一种超强光声效应的金纳米球/黑色素复合纳米光声探针及其制备的制作方法

本发明涉及肿瘤光声检测领域，尤其是涉及一种超强光声效应的金纳米球/黑色素复合纳米光声探针及其制备。

背景技术：

光声成像是一种新兴的生物检测技术，因其具有较高的空间分辨率和成像深度，能够实时动态成像，且操作简单方便等优点，在临床应用方面拥有巨大潜力。在光声成像测试中，光声探针的信号强度对成像质量起关键性作用，因此对具有超强光声信号的光声探针的研发已得到广泛关注。根据来源划分，光声探针分为内生光声探针和外生光声探针，内生光声探针来源于生物体内，具有较好的生物相容性和较小的生物毒性，外生光声探针要求有高于内生光声探针的信号强度，以获得较好的成像对比度。

中国专利201510884853.0公开了一种基于荧光淬灭效应实现复合探针光声信号增强的方法，并据此方法构建了复合探针并实现了复合探针光声信号的增强。该探针由氧化石墨烯和荧光染料构成。氧化石墨烯作为基底材料既可用于负载染料，又可以通过荧光能量共振转移效应焠灭负载在其表面的染料的荧光。但是该复合探针的生物相容性较差，生物毒性较高，很容易在生物组织中积聚而造成损伤。

技术实现要素：

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种超强光声效应的金纳米球/黑色素复合纳米光声探针及其制备。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

一种超强光声效应的金纳米球/黑色素复合纳米光声探针，由十二氨修饰的金纳米球，以及包裹所述十二氨修饰的金纳米球的黑色素纳米颗粒复合而成，其中，十二氨修饰的金纳米球和黑色素纳米颗粒的质量比为0.1～10:1。

优选的，所述的复合纳米光声探针呈球状的复合纳米颗粒，其粒径为30～300nm。

优选的，所述的复合纳米光声探针中，十二氨修饰的金纳米球的粒径为2-10nm，所述的黑色素纳米颗粒的粒径为30-70nm。

优选的，所述的十二氨修饰的金纳米球通过以下步骤制成：

(a)取四辛基溴化氨和十二氨溶解于甲苯中，再加入氯金酸水溶液，混合均匀；

(b)继续加入冰冷的硼氢化钠，剧烈搅拌；

(c)最后加入不良溶剂乙醇，收集沉淀得到所述十二氨修饰的金纳米球。

更优选的，四辛基溴化氨、十二氨、甲苯、氯金酸、硼氢化钠和乙醇的加入量之比为(0.02-0.03)mmol：(0.04-0.08)mmol：(0.3-0.8)ml：(0.04-0.06)mmol：(0.1-0.3)mmol：(2-5)ml；

步骤(b)中：剧烈搅拌的时间为20-40min。

优选的，黑色素纳米颗粒通过以下步骤制成：

(a)取洗净并晾干的人发置于反应容器内，加入浓盐酸，用带有吸收氯化氢的回流装置，加热回流，冷却透析得到粗制黑色素颗粒；

(b)取粗制黑色素颗粒离心，取其棕色上清液，即为黑色素纳米颗粒的水溶液，冷冻干燥后，得到疏松的黑色素纳米颗粒粉末；

(c)取黑色素纳米颗粒粉末分散于去离子水中，加碱调节ph呈碱性(优选ph＝12)，待溶液澄清后，透析去除碱，即得到所述黑色素纳米颗粒的中性水溶液。

更优选的，步骤(a)中人发与浓盐酸的加入量比为(10-15)mg：(80-120)ml，浓盐酸的浓度为37wt％，加热回流的工艺条件为：温度110-112℃，回流时间为4h；

步骤(c)中加入的碱为0.1m的氢氧化钠水溶液，配置的黑色素纳米颗粒溶液的浓度为0.1-2mg/ml。

超强光声效应的金纳米球/黑色素复合纳米光声探针的制备方法，包括以下步骤：

(1)取十二氨修饰的金纳米球溶于四氢呋喃溶剂中，制得金纳米球溶液；

(2)将配置的金纳米球溶液逐滴加入黑色素纳米颗粒水溶液中，搅拌，得到混合溶液；

(3)将步骤(2)中的混合溶液超声反应，即得到所述金纳米球/黑色素复合纳米光声探针。

优选的，步骤(1)中金纳米球溶液的浓度为0.1-1mg/ml，步骤(2)的黑色素纳米颗粒水溶液的浓度为0.1-2mg/ml。更优选的，碱选用0.1m的氢氧化钠水溶液。

