一种利用重组荧光藻胆蛋白亚基的检测试剂条及其制备方法与流程

本发明涉及试剂条的制备技术领域，尤其涉及一种利用重组荧光藻胆蛋白亚基的检测试剂条及其制备方法。

背景技术：

藻胆蛋白是一种来源于藻类的，具有特定荧光特性的蛋白质。主要包括藻蓝蛋白，藻红蛋白，别藻蓝蛋白。天然的藻胆蛋白在藻类细胞中以藻胆体的形式存在。许多分子量接近的藻胆蛋白亚基构成分量最高达百万级道尔顿的超级分子——藻胆体。主要存在于类囊体表面上，起到接受光能的作用。

由于具有可溶性好，荧光量子产率高，斯托克位移较大，且与生物材料本身的荧光本底差别明显等优点，藻胆蛋白在荧光检测方面具有较好的应用前景。目前藻胆蛋白标记的抗体主要应用在流式细胞检测方面。通过藻胆蛋白与单克隆抗体进行化学连接，用于细胞分选、周期测定等检测。

目前藻胆蛋白荧光抗体的制备主要利用化学交联的方法，具体是指利用双功能交联试剂，将纯化后的藻胆蛋白和单克隆抗体进行巯基化后，利用二硫键将两者结合在一起。目前主要技术掌握在国外试剂巨头手中。因此标记后的单抗价格较高，不适于大规模的推广应用。同时，由于化学交联需要用到多种化学试剂，标记的过程中会对抗体的表面位点造成影响，从而导致标记的抗体效价降低。

胶体金试剂条具有检测方便快捷，不需要仪器设备等特点，因此在医学快速检测方面应用广泛。但是胶体金本身的制备过程较为繁琐，需要多种化学试剂，对环境存在一定的污染。同时，胶体金试剂条使用之后主要采用抛弃的方式处理，目前还不能对其中的胶体金颗粒进行回收使用，造成环境的二次污染。

技术实现要素：

鉴于此，有必要提供一种环境友好型的利用重组荧光藻胆蛋白亚基的检测试剂条及其制备方法。

一种利用重组荧光藻胆蛋白亚基的检测试剂条，包括依次层叠的无荧光底板、第一无荧光滤纸、检测蛋白结合膜、荧光样品垫和第二无荧光滤纸，其中，所述检测蛋白结合膜上设有检测线和对照线，所述检测线上标记检测抗体，所述对照线上标记对照抗体，所述荧光样品垫包括玻璃纤维膜和覆盖在所述玻璃纤维膜上的融合有链霉亲和素的藻胆蛋白亚基与生物素化的检测抗体的混合物。

在其中一个实施例中，所述融合有链霉亲和素的藻胆蛋白亚基的蛋白浓度为1-2mg/ml。

在其中一个实施例中，所述生物素化的检测抗体的浓度为2-3mg/ml。

在其中一个实施例中，其特征在于，所述检测试剂条的宽度为0.5-0.8mm。

一种利用重组荧光藻胆蛋白亚基的检测试剂条的制备方法，包括如下步骤：

将制备的融合有链霉亲和素的藻胆蛋白亚基与生物素化的检测抗体的混合物，孵育后得到荧光探针，放置于4-8℃，备用；

将所述荧光探针均匀喷洒在玻璃纤维膜上，并干燥，得到荧光样品垫；

在蛋白结合膜上，通过划线形成检测线和对照线，所述检测线上标记检测抗体，所述对照线上标记对照抗体，得到检测蛋白结合膜；

按照第一无荧光滤纸、所述荧光样品垫、所述检测蛋白结合膜、第二无荧光滤纸的顺序黏贴在无荧光底板上，切割后得到所述检测试剂条。

在其中一个实施例中，所述生物素化的检测抗体为生物素化的兔抗灿烂弧菌抗体，将制备的融合有链霉亲和素的藻胆蛋白亚基与生物素化的检测抗体的混合物，孵育后得到荧光探针，放置于4-8℃，备用的步骤中，将制备的融合有链霉亲和素的藻胆蛋白亚基与生物素化的兔抗灿烂弧菌抗体的混合物，于20-25℃，孵育10-15min后得到荧光探针，放置于4-8℃，备用。

