一种利用15N标记研究浮游藻类与水生植物的氮素迁移的方法与流程

本发明涉及水体富营养化的研究领域，尤其涉及一种利用¹⁵n标记研究浮游藻类与水生植物的氮素迁移的方法。

背景技术：

富营养化是我国湖泊面临的主要问题，蓝藻水华的频繁暴发是富营养化程度逐渐加剧的重要自然表征，也是当前国内主要的环境难题之一。氮是引发水体富营养化的关键营养元素之一，因而削减氮素无疑便是富营养化水体治理的先决条件之一。对于藻型富营养化水体，在众多移除內源氮素的技术方法中，生态拦截、水生植物修复技术是清除蓝藻、恢复水体自净能力行之有效的措施，具有很好的研究和应用前景。

稳定氮同位素（¹⁵n）标记法可以很好地追踪水体中氮的迁移、转化过程，从而被广泛地应用于水生态系统中的氮循环过程研究。为了弄清楚水生植物对周围蓝藻释放氮素的吸收、转移过程，¹⁵n标记已成为首选方法。但有关浮游藻类的¹⁵n标记方面的研究仍有不足，对于浮游藻类生长水环境中¹⁵n的丰度以及浮游藻类的最佳¹⁵n标记量缺少统一认识。

技术实现要素：

针对上述存在的问题，本发明目的在于提供一种利用¹⁵n标记研究浮游藻类与水生植物的氮素迁移的方法。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案如下：一种利用¹⁵n标记研究浮游藻类与水生植物的氮素迁移的方法，所述的方法包括如下步骤：1）将浮游藻类细胞在含有na¹⁵no3的液体培养基中培养，培养10～16天，通过gf/c膜抽滤法收集藻细胞，经同位素质谱仪藻细胞中¹⁵n的丰度。

2）将上述藻细胞通过低速离心法收集被¹⁵n标记的藻细胞，将被¹⁵n标记的藻细胞与水生植物进行共培，其中被标记的藻细胞中¹⁵n的丰度为3.8%～4.8%。

3）共培18～30天，经同位素质谱仪测定水生植物中的¹⁵n丰度，水生植物中¹⁵n的丰度为2.7～3.9%，计算得出¹⁵n的迁移效率。

本发明所述的同位素质谱仪测定藻细胞中¹⁵n的丰度时，藻滤膜包样量在2000μg～5000μg，同位素质谱仪测定水生植物的¹⁵n丰度时，植物样品包样量在15000μg～25000μg。测定样品时包样量过高，测定时样品在仪器中不能保证充分燃烧和转化，且仪器关键部件易被堵塞和损坏。测定样品包样量过低，检测丰度低于仪器检测下限，数据误差偏大。

本发明的浮游藻类选用水华藻类，包括蓝藻、绿藻或硅藻；所述的水生植物选用漂浮植物或沉水植物，所述的漂浮植物包括凤眼莲、水浮莲、槐叶萍或水鳖，所述的沉水植物包括叶黑藻或狐尾藻。其中微囊藻为我国主要暴发蓝藻水华的湖泊（滇池、太湖、巢湖）中的优势藻类，且危害较大；凤眼莲为当前国内外研究较多的漂浮植物，对蓝藻的拦截与控制效果较好，并在太湖、滇池等大水域的蓝藻水华治理中被广泛的推广与应用。

本发明的步骤1）的操作过程中，gf/c膜抽滤法收集藻细胞，将膜放置冷冻干燥机内冷冻干燥至恒重，用剪刀将干燥的滤膜剪碎至0.5～1.5mm的颗粒，保存样品。gf/c膜为玻璃纤维滤膜，空隙小，可以滤掉常见的浮游藻类。此外，gf/c膜含氮量很低，对后续¹⁵n的测定影响较小。尽量剪碎主要考虑到同位素质谱仪测定时对样品的要求和结果的准确性，为避免样品的交叉污染，剪刀剪切一个gf/c膜后，需用酒精棉擦拭并用去离子水冲洗后才方可用于下个滤膜的剪切。

