免疫荧光是用于荧光显微镜的光学显微镜技术，主要用于微生物样品。该技术利用抗体对其抗原的特异性将荧光染料靶向细胞内的特定生物分子靶标，因此允许靶分子在样品中的分布可视化。免疫荧光是免疫染色的广泛使用的实例，并且是利用荧光团来显现抗体位置的免疫组织化学的具体实例。Nielsen等人描述了一种荧光偏振免疫测定法(Methods22,71-76,2000)，并且该测定法可以用于快速和精确检测抗体或抗原。所述测定法基于在溶液中小分子旋转比较大分子旋转更快的原理，并且旋转速率可以通过荧光偏振确定。当样品中的抗体与用荧光探针标记的抗体的特异性抗原一起孵育时，样品中抗体-抗原复合物的存在可以通过荧光偏振来检测。这种技术的难题在于，为了检测给定的抗体，需要针对给定的抗体的特异性抗原，这使得所述测定法对于许多公司来说是昂贵的。该技术的另一个难题是其不适用于定量检测样品中的抗体。MinChen等人(Foodadditives&Contaminants:partA,vol.31(12),pp.1959-1967(2014))描述了一种方法试剂盒和缀合物，其用于通过在反应容器中使牛奶与双特异性单链抗体和FITC标记的靶分子反应并将竞争反应物与靶分子的量相关联来确定牛奶中抗生素丰度。GiridharaGokulrangan等人(AnalyticalChemistry,vol.77(1),pp.17-32(2011))描述了一种通过荧光偏振确定靶抗体丰度的方法，其中靶抗体结合探针是与荧光团连接的适配体。本发明的目的是克服至少一个上述问题。技术实现要素：本发明基于如下发现：样品中靶分子的存在或丰度可以使用荧光偏振和包含与单域抗体缀合的荧光染料的示踪剂来确定，其中单域抗体的小尺寸允许使用荧光偏振格式高度灵敏地量化样品中的靶分子。在第一方面，本发明提供了用于确定液体样品中靶分子的存在或丰度的方法，其包括以下步骤：-在反应室中将液体样品与包含与荧光探针缀合的单域抗体的靶分子结合探针一起孵育以提供反应混合物，其中单链抗体能够选择性地结合靶分子；-测定反应室中的反应混合物的荧光偏振以检测激发光和发射光之间的偏振变化；和-将偏振变化与样品中靶分子的存在或丰度相关联。在一个实施例中，靶分子是或包含聚氨基酸，比如蛋白质、多肽或肽。在一个实施例中，靶蛋白是靶抗体。在一个实施例中，单链抗体能够选择性结合靶抗体的恒定区。在一个实施例中，单链抗体能够选择性结合靶抗体的可变区。在一个实施例中，单链抗体能够选择性结合靶抗体的互补位。在一个实施例中，单链抗体能够选择性结合抗体的特定同种型(specificisotype)(即能够结合样品中的所有IgE抗体)。在一个实施例中，靶抗体是IgE抗体。在一个实施例中，靶抗体是IgG抗体。在一个实施例中，靶抗体是IgM抗体。在一个实施例中，靶抗体是IgA抗体。在一个实施例中，靶抗体是IgA抗体。在一个实施例中，靶抗体是IgY抗体。在一个实施例中，靶抗体是IgW抗体。在一个实施例中，靶分子是抗原。在一个实施例中，抗原是微生物特异性抗原。在一个实施例中，抗原是疾病特异性抗原。在一个实施例中，抗原是细胞特异性抗原。在一个实施例中，抗原是表型特异性抗原。在一个实施例中，靶分子是或包含靶寡糖。在一个实施例中，靶分子是或包含靶核酸。在一个实施例中，靶分子由细胞表达。在一个实施例中，反应混合物包含细胞培养物，其中细胞培养物表达靶分子。在一个实施例中，细胞培养物包含产生单克隆抗体的细胞，并且其中单克隆抗体是靶分子。在一个实施例中，细胞是真核或原核生产细胞(producercell)。优选地，反应室是多层板的孔。优选地，荧光探针是长寿命荧光探针。在一个实施例中，所述方法是用于确定液体样品中靶分子丰度的快速方法。在一个实施例中，所述方法是用于确定液体样品中靶分子丰度的高通量方法。在一个实施例中，多个细胞培养物样品包含一组克隆生产细胞。因此，本发明还涉及快速、高通量的测定克隆生产细胞组中抗体滴度的方法，其中抗体是靶分子。通常，方法使用荧光偏振分析仪，该荧光偏振分析仪能够同时在微量滴定板的多个孔上进行荧光偏振测定。本发明还提供单域抗体和荧光探针的缀合物。