优选的，步骤(2)中搅拌的时间为0.5-6h；

步骤(3)中超声反应的条件为：置于冰水浴中，反应时间5-30min，其中，超声功率100-600w，工作时间1-20s，超声间隙3-10s。

本发明制备的超强光声效应的金纳米球/黑色素复合纳米光声探针，采用具有光声效应的内生光声探针黑色素纳米颗粒和外生光声探针金纳米球复合而成，二者对复合纳米光声探针光声信号的增强皆有贡献。金纳米球作为外生光声探针的优秀代表，其光声信号强，生物惰性高，颗粒的形状及尺寸可调，近红外吸收强度和吸收峰位置可调。通过表面改性，小尺寸金纳米球与光声信号最强的内生光声探针黑色素纳米颗粒(30-70nm)复合，形成具有强光声信号的、直径30-300nm的球状复合纳米光声探针。通过此种纳米结构设计，复合纳米光声探针可在体内有一定循环时间，完成光声成像后可在病灶部位分解，解离的小尺寸金纳米球可通过肾脏代谢，避免在生物组织中积聚以及造成损伤。

与现有技术相比，本发明的复合纳米光声探针在600-950nm脉冲光波辐照下，具有超强光声效应。除了对光声信号的增强有贡献外，来自于生物体的黑色素纳米颗粒具有良好的生物相容性和极低的生物毒性，作为载体将小粒径的金纳米球聚集成30-100nm的颗粒，有利于其在体内循环而阻止金纳米颗粒被细胞吞噬，使其安全有效到达病灶部位，实现成像功能。黑色素对金属具有较强的螯合作用，与金纳米球之间的结合为螯合作用，结合力相对较弱，有望在光照条件下解离，将金纳米球的释放，而5nm级别的小尺寸金纳米球可在体内循环中通过肾脏代谢，避免在生物组织中积聚以及造成损伤。

附图说明

图1为金纳米球的四氢呋喃溶液溶于十倍的去离子水中的透射电子显微镜照片；

图2为黑色素纳米颗粒在去离子水中的透射电子显微镜照片；

图3为黑色素纳米颗粒的场发射扫描电子显微镜照片；

图4为黑色素纳米颗粒的水合粒径分布图；

图5为金纳米球/黑色素复合纳米光声探针的透射电子显微镜照片；

图6为金纳米球/黑色素复合纳米光声探针的场发射扫描电子显微镜照片；

图7为金纳米球/黑色素的复合纳米光声探针的粒径分布图；

图8为浓度为0.1mg/ml的金纳米球/黑色素复合纳米光声探针的光声成像测试结果，其中，左图为在680-960nm脉冲激光照射下光声信号平均值的曲线，右图为其光声成像照片；

图9为金纳米球/黑色素的复合纳米光声探针的粒径分布图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

实施案例中所述的实验方法和实验试剂，如无特别说明，均采用该领域内的常规实验技术，实验试剂均为常规试剂。

实施例1

超强光声效应的金纳米球/黑色素复合纳米光声探针的制备方法，包括以下步骤：

(1)新鲜配制的约5nm的十二氨修饰的金纳米球溶于四氢呋喃溶剂中，配制成浓度为1mg/ml的酒红色的金纳米球溶液。其中，十二氨修饰的金纳米球通过以下方法制成：将0.025mmol的四辛基溴化氨和0.06mmol的十二氨溶解于0.5ml的甲苯，再加入0.053mmol的氯金酸水溶液(浓度为0.5m)，混合均匀，然后加入0.2mmol冰冷的硼氢化钠，剧烈搅拌半小时，最后加入4ml的不良溶剂乙醇，收集沉淀得到尺寸约为5nm的十二氨修饰的金纳米球。图1为1mg/ml金纳米球的四氢呋喃溶液溶于十倍的去离子水中的透射电子显微镜照片，可知，金纳米颗粒尺寸约5nm，1mg/ml金纳米球的四氢呋喃溶液在水中分散性良好，没有团聚，也没有自发聚集成球状。

(2)将黑色素纳米颗粒粉末加入一定量去离子水中，加入0.1m的氢氧化钠水溶液，调节ph值为12，配置成浓度为0.5mg/ml的澄清的水溶液，透析去除氢氧化钠，得到黑色素纳米颗粒的中性水溶液。其中，黑色素纳米颗粒的制备方法为：取洗净并晾干的人发10mg，置于圆底烧瓶中，加入37％浓盐酸100ml，用带有吸收氯化氢的回流装置，在110-112℃加热回流4h，冷却后使用透析膜透析24h，得到粗制的黑色素颗粒。将该黑色素颗粒经10000-14000rpm离心，取其棕色的上清液，该上清液即为30-70nm的黑色素纳米颗粒的水溶液。黑色素水溶液冷冻干燥24h，得到疏松的黑色素纳米颗粒粉末，待用。将黑色素纳米颗粒粉末加入一定量去离子水中，加入0.1m的氢氧化钠水溶液，调节ph值为12，配置成浓度为0.1-2mg/ml的碱性水溶液，使溶液澄清，透析8h，去除碱性的氢氧化钠，得到黑色素纳米颗粒的中性水溶液。(因为黑色素颗粒在酸性环境下容易团聚，在碱性环境下溶解得更好。通常黑色素纳米粉末的重溶使用的是ph值为12的氢氧化钠溶液，碱性氢氧化钠溶解黑色素后，再透析去除氢氧化钠，得到黑色素纳米颗粒中性水溶液)。图2为黑色素纳米颗粒在去离子水中的透射电子显微镜照片，图中显示黑色素纳米颗粒为50nm左右，分散良好。图3为黑色素纳米颗粒的场发射扫描电子显微镜照片，由于制样浓度大，黑色素颗粒紧密堆积在一起。图4为黑色素纳米颗粒的水合粒径分布图，其水合粒径约为30-100nm。由于不同测试制样方法的差异，场发射扫描电子显微镜照片显示的干态的堆积在一起的黑色素纳米颗粒粒径小于水合粒径。

