转移的早期辅助诊断、预测预后和追踪肿瘤的复发。本发明提出的一种实时、痕量、修饰性标志物的免疫质谱试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：一小管含质控品，含七种等摩尔、变异的转甲状腺素蛋白、载脂蛋白A、β2微球蛋白、转铁蛋白、补体C3a、纤维蛋白肽A、载脂蛋白C亚基的质谱标准化质控血清(浆)，10～30μl；一小管含等摩尔标记的转甲状腺素蛋白、载脂蛋白A、β2微球蛋白、转铁蛋白、补体C3a、纤维蛋白肽A、载脂蛋白C亚基抗体的磁珠30～50μl；一小管粘合液300～500μl，该粘合液为50～100mMPBS，pH值为7.0～7.4；一小管清洗液10～50μl，该清洗液为dH2O溶液；一小管洗提液10～50μl，该洗提液为1～5％三氟乙酸的水溶液；一小管稳定剂(能量吸收分子饱和溶液)5～10μl，该溶液由能量吸收分子溶解在含30～60％乙腈和0.5～1％三氟乙酸的水溶液中构成，该能量吸收分子可采用肉桂酸衍生物、芥子酸、二羟基苯甲酸之中的任一种；上述各小管置于4～8℃冷藏盒中。本发明提出的上述试剂盒制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：1)质谱标准化质控血清(浆)的制备：将男性、女性等量的O型血清(浆)稀释在缓冲溶液中制成质谱的标准化质控血清(浆)，并将该稀释的血清(浆)分装成10～30μl小管中；加入等摩尔七种变异的蛋白质：转甲状腺素蛋白、载脂蛋白A、β2微球蛋白、转铁蛋白、补体C3a、纤维蛋白肽A、载脂蛋白C亚基；2)制备含七种等摩尔标记的转甲状腺素蛋白、载脂蛋白A、β2微球蛋白、转铁蛋白、补体C3a、纤维蛋白肽A、载脂蛋白C亚基抗体的磁珠：将转甲状腺素蛋白、载脂蛋白A、β2微球蛋白、转铁蛋白、补体C3a、纤维蛋白肽A、载脂蛋白C亚基免疫小鼠，待免疫反应出现后，从外周血中分离B细胞，按标准的单克隆抗体的制备方法制备；将购买的FC-III双环肽(DCAWHLGELVWCT)-磁珠30～50μl标记上等摩尔的抗体；3)将购买的50～100mMPBS(Phosphate-BufferedSaline)，pH值为7.0～7.4缓冲液、1～5％三氟乙酸的洗脱液分别分装成300～500μl小管和10～50μl小管；4)将能量吸收分子溶解30～60％乙腈和0.5～1％三氟乙酸的水溶液中制成能量吸收分子饱和溶液，并分装成5～10μl小管，该能量吸收分子可采用肉桂酸衍生物、芥子酸、二羟基苯甲酸之中的任一种；5)将上述分装好的各小管置于4～8℃冷藏箱中。本发明还提出所述的试剂盒对实时、痕量、修饰性标志物的免疫质谱试剂盒的应用。表二、所述的检测试剂盒对常见肿瘤早期转移的判断为：标志物峰值(m/z±Da)信噪比转甲状腺素蛋白13761±1＞10载脂蛋白A28078±3＞10β2微球蛋白11731±1＞10转铁蛋白75000±7＞10补体C3a8938±1＞10纤维蛋白肽A1465±1＞10载脂蛋白C亚基6600±1＞10注：上述100例含变异的转甲状腺素蛋白、载脂蛋白A、β2微球蛋白、转铁蛋白、补体C3a、纤维蛋白肽A、载脂蛋白C亚基升高的不同肿瘤类型、早期转移的肿瘤患者的血清及尿液，信噪比＞10代表阳性。所述试剂盒依据上述几个特征蛋白峰，双盲测试含变异的、修饰的转甲状腺素蛋白、载脂蛋白A、β2微球蛋白、转铁蛋白、补体C3a、纤维蛋白肽A、载脂蛋白C亚基(从上述分子量可以确认为变异的、修饰的转甲状腺素蛋白、载脂蛋白A、β2微球蛋白、转铁蛋白、补体C3a、纤维蛋白肽A、载脂蛋白C)样品的敏感性100％，特异性100％。本试剂盒检测变异的转甲状腺素蛋白、载脂蛋白A、β2微球蛋白、转铁蛋白、补体C3a、纤维蛋白肽A、载脂蛋白C亚基的应用实验步骤包括：1.将生物样品先用粘合液稀释30～50倍，将样品充分混匀；2.