本发明步骤1）中培养藻类的光照培养箱温度为25℃±1℃，光照强度为30µmolphotonsm^-2·s^-1，光周期为12:12，¹⁵n添加量为培养基中氮源浓度的5%。

本发明步骤2）中的操作过程中，得到的被¹⁵n标记的藻细胞需经过去离子水悬浮后，离心收集，反复以上操作3～6次，得到的藻细胞用于共培实验。采用反复离心和清洗的原因是：为了避免培养液中残留的¹⁵n以及藻细胞表面粘附的¹⁵n对结果的干扰，提高实验结果的准确性。

本发明所述步骤1）和步骤3）中采用同位素质谱仪测定样品中¹⁵n丰度的方法如下：将待测样品放入锡杯包成球状，然后放入进样盘，使用进样杆推动进样盘使样品进入1000℃氧化管，燃烧产生的气体通过600℃还原管还原为n2，通过化学阱除去h2o和co2，最后通过100℃色谱柱分离后进入同位素质谱仪检测器，通过callisto1038软件分析所测数据。

本发明的优点在于：本发明根据现有技术中同位素质谱仪检测器的技术条件的限制，其仪器检测的¹⁵n的丰度不能超过5%，超过5%的进样，样品在检测过程中会堵塞仪器管道，给仪器造成不必要的损耗；而且对于仪器测定来说，虽然较低的¹⁵n的在测定过程中不会造成仪器损坏，但是由于本身丰度较低，最终检测很容易产生误差，得出的实验数据精准度不够。

作为藻类和水生植物本身的共培实验，氮元素的迁移过程是技术人员所不能控制的，因此¹⁵n最终能否控制在固定的阈值，技术人员无法精准控制，困扰其研究的进一步进行；因此采用本发明的方法对实验的条件进行了限定，使得后续测得的迁移结果控制在指定阈值内，避免检测仪器超负荷运作，检测精准，方便计算藻类和水生植物的迁移效果；为今后从事浮游藻类与水生植物间的氮素迁移转化过程的研究提供实验基础。

附图说明

图1为本发明的实施例1中铜绿微囊藻中稳定同位素¹⁵n标记的动态变化过程；

图2为本发明实施例1中与铜绿微囊藻共培养后凤眼莲¹⁵n丰度变化过程；

图3为本发明实施例2中与铜绿微囊藻共培养后水浮莲¹⁵n丰度变化。

具体实施方式

本发明的实施例中¹⁵n的丰度测定采用sercon20-22（deltavplus,thermofisherscientificinc.）稳定同位素质谱仪进行测定；稳定同位素质谱仪选用europaea-gslsamplepreparationsystem样品制备系统。

本发明的实施例中应用的铜绿微囊藻为microcystisaeruginosafachb905。

下面结合附图说明和具体实施方式对本发明作进一步详细的描述。

实施例1：一种利用15n标记研究铜绿微囊藻与凤眼莲中氮素迁移的方法；

1）以铜绿微囊藻（microcystisaeruginosafachb905）为例，采用500ml锥形瓶于光照培养箱中培养，温度为25℃±1℃，光照强度为30µmolphotonsm^-2·s^-1，光周期为12:12，采用bg11培养基静置培养，用na¹⁵no3将培养基中⁵n丰度调节至5%，14天后收集标记的藻细胞。

用于测定藻¹⁵n丰度的藻细胞采用gf/c膜抽滤法收集，取10ml藻液用真空泵抽滤至gf/c膜上，将膜放置冷冻干燥机内冷冻干燥至恒重。用剪刀将干燥的滤膜剪碎成1mm的颗粒，保存样品，用稳定同位素质谱仪测定其¹⁵n丰度，根据藻的生物量（cells/l）换算出单位藻细胞中¹⁵n的质量。

2）选用低速离心法收集用于藻和凤眼莲间氮素的迁移转化的标记藻细胞，收集的藻细胞需用高质量的去离子水悬浮后，再次离心收集，反复5次，用于凤眼莲的共培实验；

3）将¹⁵n标记的铜绿微囊藻与凤眼莲共培养与水箱中，标记的藻起始od665为0.3，叶绿素1.14μg/ml，¹⁵n丰度在4.2%～4.6%；培养21～28天后，监测凤眼莲中¹⁵n的丰度。

