苯酚类化合物作为甲型强心苷显色剂的用途及甲型强心苷含量的测定方法与流程

本发明涉及甲型强心苷含量测定方法技术领域，尤其是涉及苯酚类化合物作为甲型强心苷显色剂的用途及甲型强心苷含量的测定方法。

背景技术：

强心苷是存在于植物中具有强心作用的甾体类化合物，由强心苷元和糖缩合而成，强心苷根据取代基团的不同分为甲型强心苷和乙型强心苷两类，其中尤以甲型强心苷最为常见，如洋地黄毒苷和乌本苷等。甲型强心苷不仅具有广泛的药理作用，而且具有强心、抗肿瘤、利尿、抗癌等活性，使得越来越多的学者开始关注甲型强心苷。但是甲型强心苷含量的测定一直是甲型强心苷应用研究方面的难点，《中国药典》2015版中缺乏对测定甲型强心苷的方法的记载，而目前文献报道也没有关于甲型强心苷含量的测定方法。

有鉴于此，特提出本发明。

技术实现要素：

本发明的目的之一在于提供一种苯酚类化合物作为甲型强心苷显色剂的用途，以缓解甲型强心苷含量的测定一直是甲型强心苷应用研究方面的难点的技术问题。

本发明提供了苯酚类化合物作为甲型强心苷显色剂的用途，所述苯酚类化合物的通式为：

其中，r1、r2、r3、r4和r5均独立地选自氢、卤素、羧基、硝基、c1-6烷基、c3-5链烯基、c3-5炔基、酰基、醚基和酯基中的一种，且r1、r2、r3、r4和r5不同时为氢，其中酰基的通式为cor6，醚基的通式为or7，酯基的通式为coor8，所述r6、r7和r8均独立地选自c1-6烷基、c1-6烷氧基或c1-6烷氧酯基。

进一步的，所述苯酚类化合物选自3,5-二硝基苯酚、间硝基苯酚、2,6-二硝基苯酚、对甲基苯酚、对氯苯酚、对溴苯酚、对乙酰基苯酚、对硝基苯酚、3,5-二溴苯酚、3,5-二甲基苯酚、2,6-二甲基苯酚、3,5-二氟苯酚、间氟苯酚、对叔丁基苯酚、对乙基苯酚、对甲氧基苯酚和2-硝基苯酚中的一种，优选为3,5-二硝基苯酚或3,5-二溴苯酚。

