一种同时检测营养素软胶囊中多种维生素含量的方法与流程

本发明属于药物分析领域，具体涉及一种同时检测营养素软胶囊中多种维生素含量的方法。

背景技术：

随着社会的发展和对营养需求的提高，市场上出现了越来越多的含复合维生素的产品，维生素过量补充也对身体不利，因此需要对产品中的维生素含量进行监控，这就需要一种快速测定的方法，高效液相色谱法是维生素含量测定的一种可行的方法。但目前该方法仅能实现对其中一两种成分进行检测，造成整个过程试剂消耗量较大，检测周期长，检测费用高，而且现有检测方法的准确性，灵敏度等较差。

cn1582756a公开了一种孕妇营养素软胶囊，它由维生素c、烟酰胺、维生素e、泛酸、维生素b6、维生素b1、维生素b2、β-胡萝卜素、叶酸、维生素d2、维生素b12、无水磷酸氢钙、重质氧化镁等多种维生素和矿物质组成，目前只能分多次对其中的维生素类成分进行检测，尚无同时检测多种成分的文献报导。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有技术中存在的缺陷，提供一种同时检测营养素软胶囊中多种维生素含量的方法，同时提高检测的准确性和灵敏度。

本发明所采用的技术方案如下：

一种同时检测营养素软胶囊中多种维生素含量的方法，所述维生素为叶酸、烟酰胺、维生素b1、维生素b2、维生素b6、维生素c，该方法包括将待测样品提取后上高效液相色谱仪进行检测的步骤，所述高效液相色谱仪含有紫外检测器，所述紫外检测器的设定检测波长为250～280nm，所述高效液相色谱仪的色谱柱为c18色谱柱，流动相为缓冲液与乙腈的混合液，采用匀速洗脱，柱温为25～35℃。

优选地，所述待测样品提取方法是：取软胶囊内容物1g，置于50ml容量瓶中，加入流动相，于45℃超声30min，冷却至室温，用流动相定容至刻度，摇匀后取10ml离心，上清液用0.45μm滤膜过滤，弃去初滤液，取续滤液作为供试品溶液。

优选地，所述检测波长为260nm。

优选地，所述流动相中缓冲液与乙腈的体积比为80～95∶20～5。

进一步优选地，所述流动相中缓冲液与乙腈的体积比为90∶10。

优选地，所述缓冲液含1～5mm离子对试剂和30～100mm缓冲盐，磷酸调节ph为2～4，所述离子对试剂选自四丁基氢氧化铵、四丁基溴化铵、十二烷基三甲基氯化铵、戊烷磺酸钠、己烷磺酸钠、庚烷磺酸钠、辛烷磺酸钠、癸烷磺酸钠，优选庚烷磺酸钠；所述缓冲盐选自磷酸或醋酸的钠盐或钾盐。

进一步优选地，所述缓冲液含2mm离子对试剂和50mm缓冲盐，磷酸调节ph为3。

优选地，所述柱温为30℃。

优选地，所述匀速洗脱的流速为0.5～2ml/min。

本发明的有益效果是：

1)本发明采用流动相作为提取液，弱酸保证溶液环境呈适宜酸性，使叶酸、烟酰胺、维生素b1、维生素b2、维生素b6、维生素c在提取液中更稳定，有利于检测结果准确；并且，在进行高效液相检测时，采用离子对作为流动相，既能稳定维生素，又能够调节所述维生素在色谱柱内的保留时间和峰形，实现了叶酸、烟酰胺、维生素b1、维生素b2、维生素b6、维生素c的有效分离与准确检测。特别是，当选用含有50mmol/l磷酸二氢钾溶液，2mmol/l庚烷磺酸钠的离子对溶液时，分离效果和检测准确度可以达到最优。

