二次谐波成像结合荧光成像在定位物质透皮吸收中的应用的制作方法

本发明属于生物医学领域，涉及二次谐波成像结合荧光成像在定位物质透皮吸收中的应用。

背景技术：

物质透皮途径主要有三条：角质层、毛囊及汗管。其中，后两条通路经常被称为“旁路”，因为皮肤附属器与整个皮肤表面积相比，仅占1％以下，故在大多数情况下不成为主要吸收途径，但大分子物质及离子型物质难以通过富含类脂的角质层，可能经由这些途径进入皮肤。

对于透皮吸收物质的探测，主要有体内方法和体外方法，体内方法包括化学测定(检查物质吸收入血的量)、组织检察(检察用药后组织结构的变化)、同位素示踪(用同位素标定药物，观察其透皮后的吸收分布)；体外方法包括各种静态或流通的扩散小室，观察药物能否透过皮片。但无论是体内还是体外的方法，都不能动态观察待测物质吸收的动态过程、进入皮肤的途径、在皮肤内分布的部位及范围，而这些指标对于美容护肤类产品的品质评估至关重要。化妆品中的透皮吸收与药物透过皮肤进入体循环具有本质的不同，主要区别在于不需要透过皮肤进入体循环，化妆品中的功能性成分作用于皮肤表面或进入表皮或真皮并在该部位聚集和发挥作用。例如，美白产品中的美白剂需要透过角质层作用于表皮中的基底层，阻断黑色素的产生。体外补充胶原蛋白使其进入真皮层补充体内的胶原纤维，恢复皮肤的弹性。因此明确美容护肤类产品作用于皮肤的部位有助于分析其功效。即使在医药研究领域，已有的组织定位观察方法如病理切片法，虽可以明确样品的病理信息，但无法在切片上标示大分子药物的位置信息。透皮吸收仪作为传统的研究透吸收作用的仪器，不能动态观察药物进入皮肤的位置与滞留情况。因此，需要一种简单、直观、不影响待检测样品性状的检测方法。

二次谐波(second harmonic generation，SHG)是光与介质的相互作用产生的二次非线性光学过程，其信号强度与激发光强度平方成线性关系。皮肤组织分为表皮、真皮、皮下组织三部分，是人体表面积最大的器官，由蛋白质、核酸、糖、辅酶等成分组成，主要承担着保护体内器官和组织、排汗、感觉冷热和压力等功能^[6]。真皮层来源于中胚层，由纤维、基质、细胞构成，其中I型胶原纤维为真皮的主要构成成分，约占95％，集合成束状。在乳头层纤维束较细，排列紧密，走行方向不一，不互相交织。它具有强烈的二阶非线性极化率和结构非中心对称性，是生物组织中能够产生SHG信号的重要物质。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种全新的检测待测物质透皮吸收情况的方法。

本发明所提供的检测待测物质透皮吸收情况的方法，是以皮肤真皮层中胶原所产生的SHG信号作为皮肤组织的结构内参，观察被荧光标记的待测物质经皮吸收的过程和/或在皮肤组织中的聚集部位。

具体而言，所述方法可包括如下步骤：

(1)将所述待测物质进行荧光标记；

(2)将经步骤(1)荧光标记后的所述待测物质涂抹于皮肤外表面，然后对涂抹了所述待测物质的皮肤组织采集SHG信号和荧光信号；

(3)通过观察步骤(2)所采集的SHG信号和荧光信号的位置关系和/或变化过程，来确定所述待测物质经皮吸收的过程和/或在皮肤组织中的聚集部位；其中，所述SHG信号代表皮肤真皮层中的胶原；所述荧光信号代表所述待测物质。