本发明的目的之二在于提供一种甲型强心苷含量的测定方法，以缓解甲型强心苷含量的测定一直是甲型强心苷应用研究方面的难点的技术问题。

本发明提供的甲型强心苷含量的测定方法，包括如下步骤：

将甲型强心苷溶解于醇溶剂中，配置成甲型强心苷的醇溶液，再与苯酚类化合物混合，进行显色反应，测定显色溶液在485nm-500nm处的吸光度，得到甲型强心苷的含量。

进一步的，所述甲型强心苷含量的测定方法，包括如下步骤：

(a)配置不同浓度的甲型强心苷的醇溶液，使之分别与苯酚类化合物进行显色反应，测定不同浓度的甲型强心苷的醇溶液显色后的吸光度，得到标准曲线及其回归方程；

(b)将待测甲型强心苷溶解于醇溶剂中，配置成甲型强心苷醇溶液，再与苯酚类化合物进行显色反应，测定吸光度；

(c)将测定的吸光度代入回归方程，得到待测甲型强心苷的醇溶液中甲型强心苷的含量。

进一步的，先将苯酚类化合物溶解于水，配置成甲型强心苷显色剂溶液，再与甲型强心苷的醇溶液混合，进行显色反应。

进一步的，甲型强心苷的醇溶液中甲型强心苷的浓度为16-32mg/l，甲型强心苷显色剂溶液中，苯酚类化合物的摩尔浓度为0.01-0.1mol/l。

进一步的，甲型强心苷醇溶液与甲型强心苷显色剂溶液的体积比为(2-4)：1，优选为3：1。

进一步的，进行显色反应的时间为5-40min，优选为10-30min，更优选为20min。

进一步的，所述醇溶剂为低碳醇，所述低碳醇优选为甲醇、乙醇或丙醇，更优选为乙醇。

进一步的，所述甲型强心苷提取于植物，其提取方法包括如下步骤：先将植物进行粉碎，再采用乙醇作为提取液，进行超声提取，即得到甲型强心苷的乙醇溶液。

本发明提供的甲型强心苷显色剂，能够与甲型强心苷进行显色反应，生成橙黄色溶液，使其能够通过测定橙黄色溶液在485nm-500nm处的吸光度，得到甲型强心苷的含量，从而为甲型强心苷含量的测定提供了一种简便、快捷、准确、高效的方法，解决了制约甲型强心苷应用研究的难题，能够有效促进甲型强心苷在肿瘤和癌症治疗方面的应用。

本发明提供的甲型强心苷含量的测定方法，通过甲型强心苷与甲型强心苷发生显色反应，生成橙黄色溶液，然后通过测定橙黄色溶液在485nm-500nm处的吸光度，得到甲型强心苷的含量，从而为甲型强心苷含量的测定提供了一种简便、快捷、准确、高效的方法，解决了制约甲型强心苷应用研究的难题，能够有效促进甲型强心苷在肿瘤和癌症治疗方面的应用。

附图说明

图1为甲型强心苷的乙醇溶液与甲型强心苷显色剂溶液的体积比与吸光度值的关系曲线；

图2为甲型强心苷的乙醇溶液与甲型强心苷显色剂溶液的反应时间与吸光度值的关系曲线；

图3为甲型强心苷浓度与吸光度的关系曲线。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

根据本发明的一个方面，本发明提供了苯酚类化合物作为甲型强心苷显色剂的用途，所述苯酚类化合物的通式为：

r1、r2、r3、r4和r5均独立地选自氢、卤素、羧基、硝基、c1-6烷基、c3-5链烯基、c3-5炔基、酰基、醚基和酯基中的一种，且r1、r2、r3、r4和r5不同时为氢，其中酰基的通式为cor6，醚基的通式为or7，酯基的通式为coor8，所述r6、r7和r8均独立地选自c1-6烷基、c1-6烷氧基或c1-6烷氧酯基。

本发明提供的苯酚类化合物，能够与甲型强心苷进行显色反应，生成橙黄色溶液，使其能够通过测定橙黄色溶液在485nm-500nm处的吸光度，得到甲型强心苷的含量，从而为甲型强心苷含量的测定提供了一种简便、快捷、准确、高效的方法，解决了制约甲型强心苷应用研究的难题，能够有效促进甲型强心苷在肿瘤和癌症治疗方面的应用。

在本发明中，测定显色溶液的典型但非限制性波长如为486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498或499nm。

在本发明中，卤素为cl、br或f；c1-6烷基选自甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、戊基、已基中的一种；c3-5链烯基选自丙烯、丁烯和戊烯中的一种；c3-5炔基选自丙炔基、丁炔基和戊炔基中的一种；酰基选自甲酰基、乙酰基和丙酰基中的一种；醚基选自甲醚基、乙醚基和丙醚基中的一种；酯基选自甲酯基、乙酯基和丙酯基中的一种；c1-6烷基选自甲基、乙基、丙基、丁基、戊基和己基中的一种，c1-6烷氧基选自甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、戊氧基和己氧基中的一种；c1-6烷氧酯基选自甲氧酯基、乙氧酯基、丙氧酯基、丁氧酯基、戊氧酯基和己氧酯基中的一种。

