一种清咽解热口服药物的指纹图谱检测方法与流程

本发明涉及药品检测领域，尤其是涉及一种中成药的高效液相色谱检测指纹图谱方法

背景技术

儿童清咽解热口服液是亚宝药业四川制药有限公司生产的用于治疗小儿急性咽炎肺胃实热证的中药新药，由柴胡、黄芩苷、紫花地丁、人工牛黄、苣荬菜、鱼腥草、芦根、赤小豆8味中药材组成，具有清热解毒，消肿利咽的功效，用于小儿急性咽炎(急喉痹)属肺胃实热证，专利cn1296088c中描述了其主要成分和组成。临床实践证明,儿童清咽解热口服液对于小儿急性咽炎(肺胃实热证)的咽痛、大便干、咽喉红肿症状体征有效，且安全性较好，值得临床推广应用。

《中国药典》中没有记载该品种的质量检测标准。现有的标准中存在不足为：侧重于对儿童清咽解热口服液主要成分的定性鉴别和定量检测，缺乏对药物整体的质量控制。经文献查阅，没有研究者对该品种进行过整体质量控制研究。

指纹图谱是基于对中药物质群整体作用的认识，建立的某种中药材或中成药中所共有的、具有特征性的某类或数类成分的色谱或光谱图谱，具有信息量大、特征性强、整体性和模糊性等特点。在现阶段，中药的有效成分绝大多数没有明确的情况下，指纹图谱能较全面地反映药物所含化学成分的相对关系，体现了中药成分的复杂性和相关性，与中医药的传统理论相适应，能真正对中药内在质量进行有效表征、综合评价和全面控制。对于有效控制中药材或中成药的质量具有重要意义。

儿童清咽解热口服液属于儿童专用药品,其质量控制尤为重要。为了全面控制本品的产品质量，有必要建立一种新的、快速、准确且适合工业化大生产需求的质量检测方法，满足对该产品的整体质量控制要求。

技术实现要素：

本发明针对儿童清咽解热口服液药味繁多，成分复杂，个别成分的定性定量分析难以全面反映药品的全面信息，建立了该制剂的指纹图谱检测方法，以更好、更有效地控制儿童清咽解热口服液的整体质量。

本发明提供了一种儿童清咽解热口服制剂的指纹图谱检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)对照品溶液的制备

称取黄芩苷对照品，加甲醇制得对照品溶液，称取秦皮乙素对照品，加50％甲醇制成对照品溶液；

(2)供试品溶液的制备

量取儿童清咽解热口服液，加70％乙醇稀释定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即为供试品溶液；

(3)测定法：

吸取所述对照品溶液和所述供试品溶液，注入高效液相色谱仪，得到色谱图，

其中，所述高效液相色谱仪的色谱条件如下：

色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相a为乙腈，流动相b为磷酸溶液，进行梯度洗脱，梯度程序如下表：

流速为0.8～1.2ml/min；检测波长为192～230nm；柱温为25～40℃。

在本发明测定方法的一个实施方案中，所述流动相b为0.2％的磷酸溶液。

在本发明的测定方法一个实施方案中，步骤(1)中所述对照品溶液中黄芩苷的浓度0.2mg/ml，秦皮乙素对照品溶液的浓度为0.08mg/ml。

在本发明测定方法的一个实施方案中，步骤(2)中所述药物组合物加入一定浓度的乙醇，使得每10ml稀释溶液中所含原药液为0.5ml～2.0ml。

在本发明测定方法的一个实施方案中，所述色谱柱为phenomenexgemini-c18柱。

在本发明测定方法的一个实施方案中，所述色谱条件中，柱温优选35℃。

在本发明测定方法的一个实施方案中，所述色谱条件中，流动相的流速优选1.2ml/min。

在本发明测定方法的一个实施方案中，所述色谱条件中，检测波长优选为206nm。

在本发明的第二方面，提供一种儿童清咽解热口服制剂的指纹图谱建立方法，包括以下步骤：

(1)对照品溶液的制备

称取黄芩苷对照品，加甲醇制得对照品溶液，称取秦皮乙素对照品，加50％甲醇制成对照品溶液；

(2)供试品溶液的制备

量取儿童清咽解热口服液，加70％乙醇稀释定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即为供试品溶液；

