一种天山雪莲种子的质量检测方法与流程

本发明属于医药检测领域，具体涉及一种天山雪莲种子的质量检测方法。

背景技术

天山雪莲，又名新疆雪莲、大苞雪莲，是一种维吾尔族习用药材，中国药典2015年版收载，系菊科凤毛菊属植物天山雪莲saussureainvolucrata(kar.et.kir.)sch.bip.的地上干燥部分。迄今为止，从中分离和鉴定有70多种化学成分，主要是黄酮类、倍半萜类、苯丙素类、香豆素类化学成分，具有抗肿瘤、抗关节炎、抗氧化、抗衰老、抗疲劳、抗缺氧、神经保护、免疫调节等药理活性，临床上主要用于治疗关节炎、不孕不育，在肿瘤、心血管、过敏、哮喘、皮肤病等方面也有运用。作为繁衍天山雪莲的关键组织和器官——种子，也逐步引起科研人员的关注，中国科学院大学对“天山雪莲种子化学成分及其生物活性”进行系统研究，但未公开全文，从公开发表期刊论文来看，天山雪莲种子甲醇提取物具有良好的抗氧化活性和清除abts自由基活性，甾体酯类化合物sinkiangenorina和sinkiangenorinb表现出高水平的抗肿瘤活性，可见，天山雪莲种子具备一定的医用潜力。

目前，研究人员采用中国药典方法以绿原酸和芦丁作为标识成分，对天山雪莲种子中绿原酸和芦丁含量进行测定，结果表明该方法简单可行，但是缺乏一定专属性；并且芦丁含量非常少，达不到国家含量要求标准，并不适合作为标示成分。在我们的前期研究基础上，结合相关文献，确认天山雪莲中含有槲皮苷，估计含量在0.01％以上。槲皮苷具有抗紫外、抗氧化、抗金葡菌、保护血管内皮细胞等生物活性。本发明人通过对天山雪莲的茎、叶、苞叶、花序(含花蕊)、种子各组织和器官进行对比研究，发现槲皮苷在种子中含量尤为集中。

有鉴于此，本发明首次建立了以槲皮苷作为标识成分的天山雪莲种子质量检测方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种天山雪莲种子的质量检测方法，该检测方法采用高效液相色谱法，以槲皮苷作为标识成分，检测天山雪莲种子中槲皮苷的含量，操作简便，条件可控，专属性强，稳定性和重现性好，具有很强实用性；同时，可以与现有天山雪莲种子大量成分绿原酸组合形成多组分同步进行含量测定，还可以与绿原酸、芦丁以及一未知成分组合形成指纹图谱控制天山雪莲种子的质量。

为了实现上述目的，所采用的技术方案为：

一种天山雪莲种子的质量检测方法，以槲皮苷为标识成分，采用高效液相色谱法对天山雪莲种子进行定量检测，并制备指纹图谱。

进一步的，包括以下步骤：

(1)制备对照品溶液：

将槲皮苷完全溶解于甲醇中，得对照品溶液；所述对照品溶液中槲皮苷与甲醇的质量体积比为65-75μg：1ml；

(2)制备供试品溶液：

将供试品和甲醇混合后，在96-100℃下加热回流提取50-70min，再冷却至室温，补重并混合均匀，过滤，取滤液，得供试品溶液；

(3)检测：

分别吸取对照品溶液与供试品溶液，并注入高效液相色谱仪，记录30分钟内的色谱图；其中，所述填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶；所述流动相a为乙腈，所述流动相b为磷酸溶液；

再进一步的，所述步骤(1)中，所述对照品溶液中槲皮苷与甲醇的质量体积比为70μg：1ml；

所述步骤(2)中，将供试品和甲醇按照0.4-0.6g：50ml的质量体积比混合后，加热回流提取60min。

再进一步的，所述步骤(2)中，将供试品和甲醇按照0.5g：50ml的质量体积比混合后，加热回流提取60min。

再进一步的，所述步骤(2)中，所述加热回流提取的温度为98℃。

所述步骤(3)中，所述磷酸溶液的质量分数为0.4％。

再进一步的，所述步骤(3)中，所述流动相a、b的体积分数变化为：0-10min，a相6％-16％，b相94％-84％；10-30min，a相16％-16％，b相84％-84％。

