一种血液分析组合物及其应用的制作方法

本发明涉及血液分析领域，特别涉及一种血液分析组合物及其应用。
背景技术：
：流式细胞术(flowcytometryfcm)是对单个细胞或其他生物微粒进行快速定量分析和分选的一门技术。在分析或分选过程中，包绕在流动液体中处理过的单个细胞或微粒通过聚焦的光源，产生电信号，这些信号代表光散射、荧光等参数，以此测定出细胞或微粒的物理和化学性质，并可根据这些性质分选出高纯度的细胞亚群，以对其进一步的培养或分析。包绕细胞的液流称为鞘液。所用仪器称为流式细胞仪(flowcytometerfcm)。流式细胞术综合了光学、电子学、流体力学、细胞化学、免疫学、激光技术和计算机科学等多门学科和技术，具有检测速度快、精确、测量指标多、采集数据量大、分析全面、方法灵活等特点。流式细胞术作为一种定量分析技术，已经成为实验室常见的化验方法之一。血液分析仪试剂主要包括溶血素、染液。溶血素主要是嗜酸溶血素和嗜碱溶血素。血液分析仪试剂是一类强的表面活性剂，一个作用是溶解红细胞，释放出血红蛋白(hgb)，形成稳定的血红蛋白衍生物，进行血红蛋白的测定。它的另一方面是溶解红细胞，进行白细胞分类与计数。溶血素(hemolysin/haemolysin)，又称细胞溶素(cy-totoxin)。确切的说它是细胞溶素中的一部分，细胞溶素是指细菌分泌的能够使细胞溶解的毒素。溶血素属于穿孔毒素(pore-formingtoxin)，又名攻膜毒素(mem-branedisruptingtype)，是指任何能使红细胞溶解并释放出血红蛋白的物质。溶血素的作用和原理：1、溶血素用于流式细胞术hla-b27抗原筛查实验，其作用是溶解全血中的红细胞。hla-b27是i型人类主要组织相容性抗原，在外周血主要表达在白细胞中的淋巴细胞表面。用荧光素标记抗hla-b27与淋巴细胞结合，即可用流式细胞仪检测。2、溶解红细胞：以利于对白细胞进行准确的荧光素标记。在流式细胞术实验中，红细胞体积和白细胞体积有重合的区域，而且红细胞的个数是白细胞个数的近一千倍，影响对有意义的细胞(白细胞)的荧光抗体标记和分选，因此在行流式细胞术时，必须加入溶血素，破坏掉红细胞，才能准确地对白细胞进行荧光素标记。目前常用的溶血素成本为每瓶约1400元，科研成本较高；溶血需要约10～15min，溶血时间长。技术实现要素：有鉴于此，本发明提供一种血液分析组合物及其应用。本发明为做流式常规项目hla-b27抗原筛查提供一种了溶血剂及其配置方法，该溶血素溶解红细胞速度快，成本低廉。为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：本发明提供了一种血液分析组合物，包括甲酸、表面活性剂和稳定剂。在本发明的一些具体实施方案中，所述血液分析组合物中所述稳定剂为盐。在本发明的一些具体实施方案中，所述血液分析组合物的ph值为7.4。在本发明的一些具体实施方案中，所述血液分析组合物中所述盐选自碳酸钠、氯化钠或硫酸钠。在本发明的一些具体实施方案中，所述血液分析组合物还包括固定剂。在本发明的一些具体实施方案中，所述血液分析组合物还包括缓冲液和/或ph值调节剂。在本发明的一些具体实施方案中，以ml/g/g计，所述血液分析组合物中所述表面活性剂、所述稳定剂与所述固定剂的质量比为：(1～2):(1～2):(0.5～1)。在本发明的一些具体实施方案中，所述血液分析组合物中所述稳定剂中碳酸钠、氯化钠和硫酸钠的质量比为：1:(2～5):(5～10)。本发明还提供了所述的血液分析组合物在溶血中的应用。本发明还提供了一种溶血素，包括所述的血液分析组合物。在本发明的一些具体实施方案中，所述溶血素包括a、b、c三个组分：a组分由甲酸和水组成，甲酸和水的体积比为1:(800～1000)。