(3)测定法：

吸取所述对照品溶液和所述供试品溶液，注入高效液相色谱仪，得到色谱图，

其中，所述高效液相色谱仪的色谱条件如下：

色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相a为乙腈，流动相b为磷酸溶液，进行梯度洗脱，梯度程序如下表：

流速为0.8～1.2ml/min；检测波长为192～230nm；柱温为25～40℃；

(4)生成对照指纹图谱：选择多批次儿童清咽解热口服液的指纹图谱，以黄芩苷为参比峰，得到10个共有峰的图谱，用中位数计算法生成对照指纹图谱；其中，指纹图谱相对保留时间为：

在本发明的指纹图谱建立方法的一个实施方案中，所述步骤(3)中流动相b为0.2％的磷酸溶液。

在本发明的指纹图谱建立方法的一个实施方案中，所述步骤(1)中所述对照品溶液中黄芩苷的浓度0.2mg/ml，秦皮乙素对照品溶液的浓度为0.08mg/ml。

在本发明的指纹图谱建立方法的一个实施方案中，所述步骤(2)中所述药物组合物加入70％乙醇，使得每10ml稀释溶液中所含原药液为0.5ml～2.0ml。

在本发明的指纹图谱建立方法的一个实施方案中，色谱柱为phenomenexgemini-c18柱，柱温优选35℃，流动相的流速优选1.2ml/min，检测波长优选为206nm。

本发明所选择的检测条件是经过实验反复比较和验证的，准确度高，可以实现半定量测定。本发明第一次采取hplc指纹图谱对该品种进行检测，经过对流动相和梯度洗脱条件等方法进行优化，使得图谱的主峰分离良好，同时对照峰的峰形也明显变好，可以全面控制本品的整体质量，同时满足工业化大生产的要求。

本发明的有益效果

(1)用本发明所提供的方法建立了儿童清咽解热口服液指纹图谱，结合黄芩苷和秦皮乙素两个主要成分的指认，能有效地表征该产品质量，有利于全面控制药物质量。

(2)指纹图谱注重各个构成指纹特征峰的前后顺序和相互关系，注重整体面貌特征，既避免了因测定个别化学成分而判定儿童清咽解热口服液质量的片面性，又减少了为质量达标而人为处理的可能性。

(3)本发明方法具有方法简便、稳定、精密度高、重现性好的优点。

附图说明

附图1乙腈为流动相a，水为流动相b进行高效液相色谱分析建立的儿童清咽解热口服液指纹图谱。

附图2乙腈为流动相a，0.2％磷酸溶液为流动相b进行高效液相色谱分析建立的儿童清咽解热口服液指纹图谱。

附图3乙腈为流动相a，0.05％三氟乙酸溶液为流动相b进行高效液相色谱分析建立的儿童清咽解热口服液指纹图谱。

附图4甲醇为流动相a，0.2％磷酸溶液为流动相b进行高效液相色谱分析建立的儿童清咽解热口服液指纹图谱。

附图5儿童清咽解热口服液指纹图谱-对照图谱，其中，4号峰为秦皮乙素，8(s)峰为黄芩苷。

具体实施方式

实施例1指纹图谱建立

1.1仪器

lc-20at岛津高效液相色谱仪，agilent1200高效液相色谱仪，agilent1260高效液相色谱仪，色谱柱(agilentextendc18，4.6×250mm，5μm，s/n:ushr007237)，色谱柱(phenomenexgemini-c18，4.6×250mm，5μm，s/n:540529-7)，色谱柱(phenomenexgemini-c18，4.6×250mm，5μm，s/n:540542-28)，色谱柱(phenomenexgemini-c18，4.6×250mm，5μm，s/n:540608-4)，色谱柱(kromasil100-5c18，4.6×250mm，5μm，s/n:e59208)。

1.2试剂

甲酸(ar，国药集团化学试剂有限公司，批号：20130318)，磷酸(ar，北京精求化工有限责任公司，批号：20101107)，醋酸(ar，天津市福晨化学试剂厂，批号：20130702)，乙醇(ar，国药集团化学试剂有限公司，批号：20130801)纯水(杭州娃哈哈集团有限公司，批号20130520)，乙腈(hplc，sigma-aldrich，批号：s92130)，甲醇(hplc，honeywell，批号20130729)。