在一个实施例中，荧光探针是长寿命荧光探针。在一个实施例中，荧光探针是FITC。本发明还提供了通常适用于实施本发明方法的试剂盒，其包含(a)包含缀合至荧光探针的单域抗体的靶分子结合探针和(b)荧光偏振分析仪。在一个实施例中，探针包含具有至少3ns的荧光寿命的荧光探针。在一个实施例中，荧光偏振分析器配置为同时检测微量滴定板的多个孔中的荧光偏振的变化。附图简述参照附图，从以下仅作为示例给出的实施例的描述中将更能清楚地理解本发明，其中：图1是显示检测IgE的纳米抗体结合的图，其中将0.005mg/L的标记的纳米抗体的PBS/BSA溶液加入到人IgE中。测量每个浓度的偏振信号。图2：显示无IgG的纳米抗体结合的检测的图，其中将0.005mg/L的标记的纳米抗体的PBS/BSA溶液加入到人IgG中。测量每个浓度的偏振信号。具体实施方式“靶分子结合探针”是指单域抗体和荧光探针的缀合物，其中在缀合状态下，单域抗体能够选择性结合靶分子，并且其中荧光探针能够在激发后再发光。缀合可以通过使用例如可切割或不可切割的稳定接头的共价键来实现。将抗体(包括单域抗体和单链抗体)联结到分开的实体的具体方法对于本领域技术人员是公知的，并且描述于例如：Chakravartyetal.，Theranostics2014；4(4)：386-398；ADCReview/JournalofAntibody-drugConjugates：StableLinker(technologies)，May23，2013；MethodsMolBiol.2013；1045：1-27.doi：10.1007/978-1-62703-541-5_1；″Cellkillingbyantibody-drugconjugates″.Cancerletters255(2)：232-40.doi：10.1016/j.canlet.2007.04.010.PMID17553616；″NewnethodofpeptidecleavagebasedonEdmandegradation″.Moleculardiversity17(3)：605-11.doi：10.1007/s11030-013-9453-y.PMC3713267.PMID23690169；″Synthesisofsite-specificantibody-drugconjugatesusingunnaturalaminoacids″.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences109(40)：16101-6.doi：10.1073/pnas.1211023109.PMC3479532.PMID22988081；“Currentmethodsforthesynthesisofhomogenousantibody-drugconjugates”BiotechnologyAdvances(33)Issue6，Part1(seeespeciallyTable1)；Badescuetal.，Bioconj.Chem.25(2014)，1124-1136；Dennleretal.Bioconj.Chem.25(2014)，569-578；Drakeetal.Bioconj.Chem.25(2014)，1131-1341；Hoferetal.Biochemistry，48(2009)，12047-12057；Senteretal.Nat.Biotechnol.30(2012)631-637；Shumacheretal.Org.Biomol.Chem.12(2104)，7261-7269；Stropetal.Chem.Biol.20(2013)，161-167；Zhouetal.MAbs6(2014)，1190-1200；andZimmermanetal.25(2014)，351-361.