在本发明的优选实施方式中，所述苯酚类化合物选自3,5-二硝基苯酚、间硝基苯酚、2,6-二硝基苯酚、对甲基苯酚、对氯苯酚、对溴苯酚、对乙酰基苯酚、对硝基苯酚、3,5-二溴苯酚、3,5-二甲基苯酚、2,6-二甲基苯酚、3，5-二氟苯酚、间氟苯酚、对叔丁基苯酚、对乙基苯酚、对甲氧基苯酚和2-硝基苯酚中的一种，优选为3,5-二硝基苯酚或3,5-二溴苯酚。

根据本发明的另一个方面，本发明提供了一种甲型强心苷含量的测定方法，包括如下步骤：

将甲型强心苷溶解于醇溶剂中，配置成甲型强心苷的醇溶液，再与苯酚类化合物混合，进行显色反应，测定显色溶液在485nm-500nm处的吸光度，得到甲型强心苷的含量。

本发明提供的甲型强心苷含量的测定方法，通过甲型强心苷与苯酚类化合物发生显色反应，生成橙黄色溶液，然后通过测定橙黄色溶液在485nm-500nm处的吸光度，得到甲型强心苷的含量，从而为甲型强心苷含量的测定提供了一种简便、快捷、准确、高效的方法，解决了制约甲型强心苷应用研究的难题，能够有效促进甲型强心苷在肿瘤和癌症治疗方面的应用。

在本发明的优选实施方式中，甲型强心苷含量的测定方法，包括如下步骤：

(a)配置不同浓度的甲型强心苷的醇溶液，使之分别与苯酚类化合物进行显色反应，测定不同浓度的甲型强心苷的醇溶液显色后的吸光度，得到标准曲线及其回归方程；

(b)将待测甲型强心苷溶解于醇溶剂中，配置成甲型强心苷醇溶液，再与苯酚类化合物进行显色反应，测定吸光度；

(c)将测定的吸光度代入回归方程，得到待测甲型强心苷的醇溶液中甲型强心苷的含量。

在本发明的优选实施方式中，在步骤(a)中，先配置不同浓度的甲型强心苷醇溶液，然后在不同浓度的甲型强心苷的醇溶液中加入苯酚类化合物，使得甲型强心苷与苯酚类化合物发生显色发生，生成不同吸光度的橙黄色溶液，通过分光光度计分别测定不同吸光度的橙黄色溶液的吸光度，拟定甲型强心苷浓度与吸光度的标准曲线和回归方程；优选的，配置不少于5种不同浓度的甲型强心苷的醇溶液，以保证甲型强心苷浓度与吸光度的标准曲线和回归方程的准确性。

在步骤(b)中，将苯酚类化合物加入待测的甲型强心苷的醇溶液中，发生显色反应，生成橙黄色溶液，采用分光光度计测定橙黄色溶液的吸光度。

在步骤(c)中，将测定的吸光度代入回归方程，得到待测甲型强心苷的醇溶液中甲型强心苷的含量。

在本发明的优选实施方式中，先将苯酚类化合物溶解于水，配置成甲型强心苷显色剂溶液，再与甲型强心苷的醇溶液混合，进行显色反应。

通过先将苯酚类化合物溶解于水，配置成甲型强心苷显色剂溶液，使其与甲型强心苷醇溶液混合进行显色反应时，显色更灵敏，也更便于使甲型强心苷显色剂溶液与甲型强心苷的醇溶液混合的更均匀，显色反应进行的更充分，测定的吸光度更准确。

在本发明的优选实施方式中，甲型强心苷的醇溶液中，甲型强心苷的浓度为16-32mg/l；甲型强心苷显色剂溶液中，苯酚类化合物的摩尔浓度为0.01-0.1mol/l。

为了使得甲型强心苷的含量测定的更加准确，显色反应更加灵敏，将甲型强心苷配置成浓度为16-32mg/l的醇溶液，将苯酚类化合物配置成浓度为0.01-0.1mol/l的甲型强心苷显色剂溶液，尤其是当甲型强心苷的醇溶液中，甲型强心苷的浓度为24mg/l，甲型强心苷显色剂溶剂中，苯酚类化合物的摩尔浓度为0.05mol/l时，其进行显色反应最灵敏，得到的甲型强心苷的浓度最准确。