作为优选，甲酸和水的体积比为1:800。b组分由盐和水组成；盐由碳酸铵、氯化钠和硫酸钠组成；以g/g/g/ml计，碳酸铵、氯化钠和硫酸钠与水的质量/质量/质量/体积为1:(2～5):(5～10):(150～200)。作为优选，以g/g/g/ml计，碳酸铵、氯化钠和硫酸钠与水的质量/质量/质量/体积为1:2:5:170。c组分由多聚甲醛和pbs缓冲液组成，以g/ml计，多聚甲醛与pbs缓冲液的质量体积比为1:(100～150)。作为优选，以g/ml计，多聚甲醛与pbs缓冲液的质量体积比为1:100。在本发明的一些具体实施方案中，所述a、b、c三个组分的体积比为(1～2):(1～2):(0.5～1)。作为优选，所述a、b、c三个组分的体积比为1:1:0.5。本发明还提供了溶血素的配制方法。包括如下步骤：a液：以ml/g计，甲酸与蒸馏水的体积质量比为1：(800～1000)；室温保存；b液：碳酸铵、氯化钠和硫酸钠组成；以g/g/g/ml计，碳酸铵、氯化钠和硫酸钠与水的质量/质量/质量/体积为1:(2～5):(5～10):(150～200)；c液：多聚甲醛与缓冲液的质量比为1:(100～150)；加入ph值调节剂(如1mol/l的氢氧化钠)，使ph值偏碱可以助溶解，充分搅拌；再用ph值调节剂(1mol/l的盐酸)调ph值至7.4即可。溶血素的操作步骤：先加a液，震荡观察至透亮(约5～10s)，立即加入b液，震荡后加入c液体。a液：b液：c液的体积比为(1～2):(1～2):(0.5～1)。在本发明的一些具体实施方案中，所述溶血素的配制方法如下：a液：甲酸0.6ml+500ml蒸馏水；室温保存。b液：碳酸钠(na2co3)：3g、氯化钠：7.25g、硫酸钠：15.65g；溶解于300ml蒸馏水；完全溶解后再用蒸馏水补足至500ml。c液：多聚甲醛3g加入到300ml鞘液(pbs)中；加入氢氧化钠(naoh)，使ph值偏碱可以助溶解，充分搅拌，待多聚甲醛完全溶解后再用鞘液补足至500ml。先加a液1.0ml，震荡观察至透亮(约5～10s)，立即加入b液2ml，震荡后加入c液体0.5ml。再用1mol/l的盐酸(hcl)调ph值至7.4即可。在本发明的一些具体实施方案中，水优选蒸馏水、双蒸水或超纯水。本发明还提供了一种试剂盒，包括所述的血液分析组合物或所述的溶血素。本发明提供一种血液分析组合物及其应用。该血液分析组合物包括甲酸、表面活性剂和稳定剂，为做流式常规项目hla-b27提供一种了溶血剂及其配置方法，该溶血素溶解红细胞速度快，成本低廉。本发明提供的血液分析组合物具有如下优点：1、成本节约：自配溶血素成本：按照自配溶血素的规格算，每瓶固体成品原料可够配置溶血素33次，每次可配置溶血素体积为500ml，总共可供配置溶血素容积为33*500＝16500ml。自配溶血素价格每套(多聚甲醛、碳酸钠等全部原料)约100元左右。厂家溶血素成本：溶血素规格：100ml，按1:9的比例用蒸馏水稀释后用于实验，即每瓶可配置成溶血素溶剂为1000ml。每瓶厂家溶血素价格约为1400元。换算成自配溶血素每瓶可配置的体积16500ml，成本约为16500/1000*1400＝23100元。综上，如果换成自配的溶血素，等体积的厂家成品溶血素成本是自配的溶血素成本的23100/100＝231倍。2、时间节约：用厂家提供的商品化溶血素，溶血时间为15分钟，而用自配溶血素溶血时间仅为10秒，缩短了实验的等待时间和仪器的等待时间。3、本发明对溶血素和市售溶血素用于b27项目临床样本做了比对实验。从b27项目的样本中挑选了阴性和阳性两个水平的样本各20例，用本发明提供的溶血素严格把控时间进行溶血实验，实验分析结果和用市售溶血素实验结果完全一致(临床灵敏度和特异性均为100％，正确度一致，携带污染率结果≤1％，仪器携带污染率≤1％)溶血性能良好，满足实验要求。