在本发明的一个实施例中，步骤(2)中，采集所述SHG信号和所述荧光信号时所采用的仪器具体为双光子扫描共聚焦显微镜。

进一步，采用所述双光子扫描共聚焦显微镜采集所述SHG信号和所述荧光信号时，SHG激发波长具体为950nm，双光子荧光激发波长具体为750nm。

更加具体的，采用所述双光子扫描共聚焦显微镜采集所述SHG信号和所述荧光信号时，激发光由物镜聚焦到涂抹了所述待测物质的皮肤组织上，产生的背向SHG信号与荧光信号由同一个放大倍数为25倍、数值孔径为1.05的水浸显微镜物镜来收集；双光子荧光通道使用高通滤波片，波长范围420-460nm；在SHG通道使用窄带滤波片，波长范围465-485nm；所述皮肤组织做全层Z轴扫描，步进5μm，图像采集速度10μm/pixel。完成图像采集后，还包括将所得图像进行iMaris 7.4.2图像渲染处理的步骤，红色为SHG成像，蓝色为荧光成像。

在所述方法中，所述待测物质可为美容产品或者药品。

在本发明的一个实施例中，所述待测物质具体为胶原蛋白。所采用的荧光分子为iFluor^TM350。

另外，二次谐波成像结合荧光成像的方法在检测待测物质透皮吸收情况中的应用也属于本发明的保护范围。如下组合产品在制备检测待测物质透皮吸收情况的产品中的应用也属于本发明的保护范围：采集SHG信号的仪器和/或试剂，采集荧光信号的仪器和/或试剂，用于荧光标记的荧光物质。

其中，所述待测物质可为美容产品或者药品。在本发明的一个实施例中，所述待测物质具体为胶原蛋白。所采用的荧光分子为iFluor^TM350。

在本发明中，所述方法为非疾病诊断治疗的方法；所述应用为非疾病诊断治疗的应用。

皮肤组织中具有非常丰富的自发荧光，如表皮中的角蛋白，上皮细胞中的NADH，上皮组织中的胶原蛋白和弹性蛋白等。这些荧光信号虽可被双光子显微镜所收集但易与样品标记的荧光信号相混淆不适合作为内参进行样品的皮肤吸收定位。SHG信号是生物组织原发性信号，因为没有能量吸收，从而消除了光毒性、光损伤和光漂白性，可以长时间的追踪活细胞组织的生理活动过程。SHG信号具有高度的方向性，能反映出样品内部的细微结构，其光强度与激发光强度平方成正比，光谱宽度在飞秒激光下理论上只有10nm，利用窄波带通滤光片可以有效排除荧光的干扰。

实验证明，本发明利用真皮层中胶原的SHG信号做为皮肤组织的结构内参，观察荧光标记的胶原蛋白经皮吸收的过程及聚集部位，荧光信号与SHG信号没有叠加，表征清晰，直观准确地反映胶原类物质透皮吸收的途径及作用部位，操作简便，快速准确。本发明为透皮吸收的药品及美容产品的活性检测提供新的检测方法。

附图说明

图1为SDS-PAGE电泳条带。其中，A为明场；B为365nm紫外光下观察结果。泳道1为Marker，泳道2、3为未标记荧光的R-hc，泳道4、5为iF-R-hc。

图2为小鼠皮肤HE染色结果。

图3为iMaris渲染图。其中，A为大鼠皮肤真皮层胶原SHG图像(激发波长950nm)；B为iF-R-hc双光子成像(激发波长750nm)，箭头所指为从毛囊扩散出的iF-R-hc；C为SHG成像与荧光成像结合图；D为SHG成像与荧光成像结合的剖面图；E、F为局部放大图，现实iF-R-hc沿毛囊深入到胶原纤维的下层150μm处。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

基因工程菌表达的人源胶原蛋白(re-combinant human collagen,R-hc)，由天津伊瑞雅生物科技有限公司提供(生产批号20161101)。BALB/c小鼠，(20±2)g：由北京维通利华实验动物技术有限公司(许可证号SCXK(京)2012-0001)提供。用于胶原蛋白标记的荧光分子iFluorTM350succinimidyl ester，AAT Bioquest，激发/发射波长(346nm/443nm)。双光子共聚焦扫描显微镜，Olympus(FV1000)，Mai Tai DeepSee激光器(120fs，80MHz)。