(3)将0.5ml的金纳米球溶液逐滴缓慢加入1ml浓度为0.5mg/ml的黑色素水溶液中，搅拌4h，搅拌速度为450rpm。搅拌结束后，将混合溶液放入探针式超声仪，在冰水浴环境下超声反应10min(超声功率400w，工作时间10s，超声间隙5s)，最终制得目标产物。图5为金纳米球/黑色素复合纳米光声探针的透射电子显微镜照片，照片显示金纳米球/黑色素复合纳米光声探针的粒径为30-300nm，结构为5nm金纳米球被紧凑的包裹在30-100nm的黑色素纳米颗粒中，这是由于金纳米球在黑色素纳米颗粒内部的填充量较大，导致形成的球状复合纳米颗粒体积增大。图6为金纳米球/黑色素复合纳米光声探针的场发射扫描电子显微镜照片，和图3的黑色素纳米颗粒的场发射扫描电子显微镜照片对比，金纳米球/黑色素纳米光声探针的粒径明显大于黑色素纳米颗粒，这是因为干态下，黑色素颗粒和复合纳米颗粒中黑色素部分收缩较大，但是复合颗粒的金纳米球部分没有收缩。图7为金纳米球/黑色素的复合纳米光声探针的粒径分布图，其粒径为30-120nm。图8为浓度为0.1mg/ml的金纳米球/黑色素复合纳米光声探针的光声成像测试结果，左图为在680-960nm脉冲激光照射下光声信号平均值的曲线，右图为其光声成像照片，在选定的0.295mm²面积范围内，平均光声信号对比值为0.549。

实施例2

超强光声效应的金纳米球/黑色素复合纳米光声探针的制备方法，包括以下步骤：

(1)新鲜配制的约5nm的十二氨修饰的金纳米球(制备方法同实施例1)溶于四氢呋喃溶剂中，配制成浓度为1mg/ml的酒红色的金纳米球溶液。

(2)将黑色素粉末(制备方法同实施例1)加入一定量去离子水中，加入0.1m的氢氧化钠水溶液，调节ph值为12，配置成浓度为0.8mg/ml的澄清的水溶液，再透析除去碱性的氢氧化钠，即得到黑色素纳米颗粒的中性水溶液。

(3)将0.5ml的金纳米球溶液逐滴缓慢加入1ml浓度为0.8mg/ml的黑色素纳米颗粒的中性水溶液中，搅拌5h，搅拌速度为450rpm。搅拌结束后，将混合溶液放入探针式超声仪，在冰水浴条件下超声反应8min(超声功率350w，工作时间10s，超声间隙5s)，最终制得目标产物。图9为金纳米球/黑色素的复合纳米光声探针的粒径分布图，其粒径为70-300nm。

实施例3

(1)新鲜配制的约5nm的十二氨修饰的金纳米球(制备方法同实施例1)溶于四氢呋喃溶剂中，配制成浓度为0.5mg/ml的酒红色的金纳米球溶液。

(2)将黑色素粉末(制备方法同实施例1)加入一定量去离子水中，加入0.1m的氢氧化钠水溶液，调节ph值为12，配置成浓度为0.1mg/ml的澄清的水溶液，再透析除去碱性的氢氧化钠，即得到黑色素纳米颗粒的中性水溶液。

(3)将0.5ml的金纳米球溶液逐滴缓慢加入1ml浓度为0.1mg/ml的黑色素纳米颗粒的中性水溶液中，搅拌6h，搅拌速度为600rpm。搅拌结束后，将混合溶液放入探针式超声仪，在冰水浴中超声反应30min(超声功率100w，工作时间20s，超声间隙10s)，最终制得目标产物。