再进一步的，所述步骤(3)中，所述检测波长为330nm，流速1ml·min^-1，柱温为40℃，进样量5μl。

再进一步的，所述供试品为天山雪莲种子，或是以天山雪莲种子为主药制得的糖浆剂、合剂、注射剂、片剂、颗粒剂、散剂、锭剂、丸剂、滴丸剂、煎膏剂、凝胶剂、膏药、贴膏剂、流浸膏剂与浸膏剂、酒剂、酊剂、胶囊剂、软膏剂、露剂、茶剂、擦剂、洗剂、涂膜剂、栓剂、气雾剂、喷雾剂、鼻用制剂、眼用制剂、耳用制剂。

进一步的，采用高效液相色谱法进行定量检测天山雪莲种子，制备以槲皮苷、绿原酸为标识成分的指纹图谱。

进一步的，所述质量检测方法还包括：采用高效液相色谱法进行定量检测天山雪莲种子，制备以槲皮苷、绿原酸和芦丁为标识成分的指纹图谱。

与现有技术相比，本发明的有益之处在于：

1、本发明所述的一种天山雪莲种子的质量检测方法，天山雪莲种子中槲皮苷含量高，适合作为标示成分，本发明首次将槲皮苷作为天山雪莲种子的标识成分，采用高效液相色谱法对天山雪莲种子进行质量控制，操作简便，条件可控，专属性强，稳定性和重现性好，具有很强实用性，为中药制剂和民族药制剂中天山雪莲种子的质量控制提供参考。

2、本发明所述的一种天山雪莲种子的质量检测方法，也可以与现有天山雪莲种子大量成分绿原酸组合控制天山雪莲种子的质量。

3、本发明所述的一种天山雪莲种子的质量检测方法，还可以与已知成分绿原酸、芦丁和一未知成分组合形成指纹图谱控制天山雪莲种子的质量。

附图说明

图1为实施例1中槲皮苷对照品溶液的hplc谱图；

图2为实施例2中芦丁对照品溶液的hplc谱图；

图3为实施例2中绿原酸对照品溶液的hplc谱图；

图4为实施例2中槲皮苷和绿原酸对照品溶液的hplc谱图；

图5为实施例2中天山雪莲种子供试品的hplc谱图；

其中，峰1为槲皮苷，峰2为芦丁，峰3为绿原酸，峰4为未知成分峰，峰ip为杂质峰。

具体实施方式

为了进一步阐述本发明一种天山雪莲种子的质量检测方法，达到预期发明目的，以下结合较佳实施例，对依据本发明提出的一种天山雪莲种子的质量检测方法，其具体实施方式、结构、特征及其功效，详细说明如后。在下述说明中，不同的“一实施例”或“实施例”指的不一定是同一实施例。此外，一或多个实施例中的特定特征、结构或特点可由任何合适形式组合。

下面将结合具体实施例对本发明一种天山雪莲种子的质量检测方法做进一步的详细介绍：

实施例1.

(1)仪器与材料：

高效液相色谱仪(lc-2010aht，日本岛津公司)；色谱柱(zorbaxsb-c18，4.6×150mm，5μm，agilent，madeinusa)；电子天平(fa1104，感量0.1mg，上海天平仪器厂)；双重水蒸馏器(sz-93a，上海亚荣生化仪器厂)。

槲皮苷(批号111538-201606，中国食品药品检定研究院，含量以90.6％计)；甲醇、磷酸均为分析纯试剂；乙腈为色谱纯试剂；水为双重蒸馏水。

(2)色谱条件：

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相a，以质量分数为0.4％的磷酸溶液为流动相b，梯度洗脱，流动相a、b的体积分数变化为：0-10min，6％a(94％b)-16％a(84％b)；10-30min，16％a(84％b)-16％a(84％b)；检测波长为330nm，流速1ml·min^-1，柱温40℃。

