一种基于光学显微镜的抗坏血酸浓度在线传感分析方法以及辅助显色剂与流程

本发明属于纳米材料和分析化学领域，涉及一种抗坏血酸光学检测方法。

背景技术：

抗坏血酸是一种可水溶的六碳糖酸，也是一种重要的神经调质，生理条件下有两个可解离的质子(pka＝4.04,11.34)。其具有的给电子性质使其在细胞内成为著名的小分子抗氧化剂和自由基清除剂，且部分疾病与抗坏血酸的水平有密切联系。因此，开发一种实时监控生理病理过程中抗坏血酸变化情况的传感方法具有实际意义。

目前关于抗坏血酸的含量的测定已有众多利用电化学检测抗坏血酸的方法，如恒电位分析法、差分脉冲伏安法、循环伏安法等。此外主要还有高效液相色谱法(hplc)、hplc-电化学检测联用法、毛细管电泳法、紫外比色法及荧光光谱法等。已报道文献中可实现在线分析的，主要以电化学方法为主，少有报道光学在线体系。光学分析方法检测抗坏血酸具有检测范围大、快速、简便、误差小等优点。但同时存在检测限高、反应时间长，难以连续和操作麻烦等问题。

目前已报道的光学在线体系中较为突出的一个工作是，赵美萍等结合显微镜拍照功能，及利用纳米金交联hs-peg-cooh及带有荧光基团的gsh-fitc的纳米探针实现了对s^2-离子及大鼠脑内h2s的实时在线检测。在其工作中，设计了一种微流控芯片来连续混合探针、s^2-离子样品/大鼠脑透析液及石蜡油，混合后引流至显微镜下的石英毛细管中拍照，并处理图像以得到荧光强度值。该工作虽可灵敏检测生理活性物质，但其基于荧光发光原理，对实验中环境光要求较多，且还未有更简单的、基于可见光吸收的光学在线传感体系的报道。

技术实现要素：

为了克服上述技术缺陷，本发明提供一种基于光学显微镜的抗坏血酸浓度在线传感分析方法。本发明提供的显色剂以及方法可连续、快速、简单、灵敏地检测抗坏血酸。

本发明首先提供了一种用于辅助光学显微镜在线传感分析抗坏血酸浓度的显色剂，所述显色剂为液态显色剂，由包括羟基氧化钴和3,3',5,5'-四甲基联苯胺的原料混合而成。

由于羟基氧化钴和3,3',5,5'-四甲基联苯胺混合后，原本呈现无色的3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液被羟基氧化钴氧化，氧化态的3,3',5,5'-四甲基联苯胺呈现蓝色，溶液体系呈现蓝色；当溶液体系中通入抗坏血酸时，蓝色的氧化态3,3',5,5'-四甲基联苯胺被抗坏血酸还原为无色的还原态3,3',5,5'-四甲基联苯胺，溶液体系变为无色。在此过程中溶液体系的光强度值会发生变化，并可被光学显微镜捕捉、拍摄。本发明依据上述反应以及颜色的变化实现对抗坏血酸的检测。

为了提高检测的精确度，本发明优选在制备所述显色剂时，羟基氧化钴和3,3',5,5'-四甲基联苯胺的摩尔用量比为(1～1)：(3～1)。

为了能准确检验1～50μm浓度范围内的抗坏血酸，本发明优选所述显色剂由浓度35～45μg/ml的羟基氧化钴混悬液与浓度1.5～2.5mm的3,3',5,5'-四甲基联苯胺水溶液按体积比(1～2)：(1～2)混合而成，更优选地，所述显色剂由浓度40μg/ml的羟基氧化钴混悬液与浓度2.0mm的3,3',5,5'-四甲基联苯胺水溶液按体积比1:1混合而成。

为了使3,3',5,5'-四甲基联苯胺能够与羟基氧化钴充分作用，以便于显色充分，所述3,3',5,5'-四甲基联苯胺水溶液中可加入缓冲剂和螯合剂，优选加入柠檬酸和乙二胺四乙酸。作为一种优选方案，所述柠檬酸在所述3,3',5,5'-四甲基联苯胺水溶液中的终浓度为1～10μmol/l、优选为5μmol/l，所述乙二胺四乙酸在在所述3,3',5,5'-四甲基联苯胺水溶液中的终3,3',5,5'-四甲基联苯胺水溶液中的浓度为0.4～0.6mmol/l、优选为0.5mmol/l。

作为本发明的一种优选方案，所述显色剂由浓度35～45μg/ml的羟基氧化钴混悬液与浓度1.5～2.5mmol/l的3,3',5,5'-四甲基联苯胺水溶液按体积比(1～2)：(1～2)混合而成；所述3,3',5,5'-四甲基联苯胺水溶液中含有浓度为1～10μmol/l的柠檬酸和浓度为0.4～0.6mmol/l的乙二胺四乙酸。