单域抗体和荧光染料的位点特异性缀合物可以商业获得，例如来自乌得勒支大学纳米抗体学院(UniversityofUtrechtNanobodyFacility)(http://www.uu.nl/en/research/cell-biology/facilities/utrecht-nanobody-facility-unf)。在一个实施例中，单域抗体经工程化以包含用于将荧光探针连接至单域抗体的连接部分。在一个实施例中，单域抗体经基因工程化以包含连接部分。在国际专利申请号：PCT/NL97/00653中描述了经工程化以包含用于尤其是染料的连接部分的抗体的合成。在本说明书中，术语“单域抗体”或“sdAb”或“纳米抗体”是由单个单体可变抗体结构域组成的抗体片段，其能够选择性结合特异性抗原，例如特异性蛋白质、特异性IgG分子或IgE分子(Harmsenetal.,Appl.Micrbiol.Biotechnol.77(1)13-22)。它们通常具有小于18kDa的分子量。在一个实施例中，单域抗体具有约10-15kDa的分子量。在一个实施例中，单域抗体具有约12-15kDa的分子量。它们通常从重链抗体或常规抗体获得。从重链抗体获得单域抗体涉及用期望的抗原免疫某些动物，分离编码重链抗体的mRNA，和通过逆转录和PCR产生单域抗体的基因文库(Ghahroudietal.,FEBSLetters,414(3)521-526)。在某些情况下，不需要初始免疫步骤，导致产生单域抗体的原始基因文库(Saerensetal,CurrentOpinioninPharmacology,8(5)600-608)。单链抗体可以从在涉及从免疫的或原始的供体的基因文库产生的过程中的常规抗体获得，比如人或鼠IgG抗体(Holtetal,TrendsinBiotechnology21(11)484-490，和Borrebaecketal,NatureBiotechnology20(12))。在一个实施例中，常规抗体是人抗体。在一个实施例中，常规抗体是人源化抗体。单链抗体可以从商业来源获得，例如从CreativeBiolabs(www.creative-biolabs.com)和PrecisionAntibody(www.precisionantibody.com)获得。在一个实施例中，单域抗体能够选择性结合靶抗体。在一个实施例中，单域抗体能够选择性结合特定抗体同种型(例如结合样品中所有IgE抗体)。在一个实施例中，单域抗体能够选择性结合特异性抗体(例如，通过特异性结合抗体的互补位)。在一个实施例中，单域抗体对生物药物生产细胞的表达产物是特异性的。这种表达产物的实例包括单克隆抗体、融合蛋白。生物药物生产细胞的实例包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞和幼仓鼠肾(BHK)细胞)。在一个实施例中，单链抗体能够选择性结合靶抗体的恒定区。在一个实施例中，单链抗体能够选择性结合靶抗体的可变区(例如，高变区)。在一个实施例中，单链抗体能够选择性结合靶抗体的互补位。在一个实施例中，单链抗体能够选择性结合特定的抗体同种型(即，能够结合例如样品中的所有IgE抗体)。在一个实施例中，靶抗体是IgE抗体。在一个实施例中，靶抗体是IgG抗体。在一个实施例中，靶抗体是IgM抗体。在一个实施例中，靶抗体是IgD抗体。在一个实施例中，靶抗体是IgA抗体。在一个实施例中，靶抗体是IgY抗体。在一个实施例中，靶抗体是IgW抗体。在本说明书中，术语“抗体”和“靶抗体”应理解为是指免疫球蛋白，例如单克隆或多克隆形式的IgG、IgE、IgA、IgD、IgM、IgY或IgW免疫球蛋白或其片段，人源化或非人源化的。在本说明书中，术语“测定在反应室中的样品的荧光偏振”应理解为是指用(垂直或水平)平面偏振光以与荧光探针的激发波长相对应的波长激发样品，并且检测由荧光探针在垂直和水平平面内以合适的发射波长发射的光强度。发射强度从激发平面(即垂直)移动到相反平面(即水平)的程度-即激发光和发射光之间的偏振变化-是荧光探针旋转程度的函数。当靶分子结合探针与靶分子结合时，复合物将比靶分子结合探针旋转得更慢，导致可以量化的发射光的偏振增加。