基于微流控技术的大规模活生物体筛选系统的制作方法

本发明涉及生物医学技术领域，具体地说是涉及一种基于微流控技术的大规模活生物体筛选系统。

背景技术：

微小活生物体如斑马鱼等鉴于其能够在活体条件下被高通量筛选，成为时下生物医学研究中重要的动物实验模型，而微流控技术由于具有和微小活生物体匹配的尺寸，其可控流体能够使微小活生物体在微流控芯片上无机械损伤地捕获和放置，恰恰可以满足高通量筛选的需求，完成多种疾病的模型建立，不需要转移、可直接接受药物刺激进行药物筛选和代谢物分析等工作。

目前有多种微流控芯片能够提供多种功能，可实现更好过程控制、快速分析与反应，但是现有的基于微流控技术的活生物体筛选系统仍然在自动化、大规模、低成本方面存在巨大的挑战。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种基于微流控技术的大规模活生物体筛选系统，可以实现清晰的大规模、自动化图像采集。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：

一种基于微流控技术的大规模活生物体筛选系统，包括：芯片集成容器，所述芯片集成容器按照预定位置固定多个微流控芯片；可调式三坐标轴架；安装在所述可调式三坐标轴架上的显微镜和CCD摄像头；计算机根据预置的时间点按照所述预定位置控制所述可调式三坐标轴架位移，从而控制所述显微镜和所述CCD摄像头的位移，使得所述显微镜和所述CCD摄像头的位移范围覆盖所有所述微流控芯片，且所述计算机还通过调整z轴位移实现聚焦。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

多个微流控芯片按照预定位置固定在芯片集成容器内，显微镜和CCD摄像头安装在可调式三坐标轴架上，计算机根据预置的时间点按照所述预定位置控制可调式三坐标轴架位移，且通过调整z轴位移实现聚焦，使得显微镜和CCD摄像头可以按照时间点顺序扫描所有微流控芯片，实现清晰的大规模、自动化图像采集。

在生物医学研究中，不仅仅是需要生物体胚胎作为动物实验模型，孵化后的生物体也是模型对象，为了方便孵化后的生物体图像捕捉且获得一致的图像，需要将孵化后的生物体固定在特定的姿势，在传统方法中需要冗长和多步手动干预，在本发明提供的基于微流控技术的大规模活生物体筛选系统中，优选的，包括一种自动的、具有姿势控制功能的微流控芯片，具体如下：

所述微流控芯片包括孵化后的生物体的容置孔，所述容置孔由两层构成，上层尺寸较大于孵化后的生物体尺寸，用于维持孵化后的生物体的生存，下层尺寸按照在规定姿势下的孵化后的生物体尺寸设计，当提高所述容置孔的液体抽取量，降低所述容置孔内的液面高度，孵化后的生物体顺着流体从所述容置孔的上层降落到所述容置孔的下层，且按照规定姿势被固定，当恢复所述容置孔内的液面高度，孵化后的生物体顺着流体从所述容置孔的下层回到所述容置孔的上层，确保生物体的存活力。

进一步的，所述容置孔设计为矩形，与同等面积的圆形容置孔相比，矩形容置孔可以增加孵化的生物体在微流控芯片中的活动空间和存活率。

进一步的，当所述孵化后的生物体为斑马幼鱼时，所述容置孔为矩形，所述下层尺寸可以设计为0.2mm×4mm，保证斑马幼鱼在容置孔下层固定在能观察到两眼的竖立姿态，在观察心脏、脑血管和神经系统的发育具有极大优势。

优选的，本发明提供的基于微流控技术的大规模活生物体筛选系统中的微流控芯片还可以实现化学试剂的加载和精确分配，以不同剂量递送不同化学试剂，具体为：

所述微流控芯片还包括微流控浓度梯度发生器，所述微流控浓度梯度发生器由上下两层组成，所述微流控浓度梯度发生器的上层将所述微流控浓度梯度发生器的树形结构的下层与容置孔相连。

根据指定药物测定中所需药物浓度的动态范围，所述微流控浓度梯度发生器的下层可以是两进口微流控浓度梯度发生器，也可以是三进口微流控浓度梯度发生器。

结合前述的微流控芯片的功能，优选的，本发明提供的基于微流控技术的大规模活生物体筛选系统包括一种四层结构的微流控芯片，能够实现一个或多个生物体胚胎的自动装载，并将孵化的生物体自动引入到容置孔中，控制孵化后生物体的姿势，以不同剂量递送不同化学试剂，具体为：

所述微流控芯片由四层组成，包括：微流控浓度梯度发生器层；试剂进入轨道层；容置孔和试剂排出轨道层；出口与回收注射器连接的覆盖层，所述四层独立排列并紧密粘合，用于胚胎装载的单层芯片可拆卸的放置在所述微流控芯片的上端，所述单层芯片的微型孔的尺寸设计为可容纳单个胚胎的体积，所述单层芯片被加载装有胚胎的溶液后，通过降低液面高度驱动胚胎朝向微型孔流动，使得每个微型孔填充单个胚胎，当胚胎孵化，进一步降低液面高度，引导孵化后的生物体进入所述微流控芯片的容置孔，拆卸下所述单层芯片以去除胚胎的外壳。