将上述标本50～100μl加至已装好磁珠-FC-III双环肽-抗体(等摩尔转甲状腺素蛋白、载脂蛋白A、β2微球蛋白、转铁蛋白、补体C3a、纤维蛋白肽A、载脂蛋白C亚基等抗体)的PCR管中，置磁性处理器上，15～25℃孵育20～40分钟，除去液体；3.加10～50μl清洗液至已装好磁珠的PCR管，置磁性处理器上孵育1～5分钟，除去液体，重复上述操作两次；4.加10μl洗提液1～5分钟，洗提标本至上清液；5.取5μl上清液移至另一个PCR管中，加入5μl稳定剂充分混匀；6.取1μl混合溶液加样至质谱专用金属片(有3x3mm圆孔)上，自然干燥金属片；7.将上述金属片加入质谱仪中，就会生成质谱图；8.外部使用多肽分子质量标准来校正质量精确性，所有样本均进行双份检测以减少实验误差。上述的生物标志是利用一台质谱仪来检测的，该设备的质量精确度约为+/-0.001％，可以精确鉴定蛋白质的一个氨基酸的变异范围。本发明专利中，抗体提取物质是新型的抗体纯化物质，Fc-III双环肽(氨基酸结构为DCAWHLGELVWCT)，其创新点为Fc-III双环肽在空间位置中的体积远远比ProteinA、ProteinG小，从而减少干扰、可以重新捕获因ProteinA、ProteinG体积大而没有被捕获的目标标志物(即用ProteinA、ProteinG系统检测阴性的免疫质谱法实验，采用Fc-III双环肽的系统，可能会检测阳性，从而解决假阴性问题)；特异性与结合抗体的Fc位点的结合力比ProteinG高，亲和常数可达nM级(ShanFeng，etal.，DevelopmentoftheFc-IIITaggedProteinExpressionSystemforProteinPurificationandDetection，PLoSONE2012；7(8)：e44208)。举例说明，Fc-III双环肽，可选择性或特异性结合抗体的Fc位点，洗去未吸附的抗体，可制作Fc-III双环肽-抗体或抗体复合物。任何适宜的洗液均可使用。质谱对待分析物的分析生成飞行时间谱。该飞行时间谱的最终分析并不表示离子化能量攻击一个样本产生的单独的脉冲信号，而是一系列脉冲的信号之和。这样降低了干扰，并增加了动态范围。该飞行时间数据受数据处理软件的影响。软件中数据处理主要包括转换飞行时间与质荷比而产生质谱，降低基线而减少仪器的偏移量，和过滤高频噪音而减轻高频噪音。通过对等摩尔转甲状腺素蛋白、载脂蛋白A、β2微球蛋白、转铁蛋白、补体C3a、纤维蛋白肽A、载脂蛋白C亚基抗体捕获分子检测而产生的数据可利用计算机的数据分析程序进行分析。该计算机程序分析这些数据以显示检测出的、变异的转甲状腺素蛋白、载脂蛋白A、β2微球蛋白、转铁蛋白、补体C3a、纤维蛋白肽A、载脂蛋白C亚基的相对摩尔数量(由于质谱标准化质控血清或血浆中加入等摩尔、七种、变异的转甲状腺素蛋白、载脂蛋白A、β2微球蛋白、转铁蛋白、补体C3a、纤维蛋白肽A、载脂蛋白C亚基)；而七种物质：变异的转甲状腺素蛋白、载脂蛋白A、β2微球蛋白、转铁蛋白、补体C3a、纤维蛋白肽A、载脂蛋白C亚基的摩尔数是已知的；故可用质谱相对信号的强度计算出样本中变异的转甲状腺素蛋白、载脂蛋白A、β2微球蛋白、转铁蛋白、补体C3a、纤维蛋白肽A、载脂蛋白C亚基相对摩尔数量，并显示飞行时间和确定被检测的、变异的每个转甲状腺素蛋白、载脂蛋白A、β2微球蛋白、转铁蛋白、补体C3a、纤维蛋白肽A、载脂蛋白C亚基的分子量。实施例1中可以看到摩尔数量标记的方法比用等重量标记的转甲状腺素蛋白、载脂蛋白A、β2微球蛋白、转铁蛋白、补体C3a、纤维蛋白肽A、载脂蛋白C亚基抗体来捕获样本中、变异的转甲状腺素蛋白、载脂蛋白A、β2微球蛋白、转铁蛋白、补体C3a、纤维蛋白肽A、载脂蛋白C亚基分子更精确。数据分析还能包括一系列的确定变异的转甲状腺素蛋白、载脂蛋白A、β2微球蛋白、转铁蛋白、补体C3a、纤维蛋白肽A、载脂蛋白C亚基的信号强度、信噪比和矫正数据对预定统计分布状态的偏离。