术语“使偏振的变化与靶分子的丰度相关联”应理解为是指基于由荧光探针发射的光的偏振变化的样品中的靶分子的丰度。用于计算靶分子丰度的方法包括从已知浓度的靶分子的标准曲线中推断丰度或通过计算解离常数和必需参数，并从第一原则推断浓度。在本说明书中，术语“快速”应该理解为是指所述方法可以在12小时或更少，优选少于10、8、6、4、2或1小时进行。在本说明书中，术语“高通量”应理解为是指可以同时测定大量样品，例如至少20、50、90、120个，即20-500个的方法。如本文所用，术语“抗体滴度”是指在给定时间点存在于样品中的抗体(通常是重组抗体，理想地是重组单克隆抗体)的量。通常，样品是细胞培养样品。优选地，样品是来自细胞培养物样品的上清液。滴度可以绝对或相对量化。通常，滴度称为每培养物体积的产物重量-克每升(g/L)是常用度量单位。如本文所使用的术语“样品”应理解为是指液体样品，例如细胞培养样品或源自细胞培养样品的上清液。优选地，细胞是生产细胞(即经基因修饰以产生重组蛋白的细胞)，例如原核生产细胞(即大肠杆菌)或真核生产细胞(即CHO细胞)。原核生产细胞和真核生产细胞的实例都是本领域技术人员已知的。在本说明书中，术语“荧光探针”或“荧光染料”或“荧光团”应理解为是指可吸收特定波长的光并发射不同(通常更长)波长的光的荧光化学物质。荧光探针的实例对于本领域技术人员是已知的，并且包括荧光蛋白比如GFP、YFP和RFP，以及包括四吡咯衍生物、芘衍生物、氧杂蒽衍生物和花青衍生物的非蛋白质有机荧光团。以下提供了荧光探针的具体实例。在本说明书中，术语“长寿命荧光探针”应理解为是指具有至少4、5、10、12、14、16、18或20纳秒的荧光寿命的荧光探针。优选地，荧光探针具有4-100ns、4-50ns、4-40ns、4-30ns或4-25ns，通常10-100ns、10-50ns、10-40ns、10-30ns或5-25ns，理想地15-100ns、15-50ns、15-40ns、15-30ns或15-25ns的荧光寿命。荧光探针的实例描述于www.Fluorophores.tugraz.at/substance和下表中提供的特定样品，包括长寿命荧光团。术语“生产细胞”是指用于产生特定的期望蛋白质的细胞。通常，细胞经基因修饰以包括编码通常在特定促进剂控制下的所需蛋白质的转基因的一个或多个副本。因此，特定蛋白通常是重组蛋白。生产细胞在本领域是公知的，并且包括例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或幼仓鼠肾(BHK)细胞。理想情况下，生产细胞是CHO细胞。通常，生产细胞是单克隆抗体生产细胞。在本说明书中，术语“微量滴定板”是指具有多个孔的板，例如至少10、15、20、30、40、50、60、70、80、90或100个孔。在一个实施例中，所述板可以是固体、非柔性的板并且可选地可以作为卷柔性材料来提供。试验纳米抗体的标记抗人IgE纳米抗体购自美国的CreativeBiolabs。在PBS中使用FITC(Sigma，UK)以染料与蛋白质8:1的摩尔比率在室温下孵育1小时的时间将其N端标记。使用Sephedex脱盐柱(GE，UK)将其纯化，并使用3KDa截留旋转柱((cutoffspincolum))(Amicon，UK)进行浓缩。抗人IgG纳米抗体购自美国的CreativeBiolabs。在PBS中使用FITC(Sigma，UK)以染料与蛋白质8:1的摩尔比率在室温下孵育1小时的时间将其N端标记。使用Sephedex脱盐柱(GE，UK)将其纯化，并使用3KDa截留旋转柱(Amicon，UK)进行浓缩。抗人IgD纳米抗体购自美国的CreativeBiolabs。在PBS中使用FITC(Sigma，UK)以染料与蛋白质8:1的摩尔比率在室温下孵育1小时的时间将其N端标记。使用Sephedex脱盐柱(GE，UK)将其纯化，并使用3KDa截留旋转柱(Amicon，UK)进行浓缩。抗人IgA纳米抗体购自美国的CreativeBiolabs。