实施例1、二次谐波结合双光子荧光成像方法检测人源胶原蛋白透皮吸收情况

一、荧光标记R-hc

精密称取人源胶原蛋白R-hc干粉100mg，向其中加入磷酸盐缓冲液10mL充分溶解，用1mol/L NaHCO₃溶液调pH 8.5±0.5。向iFluor^TM350中(1mg)加入无水DMSO1ml得到1mg/mL的染液。磁力搅拌器边搅拌边将荧光染液逐滴加入蛋白溶液中，避免将荧光素粘于烧瓶壁(大约在20min内加完)，加完后，继续避光搅拌12h左右。结合期间应保持蛋白溶液于4℃左右，故需将烧杯和搅拌器一起移入4℃冰箱中。将荧光标记后的蛋白取出放入透析袋中，置入避光含有超纯水的大烧杯中，每4h换一次水，至超纯水中检测无荧光时停止透析。将荧光蛋白取出，冷冻干燥成粉末，待用。

采用5％浓缩胶，10％分离胶，R-hc和荧光标记R-hc(iFluorTM350-Re-combinant human collagen，iF-R-hc)的上样量为50μg,上样体积为20μL，80V电压下150min。电泳结束后，先用紫外光(365nm)下观察荧光条带，再经考马斯亮蓝染色后，白光下观察蛋白条带，依据荧光条带及蛋白条带与蛋白质量标准条带的相对位置能够确定蛋白是否被荧光探针成功标记。

结果如图1所示，其中，A为考马斯亮蓝凝胶成像，B为紫外光下观察荧光条带图。由图A可见R-hc分子量在58kD左右，图B显示其荧光标记成功，且标记过程对其分子量大小无显著影响。

二、皮肤组织选取及SHG及双光子荧光成像

1、皮肤组织选取

小鼠麻醉后剃去背部毛发，将步骤一所得iF-R-hc溶液(1mg/mL)均匀涂抹于已暴露的背部皮肤组织，避光，室温条件下待其皮肤自然吸收1h后取下2cm×2cm全层皮肤组织，平铺于载玻片上。将全层皮肤组织置于双光子扫描共聚焦显微镜下进行图像采集。采集后皮肤做经常规脱水、包埋、切片后进行HE染色。用Image Pro Plus6.0软件图像处理，以基底层为起点，皮下组织与真皮层衔接处为终点，测量真皮层平均厚度。

2、皮肤组织的SHG及双光子荧光成像

SHG成像与双光子荧光成像均从背向收集信号，SHG激发波长950nm，双光子荧光激发波长750nm，激发光由物镜聚焦到皮肤样品组织上，产生的背向SHG信号与荧光信号由同一个放大倍数为25倍、数值孔径为1.05的水浸显微镜物镜来收集，双光子荧光通道使用高通滤波片，波长范围420-460nm；在SHG通道使用窄带滤波片，波长范围465-485nm，组织做全层Z轴扫描，步进5μm，图像采集速度10μm/pixel。将所得图像进行iMaris 7.4.2图像渲染处理，红色为SHG成像，蓝色为荧光成像。

3、结果

胶原主要存在于皮肤的真皮层中，是真皮的支撑结构，其网状架构为皮肤提供了保护和弹性(图2中右)，在纤维之间则分布着大量的水分、细胞外基质和功能性细胞，是皮肤重要的生化反应场所，为表皮层提供水分和营养。小鼠皮肤的HE染色结果显示(图2中左)，从表皮基底层到皮下组织，即真皮层平均厚度在158μm左右，胶原蛋白层应存在于此区域中。

给小鼠皮肤涂抹iF-R-hc 1h后取小鼠皮肤进行观察，二次谐波信号显示，小鼠皮肤本底胶原蛋白SHG信号较强，由前期研究表明[王毅，鲍进，盛巡，等.用光学二次谐波成像技术观察皮肤内不同种类的胶原[J].激光生物学报,2005,14(4):274-278.]其可能为I型胶原纤维，位于皮下100μm左右的真皮层中(图3中A)，分布有毛囊结构的空腔(箭头所示)。

外源iF-R-hc双光子扫描成像结果显示(图3中B)，该蛋白主要集中于毛囊内，但已有一点蛋白从毛囊扩散到真皮层内(如图3中E、F箭头所示)，该蛋白聚集的位置在图3中C叠加图中可清晰显示。从图3中D纵向剖面图中可以看出，外源iF-R-hc与内源胶原开始于同一深度并沿毛囊向下延伸，其深度可达150μm，但未超过真皮层厚度。