对照品：秦皮乙素对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110741-200506)，黄芩苷对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110715-200815)。

1.3检测样品

亚宝药业四川制药有限公司生产的批号为130201、130202、130203的儿童清咽解热口服液和亚宝北中大(北京)制药有限公司生产的批号为18002b、28008、28001b、28019b、28024b、38003b、08004b、98015b、08005b的儿童清咽解热口服液。

1.4测试方法

高效液相色谱法(中国药典2015年版四部通则0512)测定。

参照物溶液的制备：精密称取黄芩苷对照品10mg，置50ml量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得参照物溶液；精密称取秦皮乙素对照品10mg，置50ml量瓶中，加50％甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，精密量取10ml，置25ml量瓶中，加50％甲醇定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

供试品溶液的制备：精密量取儿童清咽解热口服液1ml，置10ml量瓶中，加70％乙醇稀释定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即为供试品溶液。

色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(色谱柱：phenomenexgemini-c18，250mm×4.6mm，5μm)；以乙腈为流动相a，0.2％磷酸溶液为流动相b，按表2梯度洗脱程序进行梯度洗脱：

表2流动相梯度洗脱条件

流速为1.2ml/min；检测波长为206nm；柱温为35℃。理论塔板数按黄芩苷峰计算应不低于10000。

测定法：分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，记录80分钟内的色谱图，即得。

实施例2最佳色谱条件考察

仪器和试剂同实施例1。

2.1检测波长的选择

对照品溶液的制备、供试品溶液的制备同实施例1。

分别设置192nm、206nm、230nm、254nm、278nm、353nm、450nm对儿童清咽解热口服液的指纹图谱进行分析，其中192nm～230nm波长下色谱峰分离较好。与另外6个波长下的图谱相比较，206nm的指纹图谱信息量最多，能够更加充分地体现本品的化学成分，且基线漂移不大，因此选择206nm作为最优检测波长。

2.2供试品溶液的制备考察

参照物溶液的制备、色谱条件和测定法同实施例1。

取本品原液、水稀释10倍溶液、70％乙醇稀释10倍溶液、70％乙醇稀释25倍溶液，分别制成供试品溶液。

将以上不同稀释方法所得到的色谱图中主要色谱峰进行积分，比较其分离度和分离效果，结果显示，70％乙醇稀释10倍后样品的分离度及图谱整体分离效果优于其他的处理方法，因此确定儿童清咽解热口服液供试品制备方法如下：取本品1ml，置于10ml量瓶中，加70％乙醇稀释定容至刻度，摇匀，即得。

2.3色谱柱的选择

色谱柱的填料和装填方式可能对药品化学成分分离效果产生影响。发明人对agilent、kromasil及phenomenex三个不同品牌的c18色谱柱(5μm，250×4.6mm)进行考察。其他色谱条件同实施例1。phenomenexgemini-c18柱的分离效果和峰型均优于其余两种，故优先选择phenomenexgemini-c18色谱柱。

2.4柱温的选择

在色谱指纹图谱测定中，柱温往往会影响分离效果，发明人分别在25℃、30℃、35℃、40℃四个柱温条件下，对儿童清咽解热口服液供试品溶液的指纹图谱进行分析。结果表明，四个柱温条件下均可获得供试品指纹图谱，其中在35℃时各个色谱峰的分离效果比较好，故最优选择35℃为检测柱温。

2.5流速考察

在色谱指纹图谱测定中，流速在一定程度上会影响分离效果，本试验分别在0.8ml/min、1.0ml/min、1.2ml/min三个流速条件下，对儿童清咽解热口服液供试品溶液的指纹图谱进行分析。结果表明，三个流速条件下均可获得供试品指纹图谱，其中在1.2ml/min时各个色谱峰的分离效果比较好，故选择1.2ml/min为最合适的流速。

2.6色谱信息采集时间确定

为考察色谱信息采集时间，对本品进行检测，色谱条件如下：色谱柱：phenomenexgemini-c18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；检测波长：206nm；柱温：35℃；流速：1.2ml/min；进样量：10μl；流动相：以乙腈为流动相a，0.2％磷酸溶液为流动相b，按表3进行梯度洗脱。采集120min内的色谱信息。

