一种基于共角干涉的层析相位显微方法与装置与流程

本发明属于超分辨光学显微领域，特别涉及一种共角干涉的层析相位显微方法和装置。

背景技术：

在显微成像中，样品的折射率分布起了非常重要的作用。首先，折射率作为一种天然的标记揭示了细胞内部的特殊结构；其次，光学非均匀性影响样品产生的光程，从而直接影响成像质量，因此定量测量样品的3D折射率分布至关重要。在基于荧光的显微技术中，荧光团对样品产生的效应以及光毒性影响细胞样品以及系统的成像稳定性。而基于相位的显微技术，如差分干涉对比显微术以及相衬显微镜对样品的影响最小，但是这种典型的透射式相位成像法仅可以测量样品的平均折射率而无法对轴向方向的折射率进行分辨。折射率的3D空间变化首先是通过层析相位显微术(TPM)测量的，这种技术基于测量沿多个方向的折射率投影。

为了重构一张层析相位图，必须沿着不同的方向记录样品的相位信息。通常被用于定量回复波前相位信息的方法包括相移法、条纹调制技术以及传输强度方程法。在这些方法中，相移法是最精确并且受强度非均匀性影响最小的一种方法。在测量沿多个方向折射率的投影中有两种主要的方法：改变照明光的方向或者旋转样品。虽然照明光扫描法的角度在一个维度上的覆盖范围比样品旋转法小，但是这种方法可以实现二维的角度扫描，保持样品于照明扫描的TPM装置中，参考光路的角度是固定的，因此，当样品壁的光路倾斜时，样品引入的相位信息将被倾斜相位背景淹没，引入背景噪声将影响分辨率。与倾斜照明相关的相位背景将减小可探测的相位梯度，尤其是当照明角度很大时，这一影响更为显著。相位引入的条纹与背景混合在一起将影响波前的均匀性，从而降低测量相位的精确度。

技术实现要素：

本发明提供了一种基于共角干涉的层析相位显微方法和装置。在本发明的装置中使参考臂与样品臂的光路以相同的角度绕着样品进行共角扫描，从而保证了在大角度照明时相位的恢复精度与垂直入射时相当。同时PZT控制信号采用锯齿波信号，减小其因电压切换导致抖动带来的干扰，系统更加精密稳定，样品相位信息获取速度达50帧每秒，在三维活体生物成像，肿瘤诊断和材料瑕疵检测等生物医学以及材料科学领域中有广泛的应用前景。

本发明的具体技术方案如下：

一种基于共角干涉的层析相位显微装置，包括依次布置的激光器、扫描振镜系统和第一分束器，由所述第一分束器将激光束分成参考光和样品光；

设有沿样品光路依次布置的：

照明物镜，用于使照明光变成平行光照明样品；

成像物镜，用于接收样品反射的样品光；

设有沿参考光路依次布置的：

活动的第一反射镜，通过周期性移动自身位置来改变参考光路光程；

补偿器，用于补偿参考光路与样品光路间的光程差；

第二分束器，用于将参考光和样品反射的样品光进行合束；

和图像采集单元，用于记录参考光与样品光产生的干涉图像；

还包括计算机，根据在第一反射镜每个周期内多次扫描样品记录得到多个干涉图像包，解出对应该周期内的样品三维折射率分布图。

作为优选的，在所述激光器和扫描振镜系统间设置二分之一波片，用于调节激光的线偏振方向，以改变参考光与样品光的光强比，使参考光与样品光光强一致，从而得到最佳对比干涉条纹。

作为优选的，所述的第一分束器和第二分束器均采用偏振分光棱镜。

作为优选的，所述的补偿器为由若干玻璃片堆叠而成的玻璃堆。为了使得参考光路与样品光路光程差在相干波长范围内从而产生干涉，故而在参考光加入玻璃片堆作为光程补偿，调节参考光与样品光之间光程差，使其基本一致。

