基于数字微镜器件实现多路频分复用荧光显微探测方法与流程

本发明涉及一种荧光显微成像，特别涉及一种基于数字微镜器件实现多路频分复用荧光显微探测方法。

背景技术：

在20世纪初库列首次使用紫外光激发荧光来观察细胞组，荧光显微镜如今广泛应用于生物和医学的研究领域。20世纪60年代共焦显微镜的概念诞生，传统的共焦显微镜是单点式、位移台扫描方式。随着医学的发展，需要得到更大的视场和更快的探测速度，但是传统的共焦显微镜的扫描效率低，光能利用率低无法满足需求。2006年出现了荧光显微镜和多通道并行频分复用探测的概念，利用对光束的频分复用和荧光显微镜相结合的方式对细胞进行更大视场的多通道探测。

已报道的多通道荧光显微镜一般是用机械斩波调制器件或者是全息聚合物分散液晶(H-PDLC)电控光栅斩波器将光束频分复用实现多通道。这样的多通道有很多缺点，例如：采用机械斩波器件的系统大，容易造成机械噪声；用液晶光栅集成的多通道结构固定，可调控性较差等。近两年来，基于微透镜阵列显微技术的研究在国内广泛开展。数字微镜器件(DMD)可当做分束镜来制作数字光源。DMD的表面是由约一百万个数字反射镜面组成，每个镜面都可以旋转。可以通过旋转不同的角度来达到开关镜面的作用，从而可以将一束光分成多数光，再汇聚到荧光显微镜系统中形成光源阵列。

技术实现要素：

本发明是针对目前实现多通道荧光显微成像所利用的斩波器的局限性的问题，提出了一种基于数字微镜器件实现多路频分复用荧光显微探测方法，用数字微镜器件DMD代替斩波器，通过计算机外部软件开关DMD上的微镜片划分出多个通道，再分别通过加载一定帧率的通道信号来控制各个通道的开关频率，就实现了快速集成多通道的频分复用。

本发明的技术方案为：一种基于数字微镜器件实现多路频分复用荧光显微探测方法，具体包括如下步骤：

1)搭建实现多路频分复用荧光显微探测光路：激光光源发出一束激光经第一准直扩束器组准直为平行光，平行光以与数字微镜器件垂轴方向成24°角入射到数字微镜器件上，经过数字微镜器件反射的反射光垂直入射到第二准直扩束器组上，被第二准直扩束器组收缩后的光信号全部进入二向色镜组中，二向色镜组透射光通过显微物镜汇聚到含荧光的细胞样品中成像，成像后的光信息通过显微物镜返回，再经过二向色镜组反射进入分光棱镜，由分光棱镜分成两路，一路由光电倍增管接收，一路由成像透镜汇聚由CCD接收，得到样品成像；

2)将数字微镜器件的开关微镜片划分为多个通道，给每个通道加载不同帧频的通道信号来控制各通道的开关频率，在数字微镜器件面上根据时间段形成不同开关状态的图，若数字微镜器件上通道对应的微镜片处于“开”状态，则此区域的入射光被反射出去，进入第二准直扩束器组收集的信号中，如数字微镜器件上通道对应的微镜片处于“关”状态，则此区域的入射光不被反射出去，也无光信号被第二准直扩束器组收集，实现了多通道的频分复用；

3)光电倍增管接收探测后的荧光信号进行A/D转换，然后输入电脑进行采集和信号处理，进行傅里叶变换、滤波和解调后得到荧光信号强度随时间变化关系，最终得到细胞样品荧光信息。

所述步骤2)的多个通道为n个通道，则在数字微镜器件上划分n块区域，若光电倍增管接收n路荧光信号的强度分别为I₁(t),I₂(t),...,I_n(t)，对应各个区域加载的调制信号的频率分别为均不相同的f₁(t),f₂(t),...,f_n(t)，则最后收集到的细胞样品荧光信息是各路经过调制后的光强度的叠加，计算公式如下：