在其中一个实施例中，所述融合有链霉亲和素的藻胆蛋白亚基与生物素化的兔抗灿烂弧菌抗体的混合物中，所述融合有链霉亲和素的藻胆蛋白亚基的浓度为1-2mg/ml，所述兔抗灿烂弧菌抗体的浓度为2-3mg/ml。

在其中一个实施例中，将所述荧光探针均匀喷洒在玻璃纤维膜上，并干燥，得到荧光样品垫的步骤中，将所述荧光探针按照1-1.5ml/min的速度均匀喷洒在玻璃纤维膜上，于10-15℃固定30-45min，并于20-25℃干燥备用。

在其中一个实施例中，将制备的兔源灿烂弧菌抗体用抗体稀释液稀释后，按照1-2mg/ml，利用自动划线机按照1-1.5m/min在检测线t线处划线，将羊抗兔二抗利用自动划线机按照1-1.5m/min在对照线c线处划线。

在其中一个实施例中，所述抗体稀释液为碳酸盐缓冲液或磷酸盐缓冲液。

上述利用重组荧光藻胆蛋白亚基的检测试剂条，可以对肿瘤、微生物感染等疾病抗原或抗体的进行定性检测。由于融合链霉亲和素的藻胆蛋白亚基与抗体的结合比例可以明确界定，所以也可以实现定量检测，从而实现疾病早期检测。上述利用重组荧光藻胆蛋白亚基的检测试剂条，利用重组荧光藻胆蛋白亚基代替胶体金制备试剂条，可以实现试剂条制备过程的绿色环保，由于试剂条所使用的重组荧光藻胆蛋白亚基是环境友好型的，使用后不会对环境造成二次污染。

上述利用重组荧光藻胆蛋白亚基的检测试剂条的制备方法，利用原核重组，组合表达的方式制备重组藻胆蛋白亚基具有分子量均一，纯化制备成本低廉等优点，再基于抗原抗体结合的原理，制备了基于重组藻胆蛋白的快速检测试剂条，制备过程绿色环保，成本低廉。

附图说明

图1为一实施方式的利用重组荧光藻胆蛋白亚基的检测试剂条的结构示意图；

图2为一实施方式的利用重组荧光藻胆蛋白亚基的检测试剂条的制备方法的流程图；

图3为采用260-280nm紫外灯照射利用重组荧光藻胆蛋白亚基的检测试剂条的结果图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明，应当理解，此处所描述的具体实例仅以解释本发明，并不用于限定本发明。

请参考图1，一实施方式的利用重组荧光藻胆蛋白亚基的检测试剂条100，包括依次层叠的无荧光底板10、第一无荧光滤纸20、检测蛋白结合膜30、荧光样品垫40和第二无荧光滤纸50。

其中，检测蛋白结合膜30上设有检测线32和对照线34，检测线32上标记检测抗体，对照线34上标记对照抗体。

具体的，检测抗体可以为兔抗灿烂弧菌抗体。在其他实施方式中，检测线上标记的检测抗体类型根据检测需求，还可以为用于疾病、病原菌、病毒等病原微生物检测的所有已知或商品化的抗体。对照线上标记的抗体类型还可以为抗藻蓝蛋白抗体；此时，检测抗体与对照抗体的浓度和比例通过抗体结合能力测试确定。对照抗体可以为抗链霉亲和素抗体。

荧光样品垫40包括玻璃纤维膜和覆盖在玻璃纤维膜上的融合有链霉亲和素的藻胆蛋白亚基与生物素化的检测抗体的混合物。

融合有链霉亲和素的藻胆蛋白亚基与生物素化的检测抗体的混合物中，融合有链霉亲和素的藻胆蛋白亚基的蛋白浓度可以为1-2mg/ml，生物素化的检测抗体的浓度可以为2-3mg/ml。

