一种基于铽和适配体的丙溴磷荧光检测方法与流程

基于铽和适配体的丙溴磷荧光检测方法，属于分析化学技术领域。

背景技术：

丙溴磷是一种中等毒性的非内吸性广谱有机磷杀虫剂，具有触杀和胃毒作用，对棉花、果树、水稻、蔬菜等作物上的害虫有很好的防治效果。使用量日渐增多,因在蔬菜上的使用而产生的污染不容忽视。虽然少量的丙溴磷残留不会对人体造成立即的、直接的毒害,但是丙溴磷的分子结构比较稳定,在生物体内很难被代谢分解、排泄,长期食用这种受污染的蔬菜可导致癌症、不孕症、内分泌紊乱等疾病。大量进食超标蔬菜,会危害神经中枢,以致痉挛而死。我国政府规定水果和蔬菜中丙溴磷的最大残留剂量(MRL)分别为0.2和0.5mgkg^-1。

目前一般通过检测蔬菜中农药的残留来判断蔬菜受农药污染的程度,所以对蔬菜中农药残留量测定的研究报道较多,至今，用于检测丙溴磷的方法多为气相色谱分析法(GC)、高效液相色谱分析法(HPLC)，以及气相色谱和液相色谱同质谱联用(HPLC-MS,GC-MS)。尽管这些方法是可靠、有效、实用的，但是它们多不够简便、快速、高效，并且费时、昂贵及需要专业的技术人员。本研究意在建立一种简便、快速、特性性强、高效的丙溴磷残留量检测技术,满足执法者和消费者的迫切需要。由于它的低费用、便于操作、反应迅速、特别高的特异性，是一种很有前途的方法。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种基于荧光探针铽离子建立非标记核酸适配体传感器检测丙溴磷的方法,以快速、简单、灵敏的检测丙溴磷的残留量。

技术问题：基于铽和适配体的丙溴磷荧光检测方法基于以下原理：

铽离子在游离状态下时几乎没有荧光，单链DNA(尤其是富含G的)有助于增强铽的激发但双链DNA不能，能量从单链DNA转移到铽使得荧光强度增加。在只有富含G的核苷酸单链上与铽离子结合时，有很强的荧光效果；加入能够与富含G的核苷酸单链上发生碱基互补的丙溴磷的核酸适配体时，它们之间会通过碱基间互补作用力发生结合，形成双链结构，再结合铽离子，铽离子的荧光强度会减弱；当加入目标物后，丙溴磷的适配体会优先通过特异性识别作用，与目标物形成特殊的二级结构，从而释放富含G的核苷酸单链上，此时释放的核苷酸单链与铽离子结合，又会使荧光强度恢复。本研究方法就是通过这种荧光强度的变化，可以实现对丙溴磷的特异性检测。

本发明的技术方案：

包括以下步骤：反应体系的建立；通过测定荧光光谱图观察适配体、帮助链、铽离子以及丙溴磷体系的反应；通过荧光探针铽离子的非标记核酸适配体传感器检测丙溴磷并进行实际样品的检测。

(1)反应体系的建立

设计了一条富含G且又能与丙溴磷核苷酸适配体碱基部分互补的发夹帮助链，首先是单独的帮助链室温条件下与铽离子反应14min，其次是先加入丙溴磷核苷酸适配体与其帮助链室温条件下反应16min，再加入铽离子与其反应。

利用RF-5301荧光分光光度仪测定以上反应，荧光信号分别为F₀和F₁

(2)通过测定荧光光谱图观察适配体、帮助链、铽离子以及丙溴磷体系的反应

取3个2.0mL的离心管，编号为a,b,c，分别依次加入，a管(4μM帮助链50μL,10μM的铽离子50μL,pH7.9的Tris-盐酸缓冲液400μL),b管(4μM帮助链50μL,6μM核酸适配体50μL,10μM的铽离子50μL,pH7.9的Tris-盐酸缓冲液350μL),c管(4μM帮助链50μL,6μM核酸适配体50μL,10μM的铽离子50μL,2μM的丙溴磷50μL,pH 7.9的Tris-盐酸缓冲液300μL),在290nm的激发波长条件下测定荧光吸收光谱。

(3)建立基于铽和适配体的丙溴磷荧光检测方法

向含有6μM核酸适配体50μL,分别加入不同浓度的丙溴磷标准溶液,反应16min后，加入4μM帮助链50μL，10μM的铽离子50μL,pH 7.9的Tris-盐酸缓冲液350μL的混合体系中，室温条件下反应14min，测定该体系的荧光信号强度，铽离子的荧光信号强度将随着丙溴磷浓度的不同而发生变化。根据F₁和F₂与丙溴磷的浓度建立标准曲线。(F₁和F₂分别为加入丙溴磷之前和之后的荧光信号强度)

所用的丙溴磷标准品浓度依次为：1,2,4,6,8,10,12μM(终浓度分别为100,200,400,600,800,1000,1200nM)。本发明中，丙溴磷的检出限为0.105μM，线性范围为1-12nM。