例如，通过计算与某些参数相关的每个峰值的高度、信噪比，可规范观测到的峰。该参数可能是由仪器和类似能量吸收分子等化学成分产生的不重要的干扰，这可以设置调零。分析一般包括展示从待分析物得到的信号的图谱中峰的鉴定。峰可以通过视图进行选择，软件是可用的，它可自动检测峰。一般情况下，该软件通过鉴定信号具有信噪比高于一个选择阈值并标记出在峰信号的质心处的峰的质量这样的方式操作。在一个有效的程序中，比较许多谱线以认定出现在质谱中某一选定范围内同样的一些峰。该软件的一个版本聚集所有出现在确定的质量范围内的各条光谱的峰，对所有在质量(质荷比)中值附近的峰指定一个质量(质荷比)簇。本发明中使用的、变异的转甲状腺素蛋白、载脂蛋白A、β2微球蛋白、转铁蛋白、补体C3a、纤维蛋白肽A、载脂蛋白C亚基是等摩尔特异性抗体所捕获。这些变异的转甲状腺素蛋白、载脂蛋白A、β2微球蛋白、转铁蛋白、补体C3a、纤维蛋白肽A、载脂蛋白C亚基是进一步通过质谱(massspectrometry)测定其不同分子量来知道它们特定的身份。利用C8及C18疏水基质、WCX基质、或IMAC磁珠(或芯片)及用血液(血清、血浆)、尿液样本的实验结果是一致的。利用本发明的分析方法，通过临床双盲对比分析(371例正常人群、367例无转移肿瘤患者、302例早期肿瘤转移患者)，吻合率在91-95％，故上述蛋白质标志物的变异、修饰是常见肿瘤早期转移的标志物，可应用于实时、痕量、修饰性标志物的免疫质谱检测。本发明可用于体外细胞和非侵入性的体外质谱检测方法的定量控制，如离体体液的试剂盒用于临床质谱的检测方法。可以检测多个蛋白质生物标志群及质谱多肽蛋白图谱。本发明中的试剂盒及方法与其他非侵入性的体外检测方法比较，具有以下的特点：(1)精确质谱直接分析有很强的精确性。因为蛋白质是由氨基酸组成的，而氨基酸的平均质量是已知的，如果知道了抗原或生物标志的总分子量，那么抗原的变异(指氨基酸变化)就很容易被推测出来。(2)方便所用Fc-III双环肽-抗体或抗体复合物的支持物是磁珠或芯片。用磁性分离器分离磁珠及样品，无需离心样品。(3)准确本发明采用了等摩尔抗体标记-质谱分析一次性、同时检测差别性的七种、变异的蛋白质的相对摩尔数量：转甲状腺素蛋白、载脂蛋白A、β2微球蛋白、转铁蛋白、补体C3a、纤维蛋白肽A、载脂蛋白C亚基；比等重量抗体标记-质谱分析更准确。具体实施方式本发明将结合具体实施例作进一步说明，这些实例仅用于说明目的，而不用于限制本发明范围。实施例1本发明提出的免疫质谱试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：一小管含质控品，含七种等摩尔、变异的转甲状腺素蛋白、载脂蛋白A、β2微球蛋白、转铁蛋白、补体C3a、纤维蛋白肽A、载脂蛋白C亚基的质谱标准化质控血清(浆)，10～30μl；一小管含等摩尔标记的转甲状腺素蛋白、载脂蛋白A、β2微球蛋白、转铁蛋白、补体C3a、纤维蛋白肽A、载脂蛋白C亚基抗体的磁珠30～50μl；一小管粘合液300～500μl，该缓冲液为50～100mMPBS，pH值为7.0～7.4；一小管清洗液10～50μl，该清洗液为dH2O溶液；一小管洗提液10～50μl，该洗提液为1～5％三氟乙酸的水溶液；一小管稳定剂(能量吸收分子饱和溶液)5～10μl，该溶液由能量吸收分子溶解在含30～60％乙腈和0.5～1％三氟乙酸的水溶液中构成，该能量吸收分子可采用肉桂酸衍生物、芥子酸、二羟基苯甲酸之中的任一种；上述各小管置于4～8℃冷藏盒中。