实施例4

(1)新鲜配制的约5nm的十二氨修饰的金纳米球(制备方法同实施例1)溶于四氢呋喃溶剂中，配制成浓度为0.1mg/ml的酒红色的金纳米球溶液。

(2)将黑色素粉末(制备方法同实施例1)加入一定量去离子水中，加入0.1m的氢氧化钠水溶液，调节ph值为12，配置成浓度为0.1mg/ml的澄清的水溶液，再透析除去碱性的氢氧化钠，即得到黑色素纳米颗粒的中性水溶液。

(3)将金纳米球溶液逐滴缓慢加入浓度为0.1mg/ml的黑色素纳米颗粒中性水溶液中，使得金纳米球和黑色素纳米颗粒的质量比为0.1:1，搅拌0.5h，搅拌速度为200rpm。搅拌结束后，将混合溶液放入探针式超声仪，在冰水浴中超声反应5min(超声功率100w，工作时间1s，超声间隙3s)，最终制得目标产物。

实施例5

(1)新鲜配制的约5nm的十二氨修饰的金纳米球(制备方法同实施例1)溶于四氢呋喃溶剂中，配制成浓度为0.6mg/ml的酒红色的金纳米球溶液。

(2)将黑色素粉末(制备方法同实施例1)加入一定量去离子水中，加入0.1m的氢氧化钠水溶液，调节ph值为12，配置成浓度为2mg/ml的澄清的水溶液，黑色素纳米颗粒的中性水溶液。

(3)将金纳米球溶液逐滴缓慢加入浓度为2mg/ml的黑色素纳米颗粒中性水溶液中，使得金纳米球和黑色素纳米颗粒的质量比为10:1，搅拌6h，搅拌速度为500rpm。搅拌结束后，将混合溶液放入探针式超声仪，在冰水浴中超声反应20min(超声功率250w，工作时间12s，超声间隙5s)，最终制得目标产物。

实施例6

与实施例1相比，绝大部分都一样，除了十二氨修饰的金纳米球的制备方法改为按以下步骤制成：

将0.02mmol的四辛基溴化氨和0.04mmol的十二氨溶解于0.3ml的甲苯，再加入0.04mmol的氯金酸水溶液(浓度为0.5m)，混合均匀，然后加入0.1mmol冰冷的硼氢化钠，剧烈搅拌半小时，最后加入2ml的不良溶剂乙醇，收集沉淀得到尺寸约为5nm的十二氨修饰的金纳米球。

实施例7

与实施例1相比，绝大部分都一样，除了十二氨修饰的金纳米球的制备方法改为按以下步骤制成：

将0.03mmol的四辛基溴化氨和0.08mmol的十二氨溶解于0.8ml的甲苯，再加入0.06mmol的氯金酸水溶液(浓度为0.5m)，混合均匀，然后加入0.3mmol冰冷的硼氢化钠，剧烈搅拌半小时，最后加入5ml的不良溶剂乙醇，收集沉淀得到尺寸约为5nm的十二氨修饰的金纳米球。

实施例8

与实施例1相比，绝大部分都一样，除了黑色素粉末的制备方法改为按以下步骤制成：

取洗净并晾干的人发12mg，置于圆底烧瓶中，加入37％浓盐酸80ml，用带有吸收氯化氢的回流装置，在110℃加热回流4h，冷却后使用透析膜透析24h，得到粗制的黑色素颗粒。将该黑色素颗粒经10000rpm离心，取其棕色的上清液，该上清液即为30-70nm的黑色素纳米颗粒的水溶液。黑色素纳米颗粒的水溶液冷冻干燥24h，得到疏松的黑色素粉末，待用。

实施例9

与实施例1相比，绝大部分都一样，除了黑色素粉末的制备方法改为按以下步骤制成：

取洗净并晾干的人发15mg，置于圆底烧瓶中，加入37％浓盐酸120ml，用带有吸收氯化氢的回流装置，在112℃加热回流4h，冷却后使用透析膜透析24h，得到粗制的黑色素颗粒。将该黑色素颗粒经14000rpm离心，取其棕色的上清液，该上清液即为30-70nm的黑色素纳米颗粒的水溶液。黑色素纳米颗粒的水溶液冷冻干燥24h，得到疏松的黑色素粉末，待用。

实施例10

与实施例1相比，绝大部分都一样，除了黑色素粉末的制备方法改为按以下步骤制成：

取洗净并晾干的人发10mg，置于圆底烧瓶中，加入37％浓盐酸100ml，用带有吸收氯化氢的回流装置，在111℃加热回流4h，冷却后使用透析膜透析24h，得到粗制的黑色素颗粒。将该黑色素颗粒经12000rpm离心，取其棕色的上清液，该上清液即为30-70nm的黑色素纳米颗粒的水溶液。黑色素纳米颗粒的水溶液冷冻干燥24h，得到疏松的黑色素粉末，待用。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。