I(t)＝I₁(t)cos[2π×f₁(t)t]+I₂(t)cos[2π×f₂(t)t]+...+I_n(t)cos[2π×f_n(t)t]

本发明的有益效果在于：本发明基于数字微镜器件实现多路频分复用荧光显微探测方法，可以快速集成多通道，并且通过数字计算机实现频分复用功能，易于实现。

附图说明

图1为本发明基于数字微镜器件实现多路频分复用荧光显微成像的装置示意图；

图2为本发明以两路通道为例加载的帧率为x fps的部分图片信息图；

图3-1为本发明两路通道的帧率为x fps的左区域切换开关所隔帧数图；

图3-2为本发明两路通道的帧率为x fps的右区域切换开关所隔帧数图；

图4为本发明以四路通道为例加载的帧率为y fps的部分图片信息图；

图5-1为本发明四路通道的帧率为y fps的左上区域切换开关所隔帧数图；

图5-2为本发明四路通道的帧率为y fps的右上区域切换开关所隔帧数图；

图5-3为本发明四路通道的帧率为y fps的左下区域切换开关所隔帧数图；

图5-4为本发明四路通道的帧率为y fps的右下区域切换开关所隔帧数图。

具体实施方式

基于数字微镜器件实现多路频分复用荧光显微探测方法，利用计算机外部软件程序加载以及生成模版图片信息来控制数字微镜器件DMD的光开关状态并应用于多通道频分复用荧光显微成像中，相比于液晶显示控制，加快了DMD的光开关速率，提高系统的处理效率。

如图1所示的基于DMD实现多路频分复用荧光显微成像的装置示意图，包括激光光源1，两个准直扩束器组2、4，数字微镜器件(DMD)3，二向色镜组5，显微物镜6，含荧光的细胞样品7，分光棱镜8，光电倍增管(PMT)9，成像透镜10，CCD11及计算机。激光光源1发出一束405nm激光经第一准直扩束器组2准直为平行光并以与数字微镜器件(DMD)3垂轴方向成24°角入射到DMD3上，则其反射光垂直入射到第二准直扩束器组4上。用数字微镜器件DMD代替斩波器，通过计算机外部软件加载N个不同频率的N个通道信号直接通过USB2.0发送到DMD的控制板上，每个通道信号控制DMD面对应的微镜片区域工作，在DMD面上根据时间段形成不同开关状态的图，若DMD上通道对应的微镜片处于“开”状态，则此区域的入射光被反射出去，进入第二准直扩束器组4收集的信号中，如DMD上通道对应的微镜片处于“关”状态，则此区域的入射光不被反射出去，也无光信号被第二准直扩束器组4收集。控制DMD开关微镜片划分多个通道以及DMD的开关状态，通过对每个通道加载不同帧频的信号来控制各通道的开关频率，就实现了多通道的频分复用。这里的第二准直扩束器组4主要是为了收缩光源孔径，使收缩后的光信号可以全部进入二向色镜组5中。透射后通过显微物镜6汇聚到含荧光的细胞样品7中成像。成像后的光信息通过显微物镜6返回，再经过二向色镜组5反射进入分光棱镜8，由分光棱镜8分成两路，一路由光电倍增管(PMT)9接收，一路由成像透镜10汇聚由CCD11接收。本装置可以实现快速集成多通道，且通过数字计算机易于实现频分复用功能。PMT9探测后的荧光信号进行A/D转换，然后输入电脑进行采集和信号处理，进行傅里叶变换、滤波和解调后得到荧光信号强度随时间变化关系，最终得到细胞样品荧光信息。

下面主要以两路和四路为例来进行论证：

如图2所示是以两路通道为例，加载的帧率为x fps的两通道对应在DMD上形成的开关状态的图。通过计算机外部软件直接控制DMD开关微镜片上划分出两个通道，然后再分别控制这两个通道的开关频率，就实现了两通道的频分复用。