作为优选的，还包括安装在第一反射镜上的压电陶瓷，用于周期性线性移动所述的第一反射镜。

作为优选的，所述压电陶瓷的控制信号采用锯齿波信号，可减小其因电压切换导致抖动带来的干扰。

作为优选的，所述的图像采集单元包括沿光路依次设置的：

场镜，用于对样品光与参考光成像；

偏振片，用于改变样品光与参考光产生的干涉图样的对比度；

CCD，用于记录参考光与样品光产生的干涉图像。

本发明还提供了一种基于共角干涉的层析相位显微方法，包括步骤：

1)激光光束分束为样品光和参考光，

2)利用样品光照明样品，收集样品散射的样品光与参考光产生干涉图像；

3)控制参考光路光程呈周期性变化，并补偿参考光路相对于样品光路产生的光程；

4)在参考光路光程的每个变化周期P内，控制参考光和样品光以相同的角度绕着样品进行共角扫描多个周期；

5)收集同属一光程变化周期P内每个扫描周期的干涉图像包，计算得到每个光程变化周期P内样品的折射率三维分布图。

作为优选的，根据连续的多个光程变化周期P内样品的折射率三维分布图，获取样品的三维折射率随时间变化的分布图。

作为优选的，在所述的步骤5)中，运用四步移相法和2π相位模糊解除法——相位解缠绕法计算干涉图像在各个扫描角度下对应的相位积分图，再利用反Radon变换得到每个时间周期P内样品的折射率三维分布图。

本发明的原理如下：

激光器发出的激光经单模光纤滤波后变成点光源，然后经过第一透镜准直变成平行光后透过二分之一波片，由于激光器发出的光是线偏振光，故通过旋转二分之一波片可以改变激光线偏振光的偏振方向，从而调整经后面第一偏振分光镜所分参考光与样品光的光强比，透过二分之一波片的平行光经过二维振镜扫描系统后改变平行光的出射方向，然后经过第一偏振分光镜分光形成参考光和样品光；

参考光依次经过第二透镜会聚到压电陶瓷控制的第一反射镜上，再经过第四透镜、第六透镜后透过补偿光路的玻璃堆，然后入射到第二偏振分光镜上；

样品光经过扫描透镜后会聚到照明物镜后焦面，当二维振镜扫描系统进行一维扫描时，经过扫描透镜的会聚光斑将在照明物镜后焦面上进行一维直线扫描，经过照明物镜后变成平行光照明样，并以三角形的方式扫描照明样品，如图5所示，照明物镜采用NA为1.4的浸油物镜(n_oil＝1.518)，照明角度α的扫描范围为-60°～60°(理论上可达到-67°～67°)，其角度扫描范围可通过设置前面的二维振镜扫描系统y方向(或x方向)扫描范围实现，照明光透射样品后携带着样品的相位信息被成像物镜接收，然后经过反射镜反射到第二偏振分光镜上；

参考光与样品光经过第二偏振分光镜合束后入射到场镜上后变成平行光，然后经过偏振片后通过CCD记录干涉图样。

在光学系统的控制中，压电陶瓷的控制电压由V₁和V₂决定，电压输入信号是周期为P(100ms)的锯齿波信号(如图2所示)：其中，表示对x向下取整，在一个周期内，压电陶瓷控制的第一反射镜线性移动使参考光产生一个波长的光程改变量，移动速度与此同时，二维振镜扫描系统的扫描周期为P/4(25ms)，控制信号如图3所示，可表示为：其中，θ_u和θ_d表示二维振镜两边的最大扫描角；在扫描的过程中，CCD以5000帧每秒的速度，采样信号如图4所示，快速记录参考光与样品光干涉所产生的图像。

在CCD面内，样品光和参考光在t时刻、空间位置(x,y)的光场可分别表示为：

其中，φ(x,y,t)＝φ(x,y,t+P/4)是样品的相位，k_m表示介质中的波矢量，ω表示光波角频率A_s表示表示样品光振幅，A_r表示参考光振幅，θ_x和θ_y表示样品光与x和y轴夹角的余角，M为系统的放大倍数。参考光与样品光的干涉强度可表示为：

因此在一个压电陶瓷周期P内便CCD可记录4组二维振镜扫描系统角度扫描范围内n(n取决于CCD的采样频率与二维振镜扫描系统的扫描频率之比)个照明角度产生的干涉图像包S1(I₁₁，I₁₂，…，I_1n)，S2(I₂₁，I₂₂，…，I_2n)，S3(I₃₁，I₃₂，…，I_3n)，S4(I₄₁，I₄₂，…，I_40n)，因此第i(i＝1,2,…,n)个照明角度下的4个强度可表示为：