在PBS中使用FITC(Sigma，UK)以染料与蛋白质8:1的摩尔比率在室温下孵育1小时的时间将其N端标记。使用Sephedex脱盐柱(GE，UK)将其纯化，并使用3KDa截留旋转柱(Amicon，UK)进行浓缩。抗人IgM纳米抗体购自美国的CreativeBiolabs。在PBS中使用FITC(Sigma，UK)以染料与蛋白质8：1的摩尔比率在室温下孵育1小时的时间将其N端标记。使用Sephedex脱盐柱(GE，UK)将其纯化，并使用3KDa截留旋转柱(Amicon，UK)进行浓缩。抗人IgY纳米抗体购自美国的CreativeBiolabs。在PBS中使用FITC(Sigma，UK)以染料与蛋白质8：1的摩尔比率在室温下孵育1小时的时间将其N端标记。使用Sephedex脱盐柱(GE，UK)将其纯化，并使用3KDa截留旋转柱(Amicon，UK)进行浓缩。抗人IgW纳米抗体购自美国的CreativeBiolabs。在PBS中使用FITC(Sigma，UK)以染料与蛋白质8：1的摩尔比率在室温下孵育1小时的时间将其N端标记。使用Sephedex脱盐柱(GE，UK)将其纯化，并使用3KDa截留旋转柱(Amicon，UK)进行浓缩。证明荧光偏振来定量溶液中的IgE。为了证明概念，将标记的纳米抗体在含有1mg/mlBSA的PBS中稀释至浓度为0.005mg/ml以防止非特异性结合。在PBS中建立人IgE的标准曲线，其具有以下浓度：50mg/L、25mg/L、12.5mg/L、6.25mg/L、3.125mg/L、0mg/L。对于所述测定，将60ul的FITC纳米抗体加入到60ul稀释的IgE中，并且在读取荧光偏振之前将其在黑暗中孵育30分钟。从图1可以明显看出，这种方法可以用于根据偏振信号的变化来量化溶液中的IgE。证明纳米抗体亚型特异性为了证明特异性，使用人IgG重复上述步骤。将抗IgE纳米抗体-FITC在含有1mg/mlBSA的PBS中稀释至浓度为0.005mg/ml以防止非特异性结合。在PBS中建立人IgG的标准曲线，其具有以下浓度：50mg/L、25mg/L、12.5mg/L、6.25mg/L、3.125mg/L、0mg/L。将60ulFITC纳米抗体加入到60ul稀释的IgG中，并在读取荧光偏振之前将其在黑暗中孵育30分钟。从图2可以明显看出，与免疫球蛋白的另一种同种型没有交叉反应性，因此证明了对IgE的特异性。证明荧光偏振来定量溶液中的IgA、IgD、IgG、IgM、IgY和IgW。为了概念证明，将标记的抗A、D、G、M、Y和W纳米抗体(分别)在含有1mg/mlBSA的PBS中稀释至浓度为0.005mg/ml以防止非特异性结合。在PBS中建立人IgA、IgD、IgG、IgM、IgY和IgW中的每一种的标准曲线，其具有以下浓度：50mg/L、25mg/L、12.5mg/L、6.25mg/L、3.125mg/L、0mg/L。对于所述测定，将60ul的FITC抗A、D、G、M、Y和W纳米抗体(分别地)加入到每一种60ul稀释的IgA、IgD、IgG、IgM、IgY和IgW中，并在读取荧光偏振之前将它们在黑暗中孵育30分钟。这种方法可用于根据偏振信号的变化来量化溶液中的IgA、IgD、IgG、IgM、IgY和IgW。证明纳米抗体亚型特异性为了证明特异性，使用人IgE重复上述步骤。分别将抗IgA、抗IgD、抗IgG、抗IgM、抗IgY和抗IgW纳米抗体-FITC在含有1mg/mlBSA的PBS中稀释至浓度为0.005mg/ml以防止非特异性结合。在PBS中建立人IgE的标准曲线，其具有以下浓度：50mg/L、25mg/L、12.5mg/L、6.25mg/L、3.125mg/L、0mg/L。将60ul的每种FITC纳米抗体分别加入到60ul稀释的IgE中，并在读取荧光偏振之前将它们在黑暗中孵育30分钟。这将显示与免疫球蛋白的另一种同种型没有交叉反应性，因此证明对每种IgA、IgD、IgG、IgM、IgY和IgW的特异性。本发明不限于前面描述的实施例，在不脱离本发明的精神的情况下，其结构和细节可以变化。当前第1页1 2 3 当前第1页1 2 3