在本发明的优选实施方式中，甲型强心苷的醇溶液与甲型强心苷显色剂溶液的体积比为(2-4)：1，优选为3：1。

为了验证甲型强心苷的醇溶液与甲型强心苷显色剂溶液进行显色反应的最佳体积比，分别将浓度为24mg/l的甲型强心苷的乙醇溶液与摩尔浓度为0.5mol/l的甲型强心苷显色剂溶液的体积比设置为8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7进行显色反应20min后测定吸光度，结果如图1所示，从图1可以看出，浓度为24mg/l的甲型强心苷的乙醇溶液与摩尔浓度为0.5mol/l的甲型强心苷显色剂溶液的体积比从8:1变化到1:7时，吸光度值先逐渐变大，然后逐渐减小，当两者的体积比为(2-4)：1，溶液的吸光度较高，尤其是为3：1时，溶液的吸光度值最大。

另外，还分别测定了浓度为28mg/l的甲型强心苷的甲醇溶液与摩尔浓度为0.5mol/l的甲型强心苷显色剂溶液的体积比设置为8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7进行显色反应20min后测定吸光度，其曲线的规律与图1相同，在此不再赘述，也是当两者的体积比为(2-4)：1，溶液的吸光度较高，尤其是为3：1时，溶液的吸光度值最大。

此外，还分别测定了浓度为30mg/l的甲型强心苷的丙醇溶液与摩尔浓度为0.5mol/l的甲型强心苷显色剂溶液的体积比设置为8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7进行显色反应20min后测定吸光度，其曲线的规律与图1相同，在此不再赘述，也是当当两者的体积比为(2-4)：1，溶液的吸光度较高，尤其是为3：1时，溶液的吸光度值最大。

这说明甲型强心苷的醇溶液与甲型强心苷显色剂溶液的体积比为(2-4)：1，优选为3：1时，其显色更灵敏，甲型强心苷含量测定的更准确。

在本发明的优选实施方式中，显色反应的时间为5-40min，优选为10-30min，更优选为20min。

为了验证显色反应时间与吸光度值的的关系，将浓度为24mg/l的甲型强心苷的乙醇溶液与摩尔浓度为0.5mol/l的甲型强心苷显色剂溶液的按照体积比3:1进行显色反应，分别测定显色时间为2min、4min、6min、8min、10min、15min、20min、25min、30min、40min、50min、60min时的吸光度，拟定显色时间与吸光度值的关系曲线，如图2所示，从图2可以看出，随着反应时间的不断增大，吸光度值不断增高，当反应时间为20min时，吸光度值达到最大，20min后随着时间的增大，吸光度值基本不变，并且能稳定1小时以上，因此，为了提高甲型强心苷含量的测定效率，显色反应的时间为5-40min时，尤其是显色反应时间为10-30min时，进行吸光度测定效果较佳，显色反应20min时，进行吸光度测定稳定性最好，效果最佳。

另外，还分别测定了甲型强心苷的甲醇溶液和甲型强心苷的丙醇溶液的显色时间，与甲型强心苷的乙醇溶液的显色反应时间呈相同规律，在此不再赘述。

在本发明的优选实施方式中，甲型强心苷提取于植物，其提取方法包括如下步骤：先将植物进行粉碎，再以乙醇为提取液，进行超声提取，得到甲型强心苷的乙醇溶液。

在本发明的优选实施方式中，利用超声波的空化效应、机械效应及热效应等增强乙醇溶液对植物的穿透力，有助于植物中有效成分的溶出，从而提高甲型强心苷的提取率，缩短提取时间，降低提取温度，降低耗能，提高提取效率。