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1示h1-1的携带污染率结果6347；图2示h1-3的携带污染率结果6102；图3示l1-1的携带污染率结果0；图4示l1-3的携带污染率结果0；图5示h2-1的携带污染率结果6581；图6示h2-3的携带污染率结果6332；图7示h2-1的携带污染率结果1；图8示h2-3的携带污染率结果0；图9示h3-1的携带污染率结果5968；图10示h3-3的携带污染率结果6270；图11示h3-1的携带污染率结果3；图12示h3-3的携带污染率结果0。具体实施方式本发明公开了一种血液分析组合物及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。本发明提供的血液分析组合物及其应用中所用原料及试剂均可由市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本发明：实施例1配置方法如下：a液：甲酸0.6ml+500ml蒸馏水；室温保存。b液：碳酸钠(na2co3)：3g、氯化钠：7.25g、硫酸钠：15.65g；溶解于300ml蒸馏水；完全溶解后再用蒸馏水补足至500ml。c液：多聚甲醛3g加入到300ml鞘液(pbs)中；加入氢氧化钠(naoh)，使ph值偏碱可以助溶解，充分搅拌，待多聚甲醛完全溶解后再用鞘液补足至500ml。再用1mol/l的盐酸(hcl)调ph值至7.4即可。溶血素操作步骤：试管倾斜加入a液1.0ml振荡至完全透亮(严格控制振荡时间3～5s)：溶解时间过短，红细胞破坏不完全，光散射分辨率降低，淋巴细胞门内有红细胞污染；溶解时间过长，碎片增加，干扰仪器对t淋巴细胞门的设置。立即加入b液1ml振荡。随后加入c液0.5ml。注意：(建议标本量大时，溶血分若干工序进行，每3管为一个工序，一个工序定义为：从加a液至加入c液结束)。实施例2配置方法如下：a液：甲酸0.6ml+480ml蒸馏水；室温保存。b液：碳酸钠(na2co3)：3g、氯化钠：15g、硫酸钠：15g；溶解于300ml蒸馏水；完全溶解后再用蒸馏水补足至500ml。c液：多聚甲醛5g加入到750ml鞘液(pbs)中；加入氢氧化钠(naoh)，使ph值偏碱可以助溶解，充分搅拌，待多聚甲醛完全溶解后再用鞘液补足至500ml。再用1mol/l的盐酸(hcl)调ph值至7.4即可。溶血素操作步骤：先加a液2ml，震荡观察至透亮(约5～10s)，立即加入b液1.5ml，震荡后加入c液体1ml。实施例3配置方法如下：a液：甲酸0.6ml+600ml蒸馏水；室温保存。b液：碳酸钠(na2co3)：3g、氯化钠：6g、硫酸钠：30g；溶解于300ml蒸馏水；完全溶解后再用蒸馏水补足至500ml。c液：多聚甲醛5g加入到750ml鞘液(pbs)中；加入氢氧化钠(naoh)，使ph值偏碱可以助溶解，充分搅拌，待多聚甲醛完全溶解后再用鞘液补足至500ml。再用1mol/l的盐酸(hcl)调ph值至7.4即可。溶血素操作步骤：先加a液1ml，震荡观察至透亮(约5～10s)，立即加入b液2ml，震荡后加入c液体0.75ml。实施例4hla-b27抗原筛查(流式细胞术)辅助溶血素试剂比对数据一、检测系统信息：项目：hla-b27抗原筛查(流式细胞术)仪器名称：beckmancoulterfc500流式细胞仪仪器型号：cytomicsfc500mpl(sn:av08034)试剂及厂商：hla-b27kitbd公司hla-b27bdfacsbd公司检测方法：流式细胞术对照组：bdfacs成品溶血素；实验组：本发明实施例1～3提供的溶血素。