2)本发明检测前处理中采用0.45μm及以下的滤膜过滤检测液，过滤效果好，有效保护柱子免受杂质影响，增长色谱柱的使用寿命。

3)本发明的检测方法能够一次前处理完成六种维生素检测，且处理过程简单，检测结果精确度高。

4)本发明检测时间短，操作过程更加安全简单，使用试剂量小，结果准确稳定。

附图说明

图1是实施例1中采用流动相提取后得到的液相色谱图。

图2是实施例1中采用水提取后得到的液相色谱图。

图3是实施例1中采用50％乙醇提取后得到的液相色谱图。

图4是290nm检测波长得到的液相色谱图。

图5是流动性a为含50mm磷酸氢二钠的缓冲盐溶液，磷酸调节ph至3得到的液相色谱图。

图6是流动性a为含2mm庚烷磺酸钠的缓冲盐溶液，磷酸调节ph至3得到的液相色谱图。

图7是流动性a为含2mm庚烷磺酸钠和50mm磷酸氢二钠的缓冲盐溶液，磷酸调节ph至5得到的液相色谱图。

图8是流动性比例为90:20得到的高效液相色谱图。

图9是柱温20℃得到的高效液相色谱图。

图10是柱温40℃得到的高效液相色谱图。

图11是标准品溶液的高效液相色谱图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细地说明。

实施例1样品溶液制备方法的选择

1.取胶囊内容物1g，置于50ml容量瓶中，加入适量流动相，45℃超声30min，冷却至室温，用流动相稀释至刻度，摇匀后取10ml离心，取上清液用0.45μm滤膜过滤，弃去初滤液，取续滤液作为供试品溶液。

2.取胶囊内容物1g，置于50ml容量瓶中，加入适量水，于45℃超声30min，冷却至室温，用水稀释至刻度，摇匀后取10ml离心，取上清液用0.45μm滤膜过滤，弃去初滤液，取续滤液作为供试品溶液。

3.取胶囊内容物1g，置于50ml容量瓶中，加入适量50％乙醇，于45℃超声30min，冷却至室温，用50％乙醇稀释至刻度，摇匀后取10ml离心，取上清液用0.45μm滤膜过滤，弃去初滤液，取续滤液作为供试品溶液。

仪器：waters2695/2998型高效液相色谱仪系列(waters，包括四元泵、自动进样器、柱温箱、pda检测器、empower3色谱工作站)

将以上溶液进行高效液相色谱法检测，检测条件均如下所示：

所用的色谱柱固定相为十八烷基键合硅胶，硅胶的粒径为3-10μm；柱高为250mm，内径为4.6mm；

进样量为10μl；

流动相由体积比为90：10的缓冲液和乙腈组成；缓冲液含2mm庚烷磺酸钠和50mm磷酸氢二钠，其余为水，用磷酸调节ph至3.0；洗脱方式为匀速；

流速为1.0ml/min；

柱温为30℃；

检测波长为260nm；

结果：如图1至图3所示；经用流动相提取后，与水和乙醇提取相比，能明显减少杂质，主峰处与杂质分离效果好，故优选流动相提取。

实施例2检测波长的选择

样品溶液制备：取胶囊内容物1g，置于50ml容量瓶中，加入适量流动相，45℃超声30min，冷却至室温，用流动相稀释至刻度，摇匀后取10ml离心，取上清液用0.45μm滤膜过滤，弃去初滤液，取续滤液作为供试品溶液。

检测波长：260nm、290nm

其它条件与实施例1相同。

结果：从图1﹑图4可看出，波长为290nm时，维生素b1(17.652min)、维生素b1(18.539min)不能有效检出，且多出3.304min干扰维生素c测定；波长为260nm时，维生素c(2.830min)、烟酰胺(4.262min)、维生素b6(6.962min)、叶酸(14.438min)、维生素b2(17.652min)、维生素b1(18.539min)都能有效检出，且无其它干扰测定，故260nm是最合适检测波长。

实施例3流动相的选择

(1)a为含50mm磷酸氢二钠的缓冲盐溶液，用磷酸调节ph至3；b为乙腈

(2)a为含2mm庚烷磺酸钠的缓冲盐溶液，用磷酸调节ph至3；b为乙腈

(3)a为含2mm庚烷磺酸钠和50mm磷酸氢二钠的缓冲盐溶液，用磷酸调节ph至5.0；b为乙腈

(4)a为含2mm庚烷磺酸钠和50mm磷酸氢二钠的缓冲盐溶液，用磷酸调节ph至3.0；b为乙腈

流动相体积比为90：10；

其它条件与实施例1相同。

结果：由图1、图5～7可看出，图5中各色谱峰分离不完全，且拖尾严重；图6中虽然色谱峰分离有一定改变，峰型还不够理想，保留时间也有所延长；图7样品的杂峰变多，2.8min处色谱峰分离效果不好，未完全分开；图1峰型和分离度最好。