在本发明的优选实施方式中，在进行植物粉碎的过程中，将植物粉碎成40目的植物粉末。

通过将植物粉碎成40目的植物粉末，以便于将植物中的甲型强心苷完全提取出来。

上述植物为被子植物，如玄参科、夹竹桃科、萝藦科、百合科、十字花科和毛茛科等。

下面结合实施例和对比例对本发明提供的技术方案做进一步的描述。

实施例1

本实施例提供了一种甲型强心苷含量与吸光度的标准曲线的绘制方法，按照如下步骤进行：

(a)准确称取10mg甲型强心苷，置于25ml容量瓶，用乙醇定容，配置成浓度为400mg/l的标准品母液；

(b)分别称取0、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2ml的标准品母液，分别置于6个10ml的具塞试管中，用乙醇定容；

(c)将3,5-二硝基苯酚溶于水，制成0.5mol/l的甲型强心苷显色剂溶液

(d)分别取步骤(b)配置甲型强心苷的乙醇溶液3ml置于6支试管中，依次加入1ml浓度为0.5mol/l的甲型强心苷显色剂溶液，反应20min后，在495nm处，分别测定6支试管内溶液的吸光度，结果如表1所示：

表1

将表1中的数据拟定甲型强心苷浓度与吸光度关系曲线，如图3所示，从该曲线可以看出，甲型强心苷的含量与吸光度呈线性相关，且根据其线性相关性得到线性回归方程y＝15.536x+0.0027,且其线性相关度r²为0.999，这说明该线性回归方程的线性拟合度好，该线性回归方程能够准确计算出甲型强心苷的含量。

实施例2

本实施例提供了一种甲型强心苷含量与吸光度的标准曲线的绘制方法，其与实施例1的不同之处在于，在步骤(c)中，将3,5-二溴苯酚溶于水，制成0.5mol/l的甲型强心苷显色剂溶液，其6支试管的吸光度如表2所示：

表2

从表2中的数据可以看出，甲型强心苷的含量与吸光度呈线性相关，且根据其线性相关性得到线性回归方程y＝15.323x+0.0015,且其线性相关度r²为0.999，这说明该线性回归方程的线性拟合度好，该线性回归方程能够准确计算出甲型强心苷的含量。

实施例3

本实施例提供了一种甲型强心苷含量与吸光度的标准曲线的绘制方法，其与实施例1的不同之处在于，在步骤(c)中，将对甲基苯酚溶于水，制成0.5mol/l的甲型强心苷显色剂溶液，其6支试管的吸光度如表3所示：

表3

从表3中的数据可以看出，甲型强心苷的含量与吸光度呈线性相关，且根据其线性相关性得到线性回归方程y＝14.235x+0.0019,且其线性相关度r²为0.999，这说明该线性回归方程的线性拟合度好，该线性回归方程能够准确计算出甲型强心苷的含量。

实施例4

本实施例提供了一种甲型强心苷含量与吸光度的标准曲线的绘制方法，其与实施例1的不同之处在于，在步骤(c)中，将对氯苯酚溶于水，制成0.5mol/l的甲型强心苷显色剂溶液，其6支试管的吸光度如表4所示：

表4

从表4中的数据可以看出，甲型强心苷的含量与吸光度呈线性相关，且根据其线性相关性得到线性回归方程y＝14.525x+0.0016,且其线性相关度r²为0.999，这说明该线性回归方程的线性拟合度好，该线性回归方程能够准确计算出甲型强心苷的含量。

实施例5

本实施例提供了一种甲型强心苷含量与吸光度的标准曲线的绘制方法，其与实施例1的不同之处在于，在步骤(c)中，将对乙酰基苯酚溶于水，制成0.5mol/l的甲型强心苷显色剂溶液，其6支试管的吸光度如表5所示：