(3)制备对照品溶液：

精密称定槲皮苷对照品，将槲皮苷完全溶解于甲醇中，制成每1ml含槲皮苷68.86μg的对照品溶液。

(4)制备供试品溶液：

精密称取天山雪莲种子粉末0.5g(过50目筛)，置圆底烧瓶中，精密加入50ml甲醇，称重，在100℃水浴加热回流提取60min，冷却至室温后，补重(用甲醇定容至50ml)，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

(5)测定：

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定，记录30分钟内的色谱图。

图1为槲皮苷对照品溶液的hplc谱图，峰1为槲皮苷；

槲皮苷对照品溶液的hplc谱图和天山雪莲种子供试品的hplc谱图中均出现槲皮苷的峰，且峰独立，其分离度好，峰形对称，峰面积满足测定的基本要求。

(6)线性关系考察

分别精密吸取对照品溶液1，5，10，15，20μl注入液相色谱仪，测定峰面积，以进样量为横坐标(x)，峰面积为纵坐标(y)，绘制标准曲线，并计算槲皮苷回归方程为y＝1933.25x-8531.28(r＝0.9999)，线性范围68.86ng-1377.12ng。进样量与峰面积呈良好线性关系。

(7)精密度试验

精密吸取同一份供试品溶液5μl，连续进样5次，测得峰面积积分值，槲皮苷rsd为0.36％(n＝5)，结果表明，精密度良好。

(8)稳定性试验

精密吸取同一份供试品溶液5μl，分别于0，4，8，12h进样，测得峰面积积分值，槲皮苷rsd分别为1.89％，结果表明，供试品溶液在12h内稳定。

(9)重复性试验

精密称定天山雪莲种子粉末6份，按上述方法制备供试品溶液，分别进样5μl，用外标法计算槲皮苷含量，依次为0.7271％±0.0243％，rsd为2.55％，表明该法重复性良好。

(10)回收率试验

精密称取适量已知槲皮苷含量样品6份，然后精密加入对照品，按上述方法制备供试品溶液，分别进样5μl，结果见表1。

表1天山雪莲种子中槲皮苷回收率试验

由表1可知，回收率好，平均可以达到95.78％，说明本发明所述的检测方法准确性高。

(11)天山雪莲种子样品测定

分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液5μl，注入液相色谱仪，按外标法计算槲皮苷含量，结果见表2。

表2天山雪莲种子中槲皮苷含量平行测定结果

由表2可知，天山雪莲种子中槲皮苷含量表较高，适合作为标示成分。

本发明实施例所述的一种天山雪莲种子的质量检测方法，天山雪莲种子中槲皮苷含量高，适合作为标示成分，采用高效液相色谱法对天山雪莲种子进行质量控制，操作简便，条件可控，专属性强，稳定性和重现性好，具有很强实用性，为中药制剂和民族药制剂中天山雪莲种子的质量控制提供参考。

实施例2.

(1)仪器与材料：

绿原酸(批号110753-201415，中国食品药品检定研究院，含量以96.2％计)；芦丁(批号100080-201408，中国食品药品检定研究院，含量以90.2％计)；其余同实施实例1。

(2)色谱条件：

同实施实例1。

(3)制备对照品溶液：

分别取绿原酸对照品、槲皮苷对照品各适量，精密称定，将绿原酸、槲皮苷完全溶解于甲醇中，制成每1ml含绿原酸22.62μg、槲皮苷68.86μg的混合溶液，即得对照品溶液1。

另取芦丁适量，精密称定，将其完全溶解于甲醇中，制成每1ml含芦丁9.03μg的对照品溶液，即得对照品溶液2。

(4)制备供试品溶液：

精密称取天山雪莲种子粉末0.5g(过50目筛)，置圆底烧瓶中，精密加入50ml甲醇，称重，在98℃水浴加热回流提取1h，冷却至室温后，补重(用甲醇定容至50ml)，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