生物素化的检测抗体可以为生物素化的兔抗灿烂弧菌抗体。生物素化的检测抗体还可以为其他用于疾病、病原菌、病毒等病原微生物检测的所有已知或商品化的抗体，此时，生物素化的检测抗体与链霉亲和素藻胆蛋白的浓度和比例通过抗体结合能力测试确定。

检测试剂条的宽度可以为0.5-0.8mm。

上述利用重组荧光藻胆蛋白亚基的检测试剂条100，可以对肿瘤、微生物感染等疾病抗原或抗体的进行定性检测。由于融合链霉亲和素的藻胆蛋白亚基与抗体的结合比例可以明确界定，所以也可以实现定量检测，从而实现疾病早期检测。上述利用重组荧光藻胆蛋白亚基的检测试剂条100，利用重组荧光藻胆蛋白亚基代替胶体金制备试剂条，可以实现试剂条制备过程的绿色环保，由于试剂条所使用的重组荧光藻胆蛋白亚基是环境友好型的，使用后不会对环境造成二次污染。

请参考图2，一种利用重组荧光藻胆蛋白亚基的检测试剂条的制备方法，包括如下步骤：

s10、将制备的融合有链霉亲和素的藻胆蛋白亚基与生物素化的检测抗体的混合物，孵育后得到荧光探针，放置于4-8℃，备用。

重组荧光藻胆蛋白亚基为重组藻蓝蛋白、重组藻红蛋白和重组别藻蓝蛋白亚基中的一种或几种。重组荧光藻胆蛋白亚基通过重组发酵制备的方法获得。

具体的，重组荧光藻胆蛋白亚基通过如下方法制备：

(1)用基因工程的方法，将藻蓝蛋白类脱辅基蛋白亚基基因(cpca)或其同源或类似基因与核心链霉亲和素基因(sa)或其同源或其他标签基因利用蛋白linker连接，与藻蓝蛋白裂合异构酶e和f编码基因(cpce和cpcf)或其同源基因克隆至同一启动子下；将血红素加氧酶1基因(hox1)或其同源基因、藻蓝素铁氧还蛋白还原酶基因(pcya)或其同源基因置于另一启动子下，构建表达质粒pac；

(2)将步骤(1)的表达质粒pac转入相应的宿主菌，得到工程菌株bac；利用常规的发酵工程方法培养，利用优化的诱导条件进行重组蛋白的诱导表达，采用优化的制备方法进行融合蛋白的纯化制备；

其中，步骤(2)的诱导条件为，诱导剂为iptg、乳糖、半乳糖中的一种或两种以上，诱导剂的终浓度为0.1～5.5mmol/l，诱导温度为18～25℃，诱导时间为8～24h。步骤(2)的蛋白纯化制备方法为，冰浴超声破碎、硫酸铵分级沉淀，蛋白亲和层析柱纯化。

生物素化的检测抗体可以为生物素化的兔抗灿烂弧菌抗体。此时，步骤s10中，将制备的融合有链霉亲和素的藻胆蛋白亚基与生物素化的兔抗灿烂弧菌抗体的混合物，于20-25℃，孵育10-15min后得到荧光探针，放置于4-8℃，备用。融合有链霉亲和素的藻胆蛋白亚基与生物素化的兔抗灿烂弧菌抗体的混合物中，融合有链霉亲和素的藻胆蛋白亚基的浓度为1-2mg/ml，兔抗灿烂弧菌抗体的浓度为2-3mg/ml。

