GP73的新用途及一种基于其的肝组织炎症活动度检测试剂盒的制作方法

本发明属于生物医学领域，涉及高尔基体蛋白73(gp73)的新用途，以及基于检测高尔基体蛋白73(gp73)的浓度而制备的肝组织炎症活动度检测试剂盒。

背景技术：

kladney等在研究成人巨细胞肝炎时发现了高尔基体蛋白73(gp73)，至今已有17年(kladneyrd,bullaga,guol,etal.gene.2000.249(1-2):53-65)，gp73是一个有402个氨基酸、相对分子量为73kda的跨膜糖蛋白，又称为ii型高尔基体膜蛋白(golgiphosphoprotein2，golph2)和高尔基体膜蛋白i(golgimembraneprotein1，golm1)。它通常位于反式高尔基复合体中，编码gp73蛋白的基因位于第9号染色体，全长共3080个核苷酸，编码区位于199-1404nt，gp73在多种组织中均有表达，但强弱不等，在小肠、结肠以及胃中呈高表达，而在心脏中表达最少，在肝、肾、脾、肺、子宫及睾丸表达很弱，gp73表达于正常肝脏组织的胆管上皮细胞，在正常肝细胞中几乎不表达。kladney等在随后的研究中发现，在病毒(hbv及hcv)感染和非病毒原因(酒精性肝病及自身免疫性肝炎)引起的肝病患者(慢性乙型肝炎、慢性丙型肝炎、酒精性肝组织炎症活动度及自身免疫性肝炎导致的肝组织炎症活动度)组织中gp73水平均显著上调，高于正常肝组织70倍，而肝病组之间的差异无统计学意义。kladney等的进一步研究表明，gp73在正常肝组织中呈低表达，在多种原因(病毒相关性、酒精性或自身免疫性)导致的肝脏疾病中gp73表达水平均显著升高，此时，胆管上皮细胞中gp73的表达变化并不明显，而受损肝细胞较患病前显著表达gp73，表明肝病中gp73的高表达是肝细胞中gp73表达上调的结果，这是gp73应用于肝脏疾病领域的病理基础(kladneyrd,cuix,bullaga,bruntem,fimmelcj.hepatology.2002.35(6):1431-40.)。block等的研究是将gp73应用于肝癌临床领域的重要一步(blocktm,comunalema,lowmanm,etal.procnatlacadsciusa.2005.102(3):779-84.)，他们在2005年研究血清gp73在土拨鼠中的表达关系时发现，gp73浓度在患肝癌土拨鼠中显著高于非肝癌土拨鼠，进而研究gp73在人肝癌中的表达也得出了相同的结论。

综上文献所述及我们的研究发现，gp73对将肝癌与肝炎、肝硬化患者区分的区分能力不及afp的效果好，只是其诊断肝硬化的灵敏性高于血清afp。

临床对于肝炎的诊断，现在常用alt(全名丙氨酸转氨酶)和ast(全名天冬氨酸转氨酶)。alt与ast主要分布在肝细胞内，alt和ast升高，说明肝细胞受损。alt最为敏感。血清中的alt增加1倍表明1％肝细胞坏死。通常情况下alt和ast升高程度与肝细胞受损程度相一致。这两种酶在肝细胞内分布是不同。alt主要分布在肝细胞浆，alt升高反映了肝细胞膜的损伤；ast主要分布在肝细胞浆和肝细胞线粒体。因此不同的肝炎情况所出现的alt、ast升高情况是不同的。alt/ast的比值也是不同的。