(4)选择性实验的测定：

取6个2.0mL的离心管，依次编号为a～f，分别依次加入，a～f管(10μM铽50μL,4μM帮助链50μL,4μM核酸适配体50μL,2μM待测物质50μL,pH为7.9的磷酸盐缓冲液350μL，待测物质分别为(毒死蜱，乐果，辛硫磷，甲基对胺磷，敌敌畏，丙溴磷),在290nm的激发波长条件下测定荧光信号强度F₁和F₂，F₁和F₂分别为加入待测物质之前和之后的荧光信号值

(5)实际样品苹果的检测

称取样品5g(精确至0.01g),于100mL离心管中，加入20mL乙腈，均质1min，4000r/min离心5min，将上清液转入已知20g氯化钠,50mL磷酸缓冲液的100mL具塞量筒内，40℃旋转蒸发至干，溶解在2mL娃哈哈纯净水中，进行实验。如权利要求3所述的测定丙溴磷的方法，加入不同浓度的丙溴磷标准溶液进行测定。同时，将本实验方法与国标中的丙溴磷检测方法进行对照。

本发明的有益效果：

本实验建立了一种对丙溴磷具有高选择性，并且方便、简单，适用于现场快速检测的方法，可以推广与使用。

附图说明

图1是不同体系的荧光光谱图：4μM帮助链50μL,6μM核酸适配体50μL,10μM的铽离子50μL,2μM的丙溴磷50μL。a铽；b铽+帮助链；c铽+帮助链+核酸适配体；d铽+帮助链+核酸适配体+丙溴磷

图2是含有不同浓度的丙溴磷(1,2,4,6,8,10,12μM)的基于荧光探针铽离子的非标记核酸适配体传感器体系的荧光光谱图以及以该体系为参照的丙溴磷标准曲线图。a:帮助链+铽；j:帮助链+铽+核酸适配体；k:铽

图3是基于铽和适配体的丙溴磷荧光检测体系对不同种农药的荧光信号强度响应图谱：a～f管(10μM铽离子50μL,4μM帮助链50μL,4μM核酸适配体50μL,2μM待测物质50μL,pH为7.9的Tris-盐酸缓冲液300μL，待测物质分别为(毒死蜱，乐果，辛硫磷，甲基对胺磷，敌敌畏，丙溴磷)

图4是实际样品苹果提取液中含有不同浓度的丙溴磷(1,2,4,6,8,10μM)的基于铽和适配体的丙溴磷荧光检测体系的荧光光谱图以及以该体系为参照的实际样品工作曲线图。a:帮助链+铽；j:帮助链+铽+核酸适配体；k:铽

具体实施方式

利用帮助链为探针检测丙溴磷

材料/试剂：三氯化铽购买于西格玛奥德里奇试剂公司；三羟甲基氨基甲烷(Tris)购买于国药集团化药有限责任公司；核苷酸链由生工生物(上海)试剂公司合成；

方法：取两个2mL离心管分别标号为a,b，其中a管加入10μM铽50μL,4μM帮助链50μL,pH 7.9的Tris-盐酸缓冲液400μL，用涡旋仪充分震荡14min；b管加入4μM帮助链50μL,6μM核酸适配体50μL,充分震荡16min，再加入pH 7.9的Tris-盐酸缓冲液350μL，10μM铽50μL，混合溶液在室温下反应14min后，用荧光分光光度计其荧光值，比较两次记录的荧光曲线。

结果：a,b俩管的荧光信号强度F₀和F₁可以发现，F₁小于于F₀，由此说明，富含G的帮助链能够显著增强铽的荧光强度；核酸适配体与环状帮助链发生碱基配对结合，形成一个双链结构，从而使铽的荧光强度下降。

由于实验所用的体系受到帮助链以及适配体链长度的影响，所以需要研究帮助链和适配体链长度对反应体系的影响

材料/试剂：不同链长度的帮助链和核酸适配体：由生工生物(上海)试剂公司合成；

方法：取7个2.0mL的离心管，编号为a～g，分别加入：a管(10μM铽50μL,4μM帮助链1号50μL,pH 7.9的Tris-盐酸缓冲液400μL),b管(10μM铽50μL,4μM帮助链2号50μL,pH 7.9的Tris-盐酸缓冲液400μL),c管(10μM铽50μL,4μM帮助链3号50μL,,pH 7.9的Tris-盐酸缓冲液400μL),d管(10μM铽50μL,4μM帮助链4号50μL,pH 7.9的Tris-盐酸缓冲液400μL),e管(10μM铽50μL,4μM帮助链5号50μL,pH 7.9的Tris-盐酸缓冲液400μL),f管(10μM铽50μL,4μM帮助链6号50μL,pH 7.9的Tris-盐酸缓冲液400μL),g管(10μM铽50μL,4μM帮助链7号50μL,pH 7.9的Tris-盐酸缓冲液400μL),分别在室温条件下涡旋14分钟，测其荧光强度。