实施例4流动相比例选择

改变流动相体积比：90∶20；90∶10

其它条件与实施例1相同。

结果：如图8、图1所示，图8中，2.8min、4.2min、11.0min峰拖尾，出峰时间比图1快，但是峰面积与图1比较，6min、14min比图1小，主要因为乙腈量大使各峰保留时间变化，与图8相比，图1较好，故流动相比例为90:10。

实施例5柱温的选择

色谱柱柱温：20℃﹑30℃、40℃

其它条件与实施例1相同。

结果：如图1、9、10所示，柱温20℃时，出峰时间有一定的延长，2.8min、4.2min处，峰出现拖尾，在19.9min处，出现裂峰，分离效果变差；柱温40℃时，出峰时间有所提前，但是由于温度升高杂峰变多(约3min、5min处)，且分离不佳，影响测定，柱温在30℃时，上述现象均明显改善，因此，最优选择30℃。

实施例6营养素软胶囊中叶酸、烟酰胺、维生素b1、维生素b2、维生素b6、维生素c的含量测定。

仪器采用waters2695/2998高效液相色谱仪；

mettlerxp205电子天平；

孕妇营养素软胶囊按cn1582756a实施例1的方法自制；

叶酸、烟酰胺、维生素b1、维生素b2、维生素b6、维生素c标准品均购自中国食品药品检定研究院；

其它试剂为分析纯。

一、标准品溶液的配制

混合储备液：分别准确称取维生素b1标准品30mg和维生素b6标准品40mg，于10ml量瓶中，加2ml纯化水溶解，然后用甲醇稀释至刻度，摇匀。

维生素b2储备液：准确称取20mg维生素b2标准品于10ml容量瓶中，用稀醋酸溶液(6ml冰醋酸加水稀释成100ml)溶解，用甲醇稀释至刻度，摇匀。

叶酸储备液：准确称取10mg的叶酸标准品于100ml的容量瓶中，加2ml0.1mol/l的氢氧化钠溶液溶解，用甲醇稀释至刻度，摇匀。

标准溶液：分别称取维生素c标准品100mg和烟酰胺20mg于100ml的量瓶中，加2ml纯化水溶解，分别准确移取混合储备液1ml、维生素b2储备液1ml、叶酸储备液10ml于此量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀。

上标准溶液中含0.01mg/ml叶酸、0.2mg/ml烟酰胺、0.03mg/ml维生素b1、0.02mg/ml维生素b2、0.04mg/ml维生素b6、1.0mg/ml维生素c。

二、供试品溶液的配制

取样品内容物1g，置于50ml容量瓶中，加入流动相，于45℃超声30min，冷却至室温，用流动相稀释至刻度，摇匀后取10ml离心，取上清液用0.45μm滤膜过滤，弃去初滤液，取续滤液作为供试品溶液。

三、供试品溶液中叶酸、烟酰胺、维生素b1、维生素b2、维生素b6、维生素c含量的测定

将标准品溶液和供试品溶液进行高效液相色谱法检测，检测条件如下：

所用的色谱柱固定相为十八烷基键合硅胶，硅胶的粒径为3-10μm；柱高为250mm，内径为4.6mm；

进样量为10μl；

流动相为由体积比为90：10的缓冲液和乙腈组成的混合液；缓冲液中含2mm庚烷磺酸钠和50mm磷酸氢二钠，用磷酸调节ph至3.0；流动方式为匀速流动；

流速为1.0ml/min；

柱温为30℃；

检测波长为260nm；

按外标法计算叶酸、烟酰胺、维生素b1、维生素b2、维生素b6、维生素c的含量。

记录标准品对应浓度下各维生素的峰面积浓度和供试品与标准品对应位置峰面积，按照如下公式计算对照品校正因子：

计算公式：

式中：

wi是供试品中维生素的含量，mg/100g；

ai是供试品溶液峰面积；

mt是标准品取样量，mg；

si是供试品溶液稀释倍数；

at是标准品溶液峰面积；

mi是供试品取样量，g；

st是对照品溶液稀释倍数。

按照上计算公式：供试品中叶酸含量为49.3mg/100g、烟酰胺含量为1118.5mg/100g、维生素b1含量为122.3mg/100g、维生素b2含量为126.8mg/100g、维生素b6含量为198.9mg/100g、维生素c含量为6016.3mg/100g。