进一步的，在本发明提供的基于微流控技术的大规模活生物体筛选系统中，还包括管道盒，所述管道盒与安装在所述芯片集成容器中的微流控芯片对准，实验试剂可以通过管道盒在微流控芯片和注射泵中快速传递。

进一步的，本发明提供的基于微流控技术的大规模活生物体筛选系统中，包括温度控制器，所述温度控制器安装在所述芯片集成容器的下方，用于提供从室温到37摄氏度的温度以满足不同生物体培养规格。

再进一步的，本发明提供的基于微流控技术的大规模活生物体筛选系统包括气体入口，所述气体入口可提供某些培养条件所需的特定气体。

再进一步的，本发明提供的基于微流控技术的大规模活生物体筛选系统包括激发光源和多波段光学滤镜组成的装置，可以进行荧光显微图片的采集。

再进一步的，由于聚甲基丙烯酸甲酯为具有极佳透明度并几乎没有化学吸收的热塑性材料，本发明提供的基于微流控技术的大规模活生物体筛选系统中的微流控芯片采用聚甲基丙烯酸甲酯制作。

再进一步的，本发明提供的基于微流控技术的大规模活生物体筛选系统中的微流控芯片中的容置孔由激光雕刻制备。

附图说明

图1是本发明实施例中基于微流控技术的大规模活生物体筛选系统的结构示意图；

图2（a）（b）（c）（d）（e）（f）是本发明实施例中基于微流控技术的大规模活生物体筛选系统的四层微流控芯片的结构图。

具体实施方式

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。

参照图1，本发明实施例提供了一种基于微流控技术的大规模活生物体筛选系统（为了方便描述，以下简称筛选系统）10，筛选系统10为箱体外形，它的体积为30cm×40cm×40cm。筛选系统10的结构具体为：

包括芯片集成容器101，该芯片集成容器101按照预定位置固定多个微流控芯片102，芯片集成器的面积为200mm×300 mm，可容纳至少40块面积为25 mm×60 mm的微流控芯片102；

包括可调式三坐标轴架103，由计算机控制；

包括安装在该可调式三坐标轴架103上的单目光学显微镜104（200-300倍放大率）和180万像素CCD摄像头105；计算机根据预置的时间点按照所有微流控芯片102的预定位置控制可调式三坐标轴架103位移，从而控制单目光学显微镜104和CCD摄像头105的位移，使得单目光学显微镜104和CCD摄像头105的位移范围覆盖所有微流控芯片102，且该计算机还通过调整z轴位移实现聚焦；

还包括管道盒106，管道盒106与安装在芯片集成容器101中的微流控芯片102对准，实验试剂可以通过管道盒106在微流控芯片102和注射泵107中快速传递。

还包括温度控制器，温度控制器安装在芯片集成容器101的下方，用于提供从室温到37摄氏度的温度以满足不同生物体培养规格。

还包括气体入口108，气体入口108可提供某些培养条件所需的特定气体。

还包括激发光源109和多波段光学滤镜110组成的装置，可以进行荧光显微图片的采集。

筛选系统10的箱体外壳上部还有气泡水平仪111，下部还有水平调节脚座112，可以保证箱体水平。

在本实施例中，筛选系统10所用的微流体芯片102可以为装载胚胎的微流体芯片，也可以用于动态生物体培养并对孵化后生物体实时成像的微流体芯片，当微流体芯片装载的是孵化后生物体时，微流体芯片102为四层结构（图2（a）），包括：微流控浓度梯度发生器层（图2（b）为两进口微流控浓度梯度发生器层、图2（c）为三进口微流控浓度梯度发生器层）；试剂进入轨道层（图2（d））；容置孔和试剂排出轨道层（图2（e）；出口与回收注射器连接的覆盖层（图2（f）），所述四层独立排列并紧密粘合。

用于胚胎装载的单层芯片可拆卸的放置在微流控芯片102的上端，单层芯片的微型孔的尺寸设计为可容纳单个胚胎的体积，单层芯片被加载装有胚胎的溶液后，通过降低液面高度驱动胚胎朝向微型孔流动，使得每个微型孔填充单个胚胎，当胚胎孵化，进一步降低液面高度，引导孵化后的生物体进入微流体芯片102的容置孔，拆卸下所述单层芯片以去除胚胎的外壳。

微流体芯片102的容置孔用于容置孵化后的生物体，容置孔为矩形，有48个，由激光雕刻制备，出于自动的、具有姿势控制功能的微流控芯片的需要，容置孔由两层构成，上层尺寸较大于孵化后的生物体尺寸，用于维持孵化后的生物体的生存，下层尺寸按照在规定姿势下的孵化后的生物体尺寸设计，当提高容置孔的液体抽取量，降低容置孔内的液面高度，孵化后的生物体顺着流体从容置孔的上层降落到容置孔的下层，且按照规定姿势被固定，当恢复容置孔内的液面高度，孵化后的生物体顺着流体从容置孔的下层回到容置孔的上层。