既往有乙型肝炎或hbsag携带史或急性肝炎病程超过半年，而且目前仍有肝炎症状、体征及肝功能异常者可以诊断为慢性肝炎，有可能转为肝硬化或肝癌。对于发病日期不明或虽无肝炎病史，但影像学、腹腔镜或肝活体组织病理符合慢性肝炎改变，或根据症状、体征、化验综合分析亦可作出相应诊断。从肝功能损害程度角度，临床划分为轻度、中度和重度，其划分标准如下：1.轻度：病情较轻，症状不明显或虽有症状、体征，生化指标仅1～2项轻度异常者。2·重度：有明显或持续的肝炎症状，如乏力、纳差、腹胀、便溏等。可伴有肝病面容、肝掌、蜘蛛痣或肝脾肿大而排除其他原因且无门脉高压征者。实验室检查血清alt反复或持续升高，白蛋白减低或a/g比例异常、丙种球蛋白明显升高，凡白蛋白≤32g/l、胆红素>85.5umol/l、凝血酶原活动度40％～60％三项检测中有一项达商数程度者即可诊断为重度慢性肝炎。3.中度：症状、体征、实验室检查居于轻度和重度之间者。相应地，从alt、ast指标出发，一般情况下，急性、慢性轻型肝炎中肝细胞均有损伤，但是线粒体是完整的，所以检查alt升高，alt/ast>1。重型肝炎和慢性肝炎中，中期细胞线粒体遭到破坏，则会出现ast升高，ast/alt>1的情况。此时经常出现alt呈正常的情况。

目前临床上缺乏判断并确定肝组织炎症活动度的合适的诊断指标。需求主要存在如下三种情况：1)中度、重度肝脏炎症是慢性肝病肝损伤的主要因素，一旦确定应予以积极治疗，故中、重度肝脏炎症的诊断及程度的判定需要灵敏、特异、可量化的血清学指标；2)alt是临床上反映肝细胞损伤一个重要指标，有一定比例的慢性肝病患存在明显的肝脏炎症，但alt却正常，无通过alt法判断肝组织炎症活动度的情况；3)对于病毒性肝炎，采取抗病毒治疗后，缺乏判断肝组织炎症活动度是否得到控制/改善的灵敏、特异的判定指标。

目前，临床主要使用的指标是肝组织炎症活动度，其水平按g0、g1、g2、g3、g4进行分级，具体见后文表1。随着肝组织破坏进展，肝组织炎症活动度水平分级会趋于上升；但随着肝组织病情的缓解，肝组织炎症活动度水平分级会趋于下降。

很多文献对肝组织炎症活动度的临床诊断进行研究探讨，如“慢性乙肝患者血清alt水平与肝组织炎症活动度相关性分析”，陶森，赵强，《中华中西医杂志》，2007，和“血清肝纤维化标志物水平与肝组织炎症活动度纤维化程度的相关性分析”，许爱民等，《临床肝胆病杂志》,2005,21(3):175-176，“慢性乙型肝炎患者肝组织炎症活动度的临床诊断与治疗”，曹弘,汪铮,苏婷婷，《中华医院感染学杂志》，2014年，17期，“慢性乙型肝炎患者血丙氨酸氨基转移酶诊断肝组织炎症活动度的临床价值”，王冰,《中国处方药》，2014年，10期等。但是仍未找到合适的标记物来指示肝组织炎症活动度水平及分级。

现在，还没有通过血清检测而不是通过组织检测肝组织炎症活动度的灵敏、高效的方法。因此，急需开发这样一种检测试剂盒。

技术实现要素：

对于上述三种情况：1)中度、重度肝脏炎症是慢性肝病肝损伤的主要因素，一旦确定应予以积极治疗，故中、重度肝脏炎症的诊断及程度的判定需要灵敏、特异、可量化的血清学指标；2)alt是临床上反映肝细胞损伤一个重要指标，有一定比例的慢性肝病患存在明显的肝脏炎症，但alt却正常，无通过alt法判断肝组织炎症活动度的情况；3)对于病毒性肝炎，采取抗病毒治疗后，缺乏判断肝组织炎症活动度是否得到控制/改善的灵敏、特异的判定指标，现在还没有通过血清检测而不是通过组织检测肝组织炎症活动度的灵敏、高效的方法，而取肝组织活检检测总归会给受试者带来创伤，因此，为减少肝组织损伤，急需开发这样一种检测检测肝组织炎症活动度并分级指导治疗及治疗后效果的血清检测试剂盒。