实施例7线性试验

一、配制一系列不同浓度的叶酸、烟酰胺、维生素b1、维生素b2、维生素b6、维生素c标准品溶液；

精密量取叶酸、烟酰胺、维生素b1、维生素b2、维生素b6、维生素c品适量，配制成一系列浓度的溶液。

二、将一系列不同浓度的叶酸、烟酰胺、维生素b1、维生素b2、维生素b6、维生素c标准品溶液用高效液相色普法进行检测，检测条件同实施例6中色谱条件；

检查完毕记录每个浓度下标准品的峰面积，以浓度为自身变量，以其对应的峰面积为因变量，得到线性回归方程。

所得结果如下表1-6所示。

表1叶酸线性关系

表2烟酰胺线性关系

表3维生素b1线性关系

表4维生素b2线性关系

表5维生素b6线性关系

表6维生素c线性关系

上述维生素线性方程为：

叶酸在0.0040～0.0162mg/ml浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系；线性方程为y＝9,228,585.2948x-1,565.9115，r²＝0.9998，r＝0.9998；

烟酰胺在0.0811～0.3244mg/ml浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系；线性方程为y＝18,872,719.5603x-10,963.3636，r²＝0.9999，r＝0.9999；

维生素b1在0.0123～0.0493mg/ml浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系；线性方程为y＝21,881,044.8134x-2,716.1803，r²＝0.9998，r＝0.9999；

维生素b2在0.0082～0.0328mg/ml浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系；线性方程为y＝30,779,341.4634x+1,502.3000，r²＝0.9999，r＝0.9999；

维生素b6在0.0165～0.0661mg/ml浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系；线性方程为y＝2,122,967.8476x-641.9721，r²＝0.9999，r＝0.9999；

维生素c在0.2728～1.0912mg/ml浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系；线性方程为y＝16,931,678.8856x+35,501.0000，r²＝0.9999，r＝0.9999。

实施例8回收率试验

取市售样品，按照国标法(gb5009.211-2014食品安全国家标准食品中叶酸的测定、gb5009.89-2016食品安全国家标准食品中烟酸和烟酰胺的测定、gb5009.84-2016食品安全国家标准食品中维生素b1的测定、gb5009.85-2016食品安全国家标准食品中维生素b2的测定、gb5009.154-2016食品安全国家标准食品中维生素b6的测定、gb5009.211-2014食品安全国家标准食品中叶酸的测定、gb5413.18-2010食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品中维生素c的测定、gb5009.86-2016食品安全国家标准食品中抗坏血酸的测定)进行测定后，加入一定量标准品溶液，按照上述方法进行测定，结果见下表7、表8、表9。

表7样品1维生素含量测定

表8样品2维生素含量测定

表9样品3维生素含量测定

由表7、表8,、表9可知，样品的回收率均在90％～105％之间，rsd％均小于2％，表明该方法准确度较好。

实施例9精密度试验

精密吸取供试品溶液10μl，按实施例1的色谱条件，重复进样6次，各维生素峰面积的rsd％均小于2％，表明本方法精密度较好。结果见表10。

表10供试品溶液精密度试验测定

实施例10重复性试验

取同一批供试品6份，按实施例1供试品溶液制备方法制成供试品溶液，进样测定，结果见表11，各维生素峰面积的rsd％均小于2.0％，表明本法有良好的重复性。

表11供试品重复性试验测定

实施例11稳定性试验

同一供试品溶液，按实施例1的色谱条件，分别于配置后0，2，4，8，12小时进样，放置时间点内测得峰面积的rsd％均小于2.0％，结果见表12；由结果可知，供试品溶液具有很好的稳定性。

表12供试品稳定性试验测定