本发明提出的上述试剂盒制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：1)质谱标准化质控血清(浆)的制备：将男性、女性等量的O型血清(浆)稀释在缓冲溶液中制成质谱的标准化质控血清(浆)，并将该稀释的血清(浆)分装成10～30μl小管中；加入等摩尔七种变异的转甲状腺素蛋白、载脂蛋白A、β2微球蛋白、转铁蛋白、补体C3a、纤维蛋白肽A、载脂蛋白C亚基；2)制备含七种等摩尔转甲状腺素蛋白、载脂蛋白A、β2微球蛋白、转铁蛋白、补体C3a、纤维蛋白肽A、载脂蛋白C亚基抗体的磁珠：将转甲状腺素蛋白、载脂蛋白A、β2微球蛋白、转铁蛋白、补体C3a、纤维蛋白肽A、载脂蛋白C亚基免疫小鼠，待免疫反应出现后，从外周血中分离B细胞，按标准的单克隆抗体的制备方法制备；将购买的FC-III双环肽(DCAWHLGELVWCT)-磁珠30～50μl标记上等摩尔的抗体；3)将购买的50～100mMPBS(Phosphate-BufferedSaline)，pH值为7.0～7.4缓冲液、1～5％三氟乙酸的洗脱液分别分装成300～500μl小管和10～50μl小管；4)将能量吸收分子溶解30～60％乙腈和0.5～1％三氟乙酸的水溶液中制成能量吸收分子饱和溶液，并分装成5～10μl小管，该能量吸收分子可采用肉桂酸衍生物、芥子酸、二羟基苯甲酸之中的任一种；5)将上述分装好的各小管置于4～8℃冷藏箱中。重复性表一、取样本进行重复检测三次，检测相关蛋白标志物蛋白峰，结果一致：标志物峰值(m/z±Da)信噪比转甲状腺素蛋白13761±1＞10载脂蛋白A28078±3＞10β2微球蛋白11731±1＞10转铁蛋白75000±7＞10补体C3a8938±1＞10纤维蛋白肽A1465±1＞10载脂蛋白C亚基6600±1＞10注：上述样本为标准品血清及尿液：含七种变异的转甲状腺素蛋白、载脂蛋白A、β2微球蛋白、转铁蛋白、补体C3a、纤维蛋白肽A、载脂蛋白C标准品；信噪比＞10代表阳性。所述试剂盒依据上述几个特征蛋白峰，双盲测试含变异的、修饰的转甲状腺素蛋白、载脂蛋白A、β2微球蛋白、转铁蛋白、补体C3a、纤维蛋白肽A、载脂蛋白C亚基(从上述分子量可以确认为变异的、修饰的转甲状腺素蛋白、载脂蛋白A、β2微球蛋白、转铁蛋白、补体C3a、纤维蛋白肽A、载脂蛋白C)样品的敏感性100％，特异性100％。采用本发明方法制备的试剂盒的应用及效果说明如下：一、材料1.标本来源：A.100例正常人对照组的血清及尿液；B.100例含变异的转甲状腺素蛋白、载脂蛋白A、β2微球蛋白、转铁蛋白、补体C3a、纤维蛋白肽A、载脂蛋白C亚基升高的不同肿瘤类型、早期转移的肿瘤患者的血清及尿液；C.标准品血清及尿液：含七种变异的转甲状腺素蛋白、载脂蛋白A、β2微球蛋白、转铁蛋白、补体C3a、纤维蛋白肽A、载脂蛋白C标准品。2.质量控制：A.人标准化质控血清B.质谱激光能量调控：每次测试前，用上述标准化质控血清。3.磁珠表面含已标记的等摩尔抗体：抗转甲状腺素蛋白、载脂蛋白A、β2微球蛋白、转铁蛋白、补体C3a、纤维蛋白肽A、载脂蛋白C亚基。将Fc-III双环肽用Carbodiimide方法标记在磁珠上(见GunnDL，etal.JImmunolMethods.1：381-389，1972)；具有吸附剂功能的Fc-III双环肽与抗体置磁性处理器上，22℃孵育30分钟，除去液体。加100μl缓冲液(50mMPBS，pH7.0～7.4)至已装好磁珠的PCR管，置磁性处理器上孵育2分钟，除去液体，重复上述操作两次。二、方法1.样品的收集：全血采集后吸取血清及尿液，置于-80℃保存；-80℃冰箱中取出血清及尿液样品，置冰盒上融解；以10,000转/分，4℃离心2分钟；取上清液。2.样品的准备：每个吸附剂支持物点需要血清及尿液1μl，将血清及尿液用缓冲液稀释，将样品充分混匀。3.样品检测：上样，将上述标本50～100μl加至已装好磁珠-Fc-III双环肽-抗体的PCR管中，置磁性处理器上，22℃孵育30分钟，除去液体。