因此，本发明涉及gp73浓度用于肝组织炎症活动度检测的用途，提供了一种肝组织炎症活动度检测试剂盒，其利用血清中的gp73浓度可实现对受试者的肝组织炎症活动度的检测分级，而且可适用中度炎症坏死以上且alt正常的患者，以及采取抗病毒治疗的病毒性肝炎患者。

具体的，本发明一方面技术方案涉及gp73浓度用于肝组织炎症活动度检测的用途，其中所述gp73浓度为血清gp73浓度，并能够实现对受试者的肝组织炎症活动度的检测并分级为轻度、中度和重度，其中轻度为肝组织炎症活动度分级≥1且<2，中度为肝组织炎症活动度分级≥2且<3，重度为肝组织炎症活动度分级≥3。

具体地，在所述gp73浓度为40-57ng/ml的范围判断受试者有轻度肝组织炎症坏死，57ng-94ng的范围判断受试者有中度肝组织炎症坏死，94ng/ml以上的范围判断受试者有重度肝组织炎症坏死。

具体地，所述受试者为病毒性肝炎、自身免疫性肝病、其他病因肝病的患者，所述其他病因肝病包括非酒精性脂肪肝、药物性肝病及病因不明的肝病。

具体地，所述患者具有正常范围内的alt值以及中度以上肝组织炎症坏死。

具体地，所述用途包括判断治疗后受试者的肝组织炎症活动度的改善，通过治疗后所述gp73浓度相对治疗前下降20％以上判断为疾病受到控制或抑制。

本发明另一方面提供了一种肝组织炎症活动度检测试剂盒的技术方案，其中，基于血清中的gp73浓度检测受试者的肝组织炎症活动度，并分级为轻度、中度和重度，其中轻度为肝组织炎症活动度分级≥1且<2，缩写表示为g0-1，中度为肝组织炎症活动度分级≥2且<3，缩写表示为g2，重度为肝组织炎症活动度分级≥3，缩写表示为g3/4。

具体地，在所述gp73浓度为40-57ng/ml的范围判断受试者有轻度肝组织炎症坏死，57ng-94ng的范围判断受试者有中度肝组织炎症坏死，94ng/ml以上的范围判断受试者有重度肝组织炎症坏死。

具体地，所述肝组织炎症活动度检测试剂盒适用于患有病毒性肝炎、自身免疫性肝病、其他病因肝病的受试者，所述其他病因肝病包括非酒精性脂肪肝、药物性肝病及病因不明的肝病。

具体地，所述肝组织炎症活动度检测试剂盒适用于alt值在正常范围内的患有中度以上肝组织炎症坏死的受试者。

具体地，所述肝组织炎症活动度检测试剂盒适用于抗病毒治疗后的肝炎患者的受试者。

具体地，所述肝组织炎症活动度检测试剂盒可用于判断治疗后肝组织炎症活动度的改善，通过治疗后所述gp73浓度相对治疗前下降20％以上判断为疾病受到控制或抑制。

本发明实现了下述效果，包括但不限于：

1)通过血清检测gp73而不是通过组织检测gp73，是一种检测肝组织炎症活动度的灵敏、高效的方法，它更为快捷方便，可靠，具有临床指导意义，值得推广。其快捷方便性体现为活检获取组织gp73会给受试者带来远超过皮肤的创伤，修复活检后组织损伤对于本有炎症的肝脏是雪上加霜，而取血提取血清技术成熟，创面恢复快。其可靠性体现为血清gp73提供与组织gp73一致的信息,因为组织gp73是前体，血清gp73是furin酶切加工后产物，因此两者均与肝组织炎症的活动度相关性。