在98℃进行水浴加热回流，可以提高本发明检测方法的重复性。

(5)测定：

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定，记录30分钟内的色谱图。

图1为槲皮苷对照品溶液的hplc谱图，峰1为槲皮苷；

图2为芦丁对照品溶液的hplc谱图，峰2为芦丁；

图3为绿原酸对照品溶液的hplc谱图，峰3为绿原酸，峰ip为杂质峰；

图4为绿原酸和槲皮苷混合对照品溶液的hplc谱图，峰1为槲皮苷，峰3为绿原酸，峰ip为杂质峰；

图5为天山雪莲种子供试品的hplc谱图，峰1为槲皮苷，峰2为芦丁，峰3为绿原酸，峰4为未知成分。

由图1-5可知，峰1独立，其分离度好，峰形对称，峰面积大满足含量测定的要求；峰2虽然独立，但是峰面积小，含量低，不宜作含量测定项目；还可知，峰1和峰3都独立，其分离度好，峰形对称，峰面积大均满足含量测定的要求，本发明也可以与天山雪莲种子中的绿原酸组合同时进行含量检测以天山雪莲种子的质量；峰1-4都独立，其分离度好，峰形对称，相对保留时间适宜，还可以与绿原酸、芦丁以及一未知成分组合形成指纹图谱来控制天山雪莲种子的质量。

(6)线性关系考察

分别精密吸取对照品混合溶液1，5，10，15，20μl注入液相色谱仪，测定峰面积，以进样量为横坐标(x)，峰面积为纵坐标(y)，绘制标准曲线，并计算绿原酸回归方程为y＝2688.75x+818.33(r＝0.9999)，线性范围22.63ng-452.52ng；槲皮苷回归方程为y＝1849.33x+4322.21(r＝0.9999)，线性范围68.86ng-1377.12ng。进样量与峰面积呈良好线性关系。

(7)精密度试验

精密吸取同一份供试品溶液5μl，连续进样5次，测得峰面积积分值，绿原酸、槲皮苷rsd均为0.35％(n＝5)，结果表明，精密度良好。

(8)稳定性试验

精密吸取同一份供试品溶液5μl，分别于0，4，8，12，24h进样，测得峰面积积分值，绿原酸、槲皮苷rsd分别为0.42％、0.84％，结果表明，供试品溶液在24h内稳定。

(9)重复性试验

精密称定天山雪莲种子粉末6份，按步骤(4)的方法制备供试品溶液，分别进样5μl，用外标法分别计算绿原酸、槲皮苷含量，依次为0.2102％±0.0065％、0.7440％±0.0168％，rsd依次为2.08％、1.86％，表明该法重复性良好。

(10)回收率试验

精密称取适量已知绿原酸、槲皮苷含量样品6份，然后精密加入两种对照品适量，按上述方法制备供试品溶液，分别进样5μl，结果，见表3。

表3天山雪莲种子中绿原酸、槲皮苷回收率试验

由表3可知，回收率好，绿原酸的回收率平均可以达到102.18％，rsd为1.69％，槲皮苷的回收率平均可以达到94.69％，rsd为2.05％，说明本发明所述的检测方法准确性高。

(11)天山雪莲种子样品测定

分别精密吸取对照品混合溶液和供试品溶液5μl，注入液相色谱仪，按外标法分别计算绿原酸、槲皮苷含量，结果见表4。

表4天山雪莲种子中绿原酸、芦丁、槲皮苷含量平行测定结果

由表4可知，天山雪莲种子中绿原酸和槲皮苷含量高，适合作为含量测定项目的标识成分，而芦丁含量低，不宜作含量测定项目的标识成分。

本发明实施例所述的一种天山雪莲种子的质量检测方法，天山雪莲种子中槲皮苷含量高，适合作为标示成分，采用高效液相色谱法对天山雪莲种子进行质量控制，操作简便，条件可控，专属性强，稳定性和重现性好，具有很强实用性，为中药制剂和民族药制剂中天山雪莲种子的质量控制提供参考。并且也可以与现有天山雪莲种子大量成分绿原酸组合同时检测以控制天山雪莲种子的质量。

实施例3.