加50～100μl缓冲液(50mMPBS，pH7.0～7.4)至已装好磁珠的PCR管，置磁性处理器上孵育2分钟，除去液体；加清洗液重复上述操作两次。加10μl洗提液2分钟，洗提标本至上清液。取5μl上清液移至另一个PCR管中，加入5μl能量吸收分子饱和溶充分混匀，取1μl混合溶液加样至质谱专用金属片(有3x3mm圆孔)上，自然干燥金属片。所有样本均进行双份检测以减少实验误差。4.将上述样品加入质谱中，就会生成飞行时间质谱图。外部使用多肽分子质量标准来校正质量精确性。实验结果准确性当磁珠含已标记的等摩尔抗体：抗转甲状腺素蛋白、载脂蛋白A、β2微球蛋白、转铁蛋白、补体C3a、纤维蛋白肽A、载脂蛋白C亚基抗体，用统计学方法，通过分析血清蛋白指纹峰，所述试剂盒依据上述几个特征蛋白峰，双盲测试含变异的转甲状腺素蛋白、载脂蛋白A、β2微球蛋白、转铁蛋白、补体C3a、或纤维蛋白肽A、载脂蛋白C亚基样品的敏感性100％，特异性100％。当磁珠含已标记的等重量抗体(如等量1-5μg)：抗-转甲状腺素蛋白、抗-载脂蛋白A、抗-β2微球蛋白、抗-转铁蛋白、抗-补体C3a、抗-纤维蛋白肽A、抗-载脂蛋白C亚基时，分析血清蛋白指纹峰，所述试剂盒依据上述几个特征蛋白峰，双盲测试含变异的转甲状腺素蛋白、载脂蛋白A、β2微球蛋白、转铁蛋白、补体C3a、纤维蛋白肽A、载脂蛋白C亚基样品的敏感性90％，特异性90％。故等摩尔抗体组(转甲状腺素蛋白、载脂蛋白A、β2微球蛋白、转铁蛋白、补体C3a、纤维蛋白肽A、载脂蛋白C亚基的抗体)标记的磁珠比等重量或等量(如等μg)抗体组(转甲状腺素蛋白、载脂蛋白A、β2微球蛋白、转铁蛋白、补体C3a、纤维蛋白肽A、载脂蛋白C亚基的抗体)标记的磁珠更好。表二、所述的检测试剂盒对常见肿瘤早期转移的判断为：标志物峰值(m/z±Da)信噪比转甲状腺素蛋白13761±1＞10载脂蛋白A28078±3＞10β2微球蛋白11731±1＞10转铁蛋白75000±7＞10补体C3a8938±1＞10纤维蛋白肽A1465±1＞10载脂蛋白C亚基6600±1＞10注：上述100例含变异的转甲状腺素蛋白、载脂蛋白A、β2微球蛋白、转铁蛋白、补体C3a、纤维蛋白肽A、载脂蛋白C亚基升高的不同肿瘤类型、早期转移的肿瘤患者的血清及尿液，信噪比＞10代表阳性。所述试剂盒依据上述几个特征蛋白峰，双盲测试含变异的、修饰的转甲状腺素蛋白、载脂蛋白A、β2微球蛋白、转铁蛋白、补体C3a、纤维蛋白肽A、载脂蛋白C亚基(从上述分子量可以确认为变异的、修饰的转甲状腺素蛋白、载脂蛋白A、β2微球蛋白、转铁蛋白、补体C3a、或纤维蛋白肽A、载脂蛋白C)样品的敏感性100％，特异性100％。灵敏度检测150fmol的牛G型免疫球蛋白(IgG)，信噪比大于1000∶1。特异性表三、检测100份阴性血清样本，100％样本结果符合下表要求：标志物峰值(m/z±Da)信噪比转甲状腺素蛋白13761±1＜5载脂蛋白A28078±3＜5β2微球蛋白11731±1＜5转铁蛋白75000±7＜5补体C3a8938±1＜5纤维蛋白肽A1465±1＜5载脂蛋白C亚基6600±1＜5利用C8及C18疏水基质、WCX基质、或IMAC磁珠(或芯片)及用血液(血清、血浆)、尿液样本的实验结果是一致的。利用本发明的分析方法，通过临床双盲对比分析(371例正常人群、367例无转移肿瘤患者、302例早期肿瘤转移患者)，吻合率在91-95％，故上述蛋白质标志物的变异、修饰是常见肿瘤早期转移的标志物，可应用于实时、痕量、修饰性标志物的免疫质谱检测。在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式应当同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。当前第1页1 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