结果：实验发现，帮助链6可以作为最优的链

方法：取8个2.0mL的离心管，编号为a～h，分别加入：a管(10μM铽50μL,4μM帮助链650μL,pH 7.9的Tris-盐酸缓冲液400μL),b管(10μM铽50μL,4μM帮助链6号50μL,6μM核酸适配体1号50μL,pH 7.9的Tris-盐酸缓冲液350μL),c管(10μM铽50μL,4μM帮助链6号50μL,6μM核酸适配体2号50μL,pH 7.9的Tris-盐酸缓冲液350μL),d管(10μM铽50μL,4μM帮助链6号50μL,6μM核酸适配体3号50μL,pH 7.9的Tris-盐酸缓冲液350μL),e管(10μM铽50μL,4μM帮助链6号50μL,6μM核酸适配体4号50μL,pH 7.9的Tris-盐酸缓冲液350μL),f管(10μM铽50μL,4μM帮助链6号50μL,6μM核酸适配体5号50μL,pH 7.9的Tris-盐酸缓冲液350μL),g管(10μM铽50μL,4μM帮助链6号50μL,6μM核酸适配体6号50μL,pH 7.9的Tris-盐酸缓冲液350μL)，h管(10μM铽50μL,4μM帮助链6号50μL,6μM核酸适配体7号50μL,pH7.9的Tris-盐酸缓冲液350μL)，b-h管先Help DNA与适配体室温条件下涡旋16分钟，然后a-h管室温条件下涡旋14分钟，测其荧光光谱。

结果：实验发现，丙溴磷核酸适配体5号可以作为最优的适配体

除链的长度外，帮助链6号和核酸适配体5号的浓度对实验也有一定的影响。

方法：取10个2.0mL的离心管，编号为a-g，都加入10μM铽50μL，pH 7.9的Tris-盐酸缓冲液400μL，依次分别加入帮助链6(1,2,3,4,5,6,7,8,9,10μM)，测荧光值。

结果：实验发现，帮助链6号的浓度为4μM最优

方法：取10个2.0mL的离心管，编号为a-g，都加入10μM铽50μL，4μM帮助链650μL,pH 7.9的Tris-盐酸缓冲液350μL，依次分别加入核酸适配体(1,2,3,4,5,6,7,8,9,10μM)，测荧光值。

结果：实验发现，丙溴磷核酸适配体5号的浓度为6μM最优

该方法用于丙溴磷检测：

材料/试剂：丙溴磷购自西格玛奥德里奇试剂公司；苹果购自于当地菜市场

方法：

(1)建立基于基于铽和适配体的丙溴磷荧光检测方法

向含有6μM核酸适配体50μL,分别加入不同浓度的丙溴磷标准溶液,反应16min后，加入4μM帮助链50μL，10μM的铽离子50μL,pH 7.9的Tris-盐酸缓冲液350μL的混合体系中，室温条件下反应14min，，测定该体系的荧光信号强度，铽的荧光信号强度将随着丙溴磷浓度的不同而发生变化。根据F₁和F₂与丙溴磷的浓度建立标准曲线。(F₁和F₂分别为加入丙溴磷之前和之后的荧光信号强度)

(2)所用的丙溴磷标准品浓度依次为：1,2,4,6,8,10,12μM，通过测定荧光信号强度F₁和F₂，根据F₁和F₂与啶虫脒的浓度建立标准曲线。F₁为加入目标物丙溴磷之前的荧光信号值，F₂为加入目标物丙溴磷之后的荧光信号值。

(3)实际样品苹果的检测

称取样品5g(精确至0.01g),于100mL离心管中，加入20mL乙腈，均质1min，4000r/min离心5min，将上清液转入已知20g氯化钠,50mL磷酸缓冲液的100mL具塞量筒内，40℃旋转蒸发至干，溶解在2mL娃哈哈纯净水中，进行实验。如权利要求4所述的方法，加入不同浓度的丙溴磷标准溶液进行测定。同时，将本实验方法与国标中的丙溴磷检测方法进行对照。

(4)实验体系的验证：选择性实验的测定：

取6个2.0mL的离心管，依次编号为a～f，分别依次加入，a～f管(10μM铽50μL,4μM帮助链50μL,4μM核酸适配体50μL,2μM待测物质50μL,pH为7.9的Tris-盐酸缓冲液350μL，待测物质分别为(毒死蜱，乐果，辛硫磷，甲基对胺磷，敌敌畏，丙溴磷),在290nm的激发波长条件下测定荧光信号强度F₁和F₂，F₁和F₂分别为加入待测物质之前和之后的荧光信号值。

结果：根据F₁和F₂与丙溴磷的浓度建立标准曲线，丙溴磷的检出限为0.105μM，线性范围为1-12nM。本实验方法和国标气质方法检测丙溴磷的加标回收试验结果见下表

SEQUENCE LISTING

<110> 吉林大学

<120> 一种基于铽和适配体的丙溴磷荧光检测方法

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<212> DNA

<213> 人工序列

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