二、验证内容及结果正确度：hla-b27运用了beckmancoulterfc500mpl(序列号at08034)仪器进行了bdfacs成品溶血素结果和本发明实施例1～3提供的溶血素结果检测对比，分析的结果一致，故hla-b27实验通过了正确度验证。见表2。特异性：hla-b27运用了cytomicsfc500mpl(序列号at08034)仪器进行了bdfacs成品溶血素结果和本发明实施例1～3提供的溶血素结果检测对比，分析的结果一致，故hla-b27实验特异性为100％。见表1。灵敏度：hla-b27运用了cytomicsfc500mpl(序列号at08034)仪器进行了bdfacs成品溶血素结果和本发明实施例1～3提供的溶血素结果检测对比，分析的结果一致，故hla-b27实验灵敏度为100％。见表1。携带污染率：使用标准微球上机进行测试，连续测试3次，计算标定区域的颗粒数，分别计为h1-1，h1-2，h1-3，进行一次样品管反冲循环后，再进行空白数量测试，连续测试3次，计算标定区域的颗粒数，分别计为l1-1，l1-2，l1-3；按此程序循环3次，再按照以下公式计算携带污染率(ci)，取最大值。ci＝(l1-1-l1-3)/(h1-1-h1-3)*100％判定标准：ci≤1％检测结果：如图1～图12所示。h1-1：6347；h1-3：6102；l1-1：0；l1-3：0；c1＝0％。h2-1：6581；h2-3：6332；l2-1：1；l2-3：0；c2＝0.04％。h3-1：5968；h3-3：6270；l3-1：3；l3-3：0；c3＝0.1％。比对实验前，对仪器进行3次检测的携带污染率结果≤1％，仪器携带污染率≤1％。符合要求。检测时间为2015年5月。表1临床特异度及临床敏感度评估表表2正确度评价验证表(不同检测系统)综合上述结果，本发明提供的溶血素hla-b27检测项目正确度、特异性、灵敏性、携带污染率验证结果均可接受，可用于临床标本检测。实施例5对照组：bdfacs成品溶血素；实验组：本发明实施例1～3提供的溶血素。生产、试验操作情况见表3。1、成本节约：(1)自配溶血素成本：按照自配溶血素的规格算，每瓶固体成品原料可够配置溶血素33次，每次可配置溶血素体积为500ml,总共可供配置溶血素容积为33*500＝16500ml。自配溶血素价格每套(多聚甲醛、碳酸钠等全部原料)约100元左右。(2)厂家溶血素成本：溶血素规格：100ml，按1:9的比例用蒸馏水稀释后用于实验，即每瓶可配置成溶血素溶剂为1000ml。每瓶厂家溶血素价格约为1400元。换算成自配溶血素每瓶可配置的体积16500ml，成本约为16500/1000*1400＝23100元。(3)综上，如果换成自配的溶血素，等体积的厂家成品溶血素成本是自配的溶血素成本的23100/100＝231倍。表3组别对照组实验组生产成本(元)23100100#溶血时间15min10#s*示与对照组相比具有显著差异(p＜0.05)，#示与对照组相比具有显著差异(p＜0.01)。2、时间节约：用厂家提供的商品化溶血素，溶血时间为15min，而用自配溶血素溶血时间仅为10s，缩短了实验的等待时间和仪器的等待时间。实施例6对照组1：组分和配制方法同实施例1～3，ph值为7.2。对照组2：组分和配制方法同实施例1～3，ph值为7.3。对照组3：组分和配制方法同实施例1～3，ph值为7.5。对照组4：组分和配制方法同实施例1～3，ph值为7.6。实验组：实施例1～3，ph值为7.4。比较结果见表4。表4由表4可知，溶血素的ph值为7.4时，溶血时间较短，溶血效果较完全，细胞碎片较少，上机检测效果较好，具有较好的灵敏度、特异性和正确度。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页12