利用四步移相法，可以得到第i个照明角度下的相位图：

其中，angle(x)为一个对x求相位的函数。然后利用二维相位解缠绕法解除2π相位相位模糊使相位图变成连续相位图，其计算表示为：

其中，unwrap2(x)为一个对x解缠绕的函数。然后取出样品，用上述的方法同样求得只含有背景的相位利用背景消除法，可得到α_i角度下样品的准确相位，其方法表示为：

利用上述的方法可以解出-60°～60°扫描照明角度范围内n个角度下样品的准确相位分布。然后再利用逆Radon变换便可算出样品每个空间位置(x_s,y_s,z_s)中的层析折射率分布n(x_s,y_s,z_s)，利用算法可以将层析分布重构成样品的三维折射率分布图。

在不同的压电陶瓷周期内，利用上述的方法，可以得到不同时刻下重构的三维折射率分布图，从而可以用于观察活体生物细胞的运动状况。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

(1)样品光与参考光采用共角干涉，可减小斜照明时引入的背景噪声，提高相位复原的精度；

(2)参考光路中的压电陶瓷采用线性电压信号控制，可减小CCD信号采集时压电陶瓷抖动引起的噪声，提高系统稳定性和相位复原的准确性；

(3)相对于原来压电陶瓷采用阶梯电压信号，本发明采用锯齿波信号控制，减小了压电陶瓷电压突变变化次数，可延长压电陶瓷使用寿命；

(4)系统成像速度取决于机械控制运动机构，参考光中压电陶瓷使用锯齿波信号控制，有利于提高系统成像速度，从而提高动态样品相位恢复的时间分辨率；

(5)系统装置结构紧凑，有利于模块化；

附图说明

图1为本发明的基于共角干涉的层析相位显微方法的一种实施方式示意图；

图2为压电陶瓷的电压控制信号示意图；

图3为二维振镜扫描系统的电压控制信号示意图；

图4为CCD图像采集的信号控制示意图；

图5为在二维振镜扫描系统控制下，光路在样品上扫描角度变化示意图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图来详细说明本发明，但本发明并不仅限于此。

如图1所示的层析相位显微装置，包括：

He-Ne激光器1，用于发出632.8nm波长的激光；

单模光纤2，用于对激光进行小孔滤波，使其变成理想点光源；

第一透镜3，用于准直激光；

二分之一波片4，用于调节激光的线偏振方向，P光与S光的偏振分量，即改变参考光与样品光的光强比；

扫描振镜系统，由第一一维扫描振镜5、第二一维扫描振镜8、第二透镜6和第三透镜7组成；第一一维扫描振镜5和第二一维扫描振镜8，用于改变激光与光轴间的夹角；第二透镜6和第三透镜7，用于与第一一维扫描振镜5和第二一维扫描振镜8构成4f系统，使第一一维扫描振镜准确成像在第二一维扫描振镜上；

第一偏振分光棱镜9，用于将激光束分成参考光和样品光；

第四透镜10和第五透镜12，用于与压电陶瓷构成4f系统；

安装有压电陶瓷的第一反射镜11，用于周期性改变参考光路的光程；

第六透镜13，与第五透镜12和压电陶瓷构成4f系统；

玻璃堆14，用于补偿参考光相对于样品光路中样品产生的光程；

扫描透镜16，用于使样品光会聚在照明物镜后焦面上；

照明物镜17，用于使照明光变成平行光照明样品；

样品18，用于被成像；

成像物镜19，用于接收样品发出的散射光；

第二反射镜20，用于将样品光反射到与参考光同一光路上；

第二偏振分光镜15，用于将参考光和样品光进行合束；

场镜21，用于将样品光与参考光成像到CCD上；

偏振片22，用于改变样品光与参考光产生的干涉图样的对比度；

CCD23，用于记录参考光与样品光产生的干涉图像；

计算机14，用于控制压电陶瓷，二维扫描系统和CCD的图像采集。

本实施例中层析相位显微装置的工作过程如下：

(1)激光器1发射出激光光束，光束经单模光纤2滤波后，入射到第一透镜3上进行准直变成平行光，准直后的平行光进入二分之一波片4改变偏振激光的线偏振方向，旋转二分之一波片4调节P偏振光与S偏振光的偏振分量，进而调整参考臂与样品臂光路光强相等；