2)通过可量化指标肝组织炎症活动度的检测并分级，针对中度、重度肝炎实现灵敏、高效的诊断，确定受试者处于何种病情发展阶段，而进行相应治疗；

3)对alt指标正常、无法判断肝组织炎症活动度的慢性肝炎患者，通过可量化指标肝组织炎症活动度的检测，从而实现灵敏、高效的诊断；

4)对于病毒性肝炎，采取抗病毒治疗后，通过可量化指标肝组织炎症活动度的检测，灵敏、高效地判断治疗效果。

附图说明

图1为血清gp73在不同程度肝组织炎症活动度的表达水平及相关性，图1(a)和(b)为纳入人群，图1(c)和(d)为病毒性肝炎患者，图1(e)和(f)为自身免疫性肝病患者，图1(g)和(h)为其他病因(非酒精性脂肪肝、药物性肝病及病因不明的肝病)肝病患者。横轴为炎症活动度，纵轴为血清gp73浓度。

图2为gp73对肝组织炎症活动度的roc曲线。

图3显示血清gp73与alt在中度以上炎症坏死(g≥2)且alt正常的患者中水平。

图4显示依据肝组织炎症活动度是否改善分组，比较患者抗病毒治疗前后gp73浓度变化情况。

具体实施方式

如下通过实施方案结合数据图表对本发明进行详细介绍，其保护范围包括但不限于权利要求所要求保护的内容，数据范围也可相应进行本领域技术人员能理解的修改及调整。

下面通过具体实施方式及实验数据对本发明作进一步的说明。尽管为了清楚的目的，在下文中使用了专用术语，但这些术语并不意味着定义或限制本发明的范围。

如本文中所使用，术语“肝组织炎症活动度”和“肝组织炎症活动炎症程度”可互换使用，肝组织炎症活动度分级的缩写为g，下表为具体分级为0-4的对应病理诊断标准。

表1肝组织炎症活动度的病理诊断标准

如本文中所使用，术语“轻度”与“肝组织炎症活动度分级≥1且<2”互换使用，缩写表示为g0-1或g1；“中度”与“肝组织炎症活动度分级≥2且<3”互换使用，指缩写表示为g2；“重度”与“肝组织炎症活动度分级≥3”互换使用，缩写表示为g3/4，即g3和g4。由此，术语“轻度”、“中度”和“重度”具体参照上表病理诊断标准。

如本文中所使用，术语“灵敏度”也叫“真阳性率”，指代实际有病而按试验标准被正确判断为有病的百分率，灵敏度越大越好，理想灵敏度为100％，

如本文中所使用，术语“特异性”也叫“真阴性率”，指代实际无病而按试验标准被正确判断为无病的百分率，特异度越大越好，理想特异度为100％。

受试者工作特征(receiver(relative)operatingcharacteristic,roc)反映了灵敏度与特异度间的平衡，roc曲线下面积是重要的试验准确度指标。分别计算各个试验的roc由线下的面积(aucroc)进行比较，面积大者，试验的诊断价值大。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可以从商业途径买到。

实施例1试验设计

1.1研究对象

2013年12月到2016年12月就诊于北京302医院的行b超引导下的肝脏穿刺术的642名慢性肝病患者。

1.2统计学方法

应用spss21.0(spss，chicago，illinois，usa)统计软件进行统计学分析，连续变量根据其分布特征选择描述方法，近似服从正态分布的定量资料采用x±s表示，呈偏态分布的定量资料采用中位数(m)及四分位间距描述其分布特征，定性资料组间比较采用χ2检验，两独立样本间比较采用mann-whitnyu检验，多组样本之间采用kruskalwallis检验。建立受试者工作特征曲线(roc曲线)，根据曲线下面积比较不同指标对肝组织炎症活动度的评估价值，以为α＝0.05检验水准。