针对两通道频分复用显微镜，将DMD划分为左右两个区域，就可以加载帧率为x fps的通道信号，每个方块图中间竖直黑带是分割区域，始终关闭状态，将每个方块图分成左右两区域。将每一方块图看做一个信号状态图，白色区域是开关处于“开”的状态，黑色区域是代表开关处于“关”的状态。一次开和关形成一个周期信号。如图3所示，我们设定“开”的状态为1，“关”的状态为0。图2中的黑色区域即“关”态，对应图3的“0”态，图2中的白色区域即“开”态对应图3的“1”态。横坐标为一路信号的帧数，纵坐标为开关所处的状态。看图2中每个方格的左边，为白、黑、白、黑……，对应状态为开、关、开、关……，到图3-1对应的就是1、0、1、0……；看图2中每个方格的右边，为白、黑、黑、白、黑、黑……，对应状态为开、关、关、开、关、关……，到图3-2对应的就是1、0、0、1、0、0……。

各区域加载的信号频率f是该通道的信号帧数与左右区域切换开关状态所隔帧数的比值，因此在左区域通道加载的调制信号，右区域通道加载的调制信号，从而实现两路频分复用。

设两路荧光光强度分别为I₁(t),I₂(t)，调制后的荧光光强度为I₁(t)cos(2πf₁t),I₂(t)cos(2πf₂t)；

此时的则通过两路频分复用的信号光强为：

最终得到的荧光拍频信号光强由光电倍增管PMT9探测接收。

如图4所示是以四路通道为例，加载的帧率为y fps的四通道对应在DMD上形成的开关状态的图。通过计算机外部软件直接控制DMD开关微镜片上划分出四个通道，然后再分别控制这四个通道的开关频率，就实现了四通道的频分复用。

针对四通道频分复用显微镜，将DMD划分为上下左右四个区域，就可以加载帧率为y fps的通道信息，如图4，每个方块图像中间十字黑带是分割区域，始终关闭状态，将每个方块图像分成左上、右上、左下、右下四个区域，同样白色区域是开关处于“开”的状态，黑色区域是代表开关处于“关”的状态。一次开和关形成一个周期信号，我们设定“开”的状态为1，“关”的状态为0，由分析可知该周期信号属于方波信号。如图5-1至5-4所示，横坐标为一路信号的帧数，纵坐标为开关所处的状态。可以知道：图5-1左上区域每隔2帧切换开关状态，图5-2右上区域每隔3帧切换开关状态，图5-3左下区域每隔4帧切换开关状态，图5-4右下区域每隔5帧切换开关状态。

各区域加载的信号频率f是该通道的信号帧数与左右区域切换开关状态所隔帧数的比值。因此该左上区域通道加载的调制信号，右上区域通道加载的调制信号，左下区域通道加载的调制信号，右下区域通道加载的调制信号。

设四路荧光光强度分别为I₁(t),I₂(t),I₃(t),I₄(t)，调制后的荧光光强度为I₁(t)cos(2πf₁t),I₂(t)cos(2πf₂t),I₃(t)cos(2πf₃t),I₄(t)cos(2πf₄t)；

此时的则通过四路频分复用的信号光强为

以此类推，只要激发光能量足够大，多通道频分复用显微区域能量探测均可同理得到。已知通道数以及所加载通道的帧率，通过计算机外部软件直接控制DMD的光开关作用，只需分析所得到的各区域切换开关状态所间隔的帧数，即可计算出各个通道区域的调制信号频率,从而实现多通道的快速频分复用。

假设有n路通道，再根据各个信号的调制频率f(t)，则由公式

I(t)＝I₁(t)cos[2π×f₁(t)t]+I₂(t)cos[2π×f₂(t)t]+...+I_n(t)cos[2π×f_n(t)t]

即可求出整个多路信号频分复用的信号光强度。