表3流动相梯度洗脱条件

因为80min后无吸收峰，故采集80min内的色谱信息。

实施例3指纹图谱方法验证

根据预实验结果，考察不同的流动相体系，筛选色谱峰信息最丰富，分离度最好的色谱条件。

供试品溶液的制备：取本品1ml，置于10ml量瓶中，加70％乙醇稀释定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

色谱条件：采用phenomenexgemini-c18色谱柱，考察乙腈-水溶液，乙腈-0.2％磷酸溶液，乙腈-0.05％三氟乙酸溶液、甲醇-0.2％磷酸溶液4个系统进行试验

(1)系统1：乙腈为流动相a，水为流动相b，参见附图1

表4流动相梯度洗脱条件

(2)系统2：乙腈为流动相a，0.2％磷酸溶液为流动相b，参见附图2

表5流动相梯度洗脱条件

(3)系统3：乙腈为流动相a，0.05％三氟乙酸溶液为流动相b，参见附图3

表6流动相梯度洗脱条件

(4)系统4：甲醇为流动相a，0.2％磷酸溶液为流动相b，参见附图4

表7流动相梯度洗脱条件

由以上系统的图谱可以看出，乙腈-0.2％磷酸溶液系统出峰信息量较大，基线平稳，能较好的反映儿童清咽解热口服液的整体质量信息；而其余三个系统基线漂移严重或出峰偏少，无法全面表达本品的质量信息，故经筛选，确定选择乙腈-0.2％磷酸溶液系统作为本品指纹图谱的流动相条件。

实施例4指纹图谱方法学验证

4.1空白试验

取70％乙醇，按实施例1色谱条件直接进样，记录80分钟的色谱图，结果表明体系不存在残留和干扰。

4.2系统适用性试验

取本品，按照实施例1方法操作，制备成供试品溶液，直接进样6次，以8号峰黄芩苷为参照峰，计算各主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积。结果显示10个共有峰的相对保留时间稳定，rsd均小于2％，相对峰面积相对恒定，rsd均小于5％；表明方法的系统适用性良好。结果见表8、9。

表8精密度试验相对保留时间

表9精密度试验相对峰面积

4.3重复性试验

试验人员a，取同一批次本品，按照实施例1方法操作，制备6份供试品溶液，检测，以8号峰黄芩苷为参照峰，计算各主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积。结果显示10个共有峰的相对保留时间稳定，rsd均小于2％，相对峰面积相对恒定，rsd均小于5％；表明该方法重复性良好。结果见表10、11。

表10重复性试验相对保留时间

表11重复性试验相对峰面积

4.4稳定性试验

取本品，按照实施例1方法操作，分别于供试品制备0、3、6、9、12、18、24、30、36小时进样检测，以8号峰黄芩苷为参照峰，计算各主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积。结果显示10个共有峰的相对保留时间稳定，rsd均小于2％，相对峰面积相对恒定，rsd均小于5％；表明本品的供试品溶液在36小时内稳定。结果见表12、13。

表12稳定性试验相对保留时间

表13稳定性试验相对峰面积

4.5耐用性试验

4.5.1不同仪器耐用性

取本品，按照实施例1方法操作，使用不同型号的仪器进行检测，以agilent1200仪器图谱为参照，以参照图谱计算不同仪器之间图谱的相似度，结果表明不同仪器间测定结果大致相同，指纹图谱相似度均大于0.99，说明高效液相色谱仪的型号对本指纹图谱方法影响不大。结果见表14。

表14仪器耐用性试验结果

4.5.2不同批次色谱柱耐用性

取本品，按照实施例1方法操作，使用同一型号不同批次色谱柱进行检测，以其中一个批次色谱柱(序列号540529-7)图谱为参照，计算相似度，结果表明不同批次色谱柱间测定结果大致相同，指纹图谱相似度均大于0.99，说明色谱柱的批次对本方法影响不大。结果见表15。

表15色谱柱耐用性试验结果

实施例5对照指纹图谱建立

对亚宝药业四川制药有限公司生产的批号为130201、130202、130203的儿童清咽解热口服液和亚宝北中大(北京)制药有限公司生产的批号为18002b、28008、28001b、28019b、28024b、38003b、08004b、98015b、08005b的儿童清咽解热口服液，共计12批次样品，分别按上述建立的指纹图谱测定方法进行检测，采用国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012.0版本)拟合生成对照指纹图谱，参见附图5。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。