根据孵化出的生物体尺寸设计的容置孔可以实现对其姿势的控制，通过调节液面高度可以将孵化出的生物体以特定的姿势转移到限制了几何结构的容置孔中。

在微流控芯片102的微流控浓度梯度发生器层包括微流控浓度梯度发生器，用于递送并精确分配化学试剂（如候选药物、核算、蛋白质/酶或标记抗体）。此微流控浓度梯度发生器由上下两层组成，微流控浓度梯度发生器的上层将前述容置孔与微流控浓度梯度发生器的树形结构的下层相连。下层结构可以由两进口微流控浓度梯度发生器改变为三进口微流控浓度梯度发生器。例如，在两进口微流控浓度梯度发生器中，能够达到的最低药物浓度为6.3%；而在三进口微流控浓度梯度发生器中，通过在中央的第三个进口可改变浓度梯度。例如将100%的药物、10%药物和缓冲液注入到微流控芯片中，可以获得最低1.3%的药物浓度。

微流控芯片102的出口分别与不同的注射器连接，可实现废液的回收。随后的HPLA或GC-MS分析可以比较进出口试剂的组分变化、不同药物浓度下生物体的代谢和吸收，可以提供额外的药物代谢信息。

本实施例提供的筛选系统10结合了计算机控制xyz轴位移以及实时图像采集程序：通过安装在位移轴上的单目光学显微镜和高分辨率的CCD摄像头，以及调整z轴聚焦可以实现较大面积（200mm×300mm）的图像采集。通过计算机控制，可实现按时间点顺序收集微流控芯片内每一个生物体的实验数据。

该筛选系统10满载后可以处理多达1920条独立的生物体暴露在240个梯度级，可以同时检查多达40种药物或药物组合。一旦所有微流控芯片固定在芯片集成容器内，剩余的实验操作均可以通过计算机自动化完成。此筛选系统10不仅可以节省拍摄每天独立生物体的时间，同时可以长时间连续监测生物体培养进程（持续两天），这对使用常规方法收集数据是个巨大的挑战。

下面将通过一个具体的应用试验实例，来说明前述发明实施例的筛选系统，在筛选系统的应用对象为斑马鱼。

阿霉素是已知的化疗药物。但临床用药的剂量受限于其较强的副作用。在本试验中，选用阿霉素为模型药物构建斑马鱼幼鱼心脏毒性模型，如心率过低或心脏出血。100mg/L的阿霉素溶液和含有0.2mM苯基硫脲（PTU）的E3斑马鱼培养基预先装入注射器中，并分别连接在两进口微流控浓度梯度发生器的微流体芯片上。注射泵能够在斑马鱼培育期间持续向两进口微流控浓度梯度发生器提供稳定液流。两进口微流控浓度梯度发生器的树状结构可以通过受控的层流和扩散混合产生6种不同的浓度梯度。

胚胎由野生型斑马鱼随机交配获得。收集受精卵并转移到具有E3培养基的培养皿中，并在28.5℃的培养箱中孵育。 24小时后，将0.2mM苯基硫脲（PTU）加入到E3培养基中以抑制斑马鱼的黑色素生成。斑马鱼通常在40 hpf（受精后的小时）孵化而出，按照前述实施例的描述，将48 hpf幼鱼转移到微流控芯片内的容置孔中。每个浓度梯度有8个单独的容置孔，这可以提供足够的重复样本以检验候选药物的剂量效应。所有容置孔由透气膜包裹，然后微流体芯片按照预定位置固定到筛选系统的芯片集成容器内。

随后初始化管道连接，连接检查完成后，启动进口和出口注射泵，使进出总流量达到平衡（入口为75ul / h，出口为25ul / h）。在计算机的控制下，根据预置的时间点控制可调式三坐标轴架位移，从而控制显微镜和CCD摄像头的位移至第一个容置孔，且计算机通过控制z轴位移使将摄像头和光学显微系统与第一个容置孔对焦，从而获得清晰的心跳视野。

一旦固定了第一个容置孔的焦距，后续的容置孔可以通过计算机自动定位及对焦，完成所有容置孔的图像采集。对于心脏毒性的测定，采用录制20秒的短视频记录幼鱼的心跳数。可在约10分钟内完成对总共48个芯片的数据采集。与传统方法在10分钟内只能采集2-3条幼鱼的数据有着明显的对比。Dox心脏毒性的测定在芯片平台上需要进行48小时药物处理，这与常规方法相同但可以大大缩短采集数据的时间间隔。除了可进行大规模检测之外，筛选系统还能在不同时间点对同一条幼鱼进行数据采集，这对于常规方法来说几乎是不可能的。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。