表5

将表5中的数据看出，甲型强心苷的含量与吸光度呈线性相关，且根据其线性相关性得到线性回归方程y＝14.226x+0.0021,且其线性相关度r²为0.999，这说明该线性回归方程的线性拟合度好，该线性回归方程能够准确计算出甲型强心苷的含量。

实施例6

本实施例提供了一种甲型强心苷含量与吸光度的标准曲线的绘制方法，其与实施例1的不同之处在于，在步骤(c)中，将对叔丁基苯酚溶于水，制成0.5mol/l的甲型强心苷显色剂溶液，其6支试管的吸光度如表6所示：

表6

将表6中的数据看出，甲型强心苷的含量与吸光度呈线性相关，且根据其线性相关性得到线性回归方程y＝14.823x+0.0024,且其线性相关度r²为0.999，这说明该线性回归方程的线性拟合度好，该线性回归方程能够准确计算出甲型强心苷的含量。

实施例7

本实施例提供了一种甲型强心苷含量与吸光度的标准曲线的绘制方法，其与实施例1的不同之处在于，在步骤(c)中，将对甲氧基苯酚溶于水，制成0.5mol/l的甲型强心苷显色剂溶液，其6支试管的吸光度如表7所示：

表7

将表7中的数据看出，甲型强心苷的含量与吸光度呈线性相关，且根据其线性相关性得到线性回归方程y＝14.458x+0.0018,且其线性相关度r²为0.999，这说明该线性回归方程的线性拟合度好，该线性回归方程能够准确计算出甲型强心苷的含量。

实施例8

本实施例提供了一种甲型强心苷含量与吸光度的标准曲线的绘制方法，其与实施例1的不同之处在于，在步骤(c)中，将对丙炔基苯酚溶于水，制成0.5mol/l的甲型强心苷显色剂溶液，其6支试管的吸光度如表8所示：

表8

将表8中的数据看出，甲型强心苷的含量与吸光度呈线性相关，且根据其线性相关性得到线性回归方程y＝14.027x+0.0023,且其线性相关度r²为0.999，这说明该线性回归方程的线性拟合度好，该线性回归方程能够准确计算出甲型强心苷的含量。

实施例9

为了验证实施例1提供的线性回归方程的准确性，配置浓度为35mg/l的甲型强心苷的乙醇溶液，并取3ml置于试管中，加入3,5-二硝基苯酚配置的1ml浓度为0.5mol/l的甲型强心苷显色剂溶液，反应20min后，在495nm处，测定试管内溶液的吸光度，其吸光度值为0.5465，与线性回归方程y＝15.536x+0.0027相吻合，这说明采用3,5-二硝基苯酚作为甲型强心苷显色剂时，本发明实施例1提供的甲型强心苷含量的测定方法能够准确测定出甲型强心苷含量。

实施例10

为了验证实施例2提供的线性回归方程的准确性，配置浓度为30mg/l的甲型强心苷的乙醇溶液，并取3ml置于试管中，加入3,5-二溴苯酚配置的1ml浓度为0.5mol/l的甲型强心苷显色剂溶液，反应20min后，在495nm处，测定试管内溶液的吸光度，其吸光度值为0.4612，与线性回归方程y＝15.323x+0.0015相吻合，这说明采用3,5-二硝基苯酚作为甲型强心苷显色剂时，本发明实施例2提供的甲型强心苷含量的测定方法能够准确测定出甲型强心苷含量。

实施例11

为了验证实施例3提供的线性回归方程的准确性，配置浓度为20mg/l的甲型强心苷乙醇溶液，并取3ml置于试管中，加入对甲基苯酚配置的1ml浓度为0.5mol/l的甲型强心苷显色剂溶液，反应20min后，在495nm处，测定试管内溶液的吸光度，其吸光度值为0.2866，与线性回归方程y＝14.235x+0.0019相吻合，这说明采用对甲基苯酚作为甲型强心苷的显色剂时，本发明实施例3提供的甲型强心苷含量的测定方法能够准确测定出甲型强心苷含量。