生物素化的检测抗体还可以为其他用于疾病、病原菌、病毒等病原微生物检测的所有已知或商品化的抗体，此时，步骤s10中，生物素化的检测抗体与链霉亲和素藻胆蛋白的浓度和比例通过抗体结合能力测试确定。

s20、将荧光探针均匀喷洒在玻璃纤维膜上，并干燥，得到荧光样品垫。

步骤s20中，荧光探针的喷洒速度可以为0.5-2ml/min。干燥的操作可以为保持在温度10-40℃，风干至含水量0.1-0.5％。

生物素化的抗体为生物素化的兔抗灿烂弧菌抗体时，步骤s20中，将s10制备的荧光探针按照1-1.5ml/min的速度均匀喷洒在玻璃纤维膜上，于10-15℃固定30-45min，并于20-25℃干燥备用。

s30、在蛋白结合膜上，通过划线形成检测线和对照线，检测线上标记检测抗体，对照线上标记对照抗体，得到检测蛋白结合膜。

具体的，检测抗体可以为兔抗灿烂弧菌抗体。检测线上标记的检测抗体类型根据检测需求，还可以为用于疾病、病原菌、病毒等病原微生物检测的所有已知或商品化的抗体；对照线上标记的抗体类型还可以为抗藻蓝蛋白抗体；此时，步骤s30中，检测抗体与对照抗体的浓度和比例通过抗体结合能力测试确定。

对照抗体可以为抗链霉亲和素抗体。

非特异的，s30中所述的蛋白结合膜可以为醋酸纤维素膜、pvdf膜和尼龙膜的一种或几种。

步骤s30中，划线通过自动划线机进行划线，检测线的划线速度可以为1-1.5m/min。对照线的划线速度可以为1-1.5m/min。

生物素化的抗体为生物素化的兔抗灿烂弧菌抗体时，步骤s30中，将制备的兔源灿烂弧菌抗体用抗体稀释液稀释后，按照1-2mg/ml，利用自动划线机按照1-1.5m/min在检测线t线处划线，将羊抗兔二抗利用自动划线机按照1-1.5m/min在对照线c线处划线。其中，抗体稀释液可以为碳酸盐缓冲液或磷酸盐缓冲液。所用抗体稀释液中，抗体的终浓度0.5-1mg/ml。

s40、按照第一无荧光滤纸、荧光样品垫、检测蛋白结合膜、第二无荧光滤纸的顺序黏贴在无荧光底板上，切割后得到检测试剂条。

步骤s40中，采用切割机进行切割，切割成0.5-0.8mm宽的检测试剂条。并采用合适的塑料件封装。

根据重组藻胆蛋白自身的荧光特点，将采用上述方法制备的检测试剂条采用260-280nm紫外灯照射观察。在检测线处看到荧光位点的出现。具体结果如图3所示，其中，图3a为利用本发明制作的针对纯培养的灿烂弧菌的检测试剂条；图3b为针对纯培养的灿烂弧菌的检测结果，图中圈出来的部分可以看出在作为阳性样品的第四检测条的检测线处有荧光位点出现；图3c为利用本发明制作的针对感染灿烂弧菌的实验小鼠的血液样本检测的试剂条；图3d为针对感染灿烂弧菌实验小鼠血液样本的检测结果，图中圈出来的部分可以看出在作为阳性样品的第二、第三检测条的检测线处有荧光位点出现。

上述利用重组荧光藻胆蛋白亚基的检测试剂条的制备方法，利用原核重组，组合表达的方式制备重组藻胆蛋白亚基具有分子量均一，纯化制备成本低廉等优点，再基于抗原抗体结合的原理，制备了基于重组藻胆蛋白的快速检测试剂条，制备过程绿色环保，成本低廉。制备得到的利用重组荧光藻胆蛋白亚基的检测试剂条环境友好，可以对肿瘤、微生物感染等疾病抗原或抗体的进行定性和定量检测，可以实现疾病早期检测。

下面为具体实施例部分。

实施例1用于水产灿烂弧菌快速检测荧光试剂条的制备

1.1荧光探针的制备：将制备的融合有2mg/ml链霉亲和素的藻胆蛋白亚基与3mg/ml生物素化的兔抗灿烂弧菌抗体混合物，于20℃，孵育15min。放置于4℃，24h-48h内使用。