将待测样品放入锡杯包成球状，然后放入进样盘，使用进样杆推动进样盘使样品进入1000℃氧化管，燃烧产生的气体通过600℃还原管还原为n2，通过化学阱除去h2o和co2，最后通过100℃色谱柱分离后进入同位素质谱仪检测器，通过callisto1038软件分析所测数据。

实验结果：与漂浮植物凤眼莲共养1周后，凤眼莲¹⁵n丰度达到3.02%，4周后凤眼莲¹⁵n丰度达到3.24%，该丰度值为植物¹⁵n测定的理想阈值，凤眼莲¹⁵n测定时包样量约19000μg，铜绿微囊藻测定时的包样量为3900μg。

实施例2：一种利用¹⁵n标记研究铜绿微囊藻与水浮莲中氮素迁移的方法；

实验方法：1）将铜绿微囊藻投入500ml锥形瓶于光照培养箱中培养，温度为25℃±1℃，光照强度为30µmolphotonsm^-2·s^-1，光周期为12:12，采用bg11培养基静置培养，用na¹⁵no3将培养基中⁵n丰度调节至5%，16天后收集标记的藻细胞。

用于测定藻¹⁵n丰度的藻细胞采用gf/c膜抽滤法收集，取10ml藻液用真空泵抽滤至gf/c膜上，将膜放置冷冻干燥机内冷冻干燥至恒重；用剪刀将干燥的滤膜剪碎成1.5mm的颗粒，保存样品，用稳定同位素质谱仪测定其¹⁵n丰度，根据藻的生物量（cells/l）换算出单位藻细胞中¹⁵n的质量。

2）选用低速离心法收集用于藻和水浮莲间氮素的迁移转化的标记藻细胞，收集的藻细胞需用高质量的去离子水悬浮后，再次离心收集，反复5次，用于水浮莲的共培实验；

3）将¹⁵n标记的铜绿微囊藻与水浮莲共培养与水箱中，标记的藻起始od665为0.3，叶绿素1.14μg/ml，¹⁵n丰度在3.8%～4.2%；培养28天后，监测水浮莲中¹⁵n的丰度。

将待测样品放入锡杯包成球状，然后放入进样盘，使用进样杆推动进样盘使样品进入1000℃氧化管，燃烧产生的气体通过600℃还原管还原为n2，通过化学阱除去h2o和co2，最后通过100℃色谱柱分离后进入同位素质谱仪检测器，通过callisto1038软件分析所测数据。

实验结果：与漂浮植物水浮莲共养1周后，水浮莲¹⁵n丰度达到2.45%，4周后水浮莲¹⁵n丰度达到2.98%，该丰度值为植物¹⁵n测定的理想阈值，水浮莲¹⁵n测定时包样量为22000μg，铜绿微囊藻测定时的包样量为2500μg。

对比试验：采用实施例1和实施例2中相同的方法，在其他实验条件不变的情况下，对本发明的技术方案中部分技术参数进行对比试验，得到的结果如下表所示：

通过上表可知；采用本发明的所述的技术方案，不同藻类和水生植物在采用不同共培调节进行培养时，其最终的迁移效果是不一样的；而且对于共培时藻细胞中¹⁵n的丰度和培养的天数也影响着最终迁移效果的研究，当藻细胞中¹⁵n的丰度超过本发明所限定的范围时，最终水生植物中¹⁵n的含量就会过量，而当藻细胞中¹⁵n的丰度低于本发明所述的范围是，最终水生植物中¹⁵n的含量就会过低，无法精准检测迁移效果；而且培养天数也是限定水生植物中¹⁵n含量测定的一个因素，天数过少，迁移率不够高；天数过多，不仅培养成本过多；而且迁移速率会达到一定的上限，不会继续提高。

需要说明的是，上述仅仅是本发明的较佳实施例，并非用来限定本发明的保护范围，在上述实施例的基础上所做出的任意组合或等同变换均属于本发明的保护范围。