1.3样本的基线资料

本样本共纳入患者642例，包括266例病毒性肝炎，158例自身免疫性肝病及218例其他(酒精性脂肪肝、药物性肝病及病因不明的肝病患者)病因患者。病毒性肝炎、自身免疫性肝病以及其他病因的慢性肝病的平均年龄分别为41.27±11.47岁，48.46±10.33岁和44.20±11.94岁，见表2。

表2研究对象的的一般情况

注：gp73是高尔基体蛋白73；alt是谷丙转氨酶；ast是谷草转氨酶。

实施例2试验结果分析

2.1血清gp73、alt、ast在不同程度肝组织炎症活动度的表达水平

以四分位间距描述血清gp73，alt与ast在不同程度肝组织炎症活动度的变化趋势。血清gp73在不同程度肝组织炎症活动度的水平分别为g0-1(n＝241)：41.43(24.34-58.08)ng/ml；g2(n＝239)：69.26(45.66-115.38)ng/ml；g3/4(n＝46)：122.54(72.19-186.51)ng/ml；spearman相关性分析显示血清gp73和肝组织炎症活动度显著相关(spearman相关系数r＝0.609，p<0.001)。分病因分析结果显示，血清gp73在病毒性肝炎、自身免疫性肝病以及其他病因的慢性肝病患者中都随肝组织炎症活动度的加重而升高，且与肝组织炎症活动度成显著正相关，参见图1和下表3。

表3gp73、alt、ast在不同肝组织炎症活动度患者中的四分位间距

2.2血清gp73对肝组织炎症活动度的区分价值

以病理诊断结果为金标准运用roc曲线分别计算血清gp73对肝脏中度炎症坏死(g≥2且<3)及重度炎症坏死(g≥3)的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、假阳性率、youden指数，并计算其最佳诊断值，结果显示血清高尔基体蛋白73(gp73)对肝脏中度炎症坏死(g≥2且<3)及重度炎症坏死(g≥3)的roc曲线下面积分别为0.822(95％ci：0.793-0.849，p<0.001)，0.832(95％ci：0.804-0.858,p<0.001)；对alt正常的患者，血清gp73对肝脏中度炎症坏死(g≥2且<3)及重度炎症坏死(g≥3)的roc曲线下面积分别为0.763(95％ci：0.708-0.813，p<0.001)，0.801(95％ci：0.748-0.847,p<0.001)；对不同病因(病毒性肝炎、自身免疫性肝病及其他病因)引起的肝组织炎症活动度均具有较好的区分价值。参见图2和下表4。

表4血清gp73对肝组织炎症活动度诊断价值的比较

2.3血清gp73在中度以上炎症坏死(g≥2)无论alt正常还是升高的患者中升高比例均高于alt

经统计学处理，在642例慢性肝病患者中，401例(62.5％)患者有中度及以上炎症坏死(g≥2)。401例中度及以上炎症坏死患者中347例(86.5％)患者血清gp73(gp73＞40)升高，263例(65.6％)患者alt升高(alt＞40)，在138例中度及以上炎症坏死且alt正常的患者中有112例(81.2％)血清gp73升高。

此数据体现对于中度炎症坏死中血清gp73对于检测的灵敏度高于血清alt。

2.4血清gp73可以作为治疗后肝组织炎症活动度得到控制或抑制的判断指标

依据治疗前后肝组织炎症活动度是否改善将慢性乙型肝炎患者抗病毒治疗队列的患者分为进展组(n＝11)、不变组(n＝31)和改善组(n＝40)，结果如图4所示：炎症进展组患者治疗前后gp73浓度差别无统计学意义(p＝0.062)，炎症改善组及不变组患者gp73浓度均降低(p＝0.017,p<0.001)。数据参见下表5。

表5血清gp73在抗病毒治疗前后的比较

改善是炎症受到抑制，不变是炎症得到控制。

以上，基于本发明的实施方式进行了说明，但本发明不限定于此，本领域的技术人员应该明白，在本发明的主旨的范围内能够以进行变形和变更的方式实施，这样的变形和变更的方式，理应属于本发明的保护范围。