(2)由二分之一波片4透射的平行光经一个二维扫描系统改变平行光出射角度，二维振镜扫描系统由两个扫描方向相互垂直的第一一维扫描振镜5和第二一维扫描振镜8组成，在第一一维扫描振镜5第二一维扫描振镜8之间放置第二透镜6和第三透镜7，放置位置形成一个4f系统，即第一一维扫描振镜5第二一维扫描振镜8放置于4f系统前后焦面上，经过由二维扫描系统出射的平行光以第二一维扫描振镜8反射点为球心进行锥形扫描，并经第一偏振分光镜9透射和反射分别分成参考光和样品光；

(3)透射的参考光入射到第四透镜10后会聚到安装有压电陶瓷的第一反射镜11上，第四透镜10后焦点与第二一维扫描振镜8反射点重合，当压电陶瓷未上电压时，第一反射镜11的反射点位于第四透镜10的前焦面上，第一反射镜11在压电陶瓷的控制下移动改变参考光路光程，压电陶瓷每个周期使参考光改变一个波长的光程，经第一反射镜11反射的参考光入射到第五透镜12后变成平行光，第五透镜11与第四透镜10共焦形成4f系统；

(4)经第五透镜12透射的平行光经第六透镜13会聚，会聚光经过一个由多片玻璃片堆14叠而成的玻璃堆以补偿样品光路产生的光程；

(5)经第一偏振分光镜9反射的样品光经扫描透镜16后会聚到照明物镜17的后焦面上，后入射到照明物镜上变成平行光照明样品18，照明物镜17与扫描透镜16共焦，样品18位于照明物镜17的焦面上，被照明的样品18发出的光被成像物镜19接收后经第二反射镜反射20，成像物镜19与照明物镜17共焦；

(6)被反射的样品光和所述的参考光经第二偏振分光镜15合束后入射到场镜21上，场镜21与成像物镜19和第六透镜13均共焦，样品光和参考光经场镜21后形成与光轴成相同角度的平行参考光和样品光，平行参考光和样品光经过偏振片22后入射到放置于所述场镜21前焦面上的CCD23上产生干涉进行成像，旋转偏振片22可调节参考光与样品光在CCD23上的干涉图样对比度达到最高；

(7)压电陶瓷的移动频率和二维振镜扫描系统的扫描频率与扫描方式由计算机24软件Labview控制，压电陶瓷锯齿波电压信号(如图2所示)的驱动下以周期P进行线性移动，使参考臂相对样品臂在这个周期P内线性产生的光程变化；二维振镜扫描系统以P/4周期进行扫描(如图3所示)，即在压电陶瓷的一个运动周期内二维振镜扫描系统对样品光路扫描四个周期，CCD23快速记录(采样信号如图4所示)二维振镜扫描系统在四个扫描周期内不同照明角度下照明样品时得到的4个干涉图像包S1，S2，S3和S4；运用四步移相法和2π相位模糊解除法——相位解缠绕法计算各个扫描角度下对应的相位积分图，再利用反Radon变换得到第一个时间周期P内样品的折射率三维分布图；

(8)压电陶瓷在下一个周期P的电压信号驱动下，重复步骤(7)的扫描和记录方法，依次得到下一组4个干涉图像包S5，S6，S7和S8，同样解出对应该周期P内的样品三维折射率分布图；以此类推，可以快速获取活体样品的三维折射率随时间变化的分布图。

在所搭建的光学系统中，每相邻两个透镜组成一个4f系统；参考光路中的第四透镜10、第五透镜12和第六透镜13的焦距之和与样品光路中的扫描透镜16、照明物镜16和成像物镜19的焦距之和相等，从而保证参考光与样品光光程基本一致，同时满足第五透镜12焦距比第四透镜10焦距与第六透镜13焦距之积等于照明物镜17焦距比扫描透镜16焦距与成像物镜19焦距之积，从而保证参考光与样品光光斑大小在CCD上一致；照明物镜17与成像物镜19采用1.49NA及100X的浸油显微物镜；压电陶瓷选择线性工作区，其移动周期为100ms，二维振镜扫描角度范围为-60°～60°，CCD成像速度为5000帧每秒。

以上所述仅为本发明的较佳实施举例，并不用于限制本发明，凡在本发明精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。