(1)仪器与材料：

绿原酸(批号110753-201415，中国食品药品检定研究院，含量以96.2％计)；芦丁(批号100080-201408，中国食品药品检定研究院，含量以90.2％计)；其余同实施实例1。

(2)色谱条件

同实施实例1。

(3)制备对照品溶液：

分别取槲皮苷、绿原酸、芦丁对照品适量，精密称定，将槲皮苷、绿原酸、芦丁完全溶解于甲醇中，制成每1ml含适当浓度的槲皮苷(每1ml含槲皮苷70μg)、绿原酸、芦丁的混合对照品溶液，即得对照品溶液。

(4)制备供试品溶液：

精密称取天山雪莲种子粉末0.6g(过50目筛)，置圆底烧瓶中，精密加入50ml甲醇，称重，在96℃水浴加热回流提取70min，冷却至室温后，补重(用甲醇定容至50ml)，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

(5)测定：

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定，记录30分钟内的色谱图。绿原酸、槲皮苷、芦丁对照品溶液的hplc谱图和天山雪莲种子供试品的hplc谱图中均出现绿原酸、槲皮苷、芦丁的峰，且峰独立，其分离度好，峰形对称，满足指纹图谱的基本要求。

表5天山雪莲种子中指纹图谱各峰相对保留时间平行测定结果

本发明实施例所述的一种天山雪莲种子的质量检测方法，天山雪莲种子中槲皮苷含量高，适合作为标示成分，采用高效液相色谱法对天山雪莲种子进行质量控制，操作简便，条件可控，专属性强，稳定性和重现性好，具有很强实用性，为中药制剂和民族药制剂中天山雪莲种子的质量控制提供参考。还可以与绿原酸、芦丁以及一未知成分组合形成指纹图谱控制天山雪莲种子的质量

实施例4.

(1)仪器与材料：

同实施实例1。

(2)色谱条件

同实施实例1。

(3)制备对照品溶液：

分别取槲皮苷对照品适量，精密称定，将槲皮苷完全溶解于甲醇中，制成每1ml含槲皮苷75μg的混合溶液，即得对照品溶液。

(4)制备供试品溶液：

精密称取天山雪莲种子粉末0.6g(过50目筛)，置圆底烧瓶中，精密加入50ml甲醇，称重，在96℃水浴加热回流提取70min，冷却至室温后，补重(用甲醇定容至50ml)，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

(5)测定：

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定，记录30分钟内的色谱图。

槲皮苷对照品溶液的hplc谱图和天山雪莲种子供试品的hplc谱图中均出现槲皮苷的峰，且峰独立，其分离度好，峰形对称，峰面积满足测定的基本要求。

本发明实施例所述的一种天山雪莲种子的质量检测方法，天山雪莲种子中槲皮苷含量高，适合作为标示成分，采用高效液相色谱法对天山雪莲种子进行质量控制，操作简便，条件可控，专属性强，稳定性和重现性好，具有很强实用性，为中药制剂和民族药制剂中天山雪莲种子的质量控制提供参考。

实施例5.

(1)仪器与材料

同实施实例1。

(2)色谱条件

同实施实例1。

(3)制备对照品溶液：

分别取槲皮苷对照品适量，精密称定，将槲皮苷完全溶解于甲醇中，制成每1ml含槲皮苷65μg的混合溶液，即得对照品溶液。

(4)制备供试品溶液：

精密称取以天山雪莲种子粉末0.4g(过50目筛)，置圆底烧瓶中，精密加入50ml甲醇，称重，在98℃水浴加热回流提取60min，冷却至室温后，补重(用甲醇定容至50ml)，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

(5)测定：

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定，记录30分钟内的色谱图。

槲皮苷对照品溶液的hplc谱图和天山雪莲种子供试品的hplc谱图中均出现槲皮苷的峰，且峰独立，其分离度好，峰形对称，峰面积满足测定的基本要求。

本发明实施例所述的一种天山雪莲种子的质量检测方法，天山雪莲种子中槲皮苷含量高，适合作为标示成分，采用高效液相色谱法对天山雪莲种子进行质量控制，操作简便，条件可控，专属性强，稳定性和重现性好，具有很强实用性，为中药制剂和民族药制剂中天山雪莲种子的质量控制提供参考。

以上所述，仅是本发明实施例的较佳实施例而已，并非对本发明实施例作任何形式上的限制，依据本发明实施例的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明实施例技术方案的范围内。