1.2荧光样品垫的制备：将上述制备的荧光探针按照1ml/min的速度均匀喷洒在玻璃纤维膜上，10℃固定30min，20℃干燥备用。

1.3检测蛋白结合膜的制备：将制备的兔源灿烂弧菌抗体用碳酸盐缓冲液稀释后，按照1mg/ml，利用自动划线机按照1m/min在检测线t线处划线；将羊抗兔二抗按照上述方法在对照线c线处划线。

1.4检测板的制备：按照无荧光滤纸、荧光样品垫、检测蛋白结合膜、无荧光滤纸的顺序黏贴在无荧光底板上。

1.5剪切与封装：将上述构建好的检测板用切割机切割成0.5mm宽的试剂条。利用合适的塑料件封装，得到检测试剂条。

1.6制备的试剂条的检测方法和检测结果分析

将试纸条放在水平工作台面上平置并做好样本标记，将待检样品(待测病原微生物纯培养物、病人新鲜血清、血液悬液等)置室温平衡，室温平衡前将室内温度控制在20-25℃；待样本平衡结束后，取80-100ul标本滴于试纸条的样品垫上；将加有样品的试剂条水平放置，室温静置15-20分钟，于240-365nm紫外暗箱中进行观察。若样品中有待测抗原或其含量高于检测限时，抗原抗体复合物凝聚在检测线和质控线，为二条荧光条带，结果判读为阳性；阴性仅在质控区出现一条荧光带。若质控区无条带出现，提示操作不当如样本量不够，层析过程不正常或试剂条己过效期或试剂条已经损坏，请重新取新的试剂条按照上述步骤进行测试，若问题仍然存在，停止使用该批号制品。

结果表明，利用实施例1制备的试剂条，可以实现对病原微生物纯培养物、病人新鲜血液等样品的快速检测。

实施例2

2.1荧光探针的制备：将制备的融合有1mg/ml链霉亲和素的藻胆蛋白亚基与2mg/ml生物素化的兔抗灿烂弧菌抗体混合物，于25℃，孵育10min。放置于8℃，24h-48h内使用。

2.2荧光样品垫的制备：将上述制备的荧光探针按照1.5ml/min的速度均匀喷洒在玻璃纤维膜上，15℃固定45min，25℃干燥备用。

2.3检测蛋白结合膜的制备：将制备的兔源灿烂弧菌抗体用碳酸盐缓冲液稀释后，按照2mg/ml，利用自动划线机按照1.5m/min在检测线t线处划线；将羊抗兔二抗按照上述方法在对照线c线处划线。

2.4检测板的制备：按照无荧光滤纸、荧光样品垫、检测蛋白结合膜、无荧光滤纸的顺序黏贴在无荧光底板上。

2.5剪切与封装：将上述构建好的检测板用切割机切割成0.8mm宽的试剂条。利用合适的塑料件封装，得到检测试剂条。

2.6制备的试剂条的检测方法和检测结果分析

将试纸条放在水平工作台面上平置并做好样本标记，将待检样品(待测病原微生物纯培养物、病人新鲜血清、血液悬液等)置室温平衡，室温平衡前将室内温度控制在20-25℃；待样本平衡结束后，取80-100ul标本滴于试纸条的样品垫上；将加有样品的试剂条水平放置，室温静置15-20分钟，于240-365nm紫外暗箱中进行观察。

具体检测结果的判读方法：若样品中有待测抗原或其含量高于检测限时，抗原抗体复合物凝聚在检测线和质控线，为二条荧光条带，结果判读为阳性；阴性仅在质控区出现一条荧光带。若质控区无条带出现，提示操作不当如样本量不够，层析过程不正常或试剂条己过效期或试剂条已经损坏，请重新取新的试剂条按照上述步骤进行测试，若问题仍然存在，停止使用该批号制品。

结果表明，利用实施例2制备的试剂条，可以实现对病原微生物纯培养物、病人新鲜血液等样品的快速检测。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。