实施例12

为了验证实施例4提供的线性回归方程的准确性，配置浓度为28mg/l的甲型强心苷的乙醇溶液，并取3ml置于试管中，加入对氯苯酚配置的1ml浓度为0.5mol/l的甲型强心苷显色剂溶液，反应20min后，在495nm处，测定试管内溶液的吸光度，其吸光度值为0.4083，与线性回归方程y＝14.525x+0.0016相吻合，这说明采用对氯苯酚作为甲型强心苷显色剂时，本发明实施例4提供的甲型强心苷含量的测定方法能够准确测定出甲型强心苷含量。

实施例13

为了验证实施例5提供的线性回归方程的准确性，配置浓度为22mg/l的甲型强心苷的乙醇溶液，并取3ml置于试管中，加入对乙酰基苯酚配置的1ml浓度为0.5mol/l的甲型强心苷显色剂溶液，反应20min后，在495nm处，测定试管内溶液的吸光度，其吸光度值为0.3151，与线性回归方程y＝14.226x+0.0021相吻合，这说明采用对乙酰基苯酚作为甲型强心苷显色剂时，本发明实施例5提供的甲型强心苷含量的测定方法能够准确测定出甲型强心苷含量。

实施例14

为了验证实施例5提供的线性回归方程的准确性，配置浓度为26mg/l的甲型强心苷的乙醇溶液，并取3ml置于试管中，加入对乙酰基苯酚配置的1ml浓度为0.5mol/l的甲型强心苷显色剂溶液，反应25min后，在495nm处，测定试管内溶液的吸光度，其吸光度值为0.3878，与线性回归方程y＝y＝14.823x+0.0024相吻合，这说明采用对乙酰基苯酚作为甲型强心苷显色剂时，本发明实施例6提供的甲型强心苷含量的测定方法能够准确测定出甲型强心苷含量。

实施例15

为了验证实施例5提供的线性回归方程的准确性，配置浓度为35mg/l的甲型强心苷的乙醇溶液，并取3ml置于试管中，加入对乙酰基苯酚配置的1ml浓度为0.5mol/l的甲型强心苷显色剂溶液，反应30min后，在495nm处，测定试管内溶液的吸光度，其吸光度值为0.5078，与线性回归方程y＝14.458x+0.0018相吻合，这说明采用对乙酰基苯酚作为甲型强心苷显色剂时，本发明实施例7提供的甲型强心苷含量的测定方法能够准确测定出甲型强心苷含量。

实施例16

为了验证实施例5提供的线性回归方程的准确性，配置浓度为27mg/l的甲型强心苷的乙醇溶液，并取3ml置于试管中，加入对乙酰基苯酚配置的1ml浓度为0.5mol/l的甲型强心苷显色剂溶液，反应10min后，在495nm处，测定试管内溶液的吸光度，其吸光度值为0.381，与线性回归方程y＝14.027x+0.0023相吻合，这说明采用对乙酰基苯酚作为甲型强心苷显色剂时，本发明实施例8提供的甲型强心苷含量的测定方法能够准确测定出甲型强心苷含量。

另外，从实施例1-8提供的甲型强心苷的含量与吸光度的线性回归方程可以看出，当采用3,5-二硝基苯酚和3,5-二溴苯酚作为甲型强心苷显色剂时，其吸光度的值更高，测定误差更小，测定结果更准确。

综上，本发明提供的甲型强心苷含量的测定方法，通过甲型强心苷与苯酚类化合物发生显色反应，生成橙黄色溶液，然后通过测定橙黄色溶液在485nm-500nm处的吸光度，得到甲型强心苷的含量，从而为甲型强心苷含量的测定提供了一种简便、快捷、准确、高效的方法，解决了制约甲型强心苷应用研究的难题，能够有效促进甲型强心苷在肿瘤和癌症治疗方面的应用。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。