作为本发明的一种优选方案，所述显色剂由浓度40μg/ml的羟基氧化钴混悬液与浓度2.0mmol/l的3,3',5,5'-四甲基联苯胺水溶液按体积比1:1混合而成；所述3,3',5,5'-四甲基联苯胺水溶液中含有浓度为5μmol/l的柠檬酸和浓度为0.5mmol/l的乙二胺四乙酸。

其中，所述羟基氧化钴混悬液可由下述方法制得：将氯化钴与氢氧化钠加入水中，超声处理，再加入次氯酸钠，超声处理，得到深棕色的混合溶液，离心，过滤得到羟基氧化钴纳米片；再将羟基氧化钴纳米片溶于水中配制得到羟基氧化钴混悬液。

其中，所述3,3',5,5'-四甲基联苯胺水溶液可由如下方法制得：常温下，先将3,3',5,5'-四甲基联苯胺粉末溶于有机溶剂中直至完全溶解，得到混合液a；再将柠檬酸和乙二胺四乙酸溶于水得到混合液b，将混合液a与混合液b混匀，即得3,3',5,5'-四甲基联苯胺水溶液。其中，所述有机溶剂可选用二甲亚砜dmso。

本发明同时提供了一种基于光学显微镜的抗坏血酸浓度在线传感分析方法，该方法利用本发明提供的显色剂实现。所述方法的流程示意图如图1a所示，利用所述显色剂对抗坏血酸浓度进行检测的原理示意图如图1b所示。

具体而言，本发明提供的方法包括如下步骤：

(1)将本发明提供的显色剂与空白对照液持续等速同步通入固定在光学显微镜下的透明毛细管中，用光学显微镜对所述透明毛细管连续拍照，用图像分析软件将连续拍照所得的各张照片的光强信号分别转化为数字信号，取平均值，作为光强数值i0；

(2)将n份不同浓度的抗坏血酸标准品分别与所述显色剂持续等速同步通入所述透明毛细管中，采用与步骤(1)相同的方法进行拍照、信号转化后，得到n个光强数值i1，i2……in-1，in，分别求得与i0的光强差值i1-i0，i2-i0……in-1-i0，in-i0；

(3)以所述n份标准品的浓度为横坐标、相应的光强差值为纵坐标，在平面直角坐标系中做图，得到回归曲线；

(4)将待测抗坏血酸样品与所述显色剂持续等速同步通入所述透明毛细管中，采用与步骤(1)相同的方法进行拍照、信号转化后，得到光强数值ix，求得与i0的光强差值ix-i0；

(5)将所述光强差值ix-i0代入步骤(3)所得回归曲线中，求得浓度，即为待测抗坏血酸样品的浓度。

本发明所述空白对照液是指抗坏血酸标准品或待测抗坏血酸样品的空白对照液，具体为去离子水。

作为本发明的一种优选方案，抗坏血酸的检测限为1～50μm。基于此，所述标准品的份数n为3～10，浓度在1～50μm的范围内；优选地，所述标准品的份数为5，浓度分别为1μm、5μm、10μm、20μm以及50μm。

为了提高检测的准确性，本发明对检测过程中的涉及的具体参数进行全面优化。具体而言：

所述光学显微镜的拍摄模式优选为物镜40x、手动放大1.6x，黑白模式。

所述透明毛细管的内径优选为200～300μm，更优选为240～260μm。

所述显色剂与空白对照、显色剂与标准品或显色剂与待测样品的通入速度均为1～5μl/min，优选为3μl/min。

所述显色剂与空白对照、显色剂与标准品或显色剂与待测样品持续通入至少900s(确保反应充分且系统稳定)后，再在150s内用光学显微镜对所述透明毛细管连续拍照至少30次，优选为每隔1～5s拍照一次、每次曝光时间40～45ms，对上述多次拍照的照片进行信号转换后，取平均值，得到光强度值。

为了实现操作的连续性，所述显色剂为持续不间断通入，仅转换样品(包括空白对照、标准品和待测样品)即可。为了确保显色剂与样品充分反应、系统显色稳定，同时为了避免相邻通入的样品之间的相互干扰，本发明优选每种样品的通入时间至少为20min。例如：将空白对照通入20min后，转换为第一个标准品通入20min，再依次通入其余标准品且每个标准品的通入时间均为20min，再通入待测样品20min并完成照片拍摄；如待测样品为多个，依次通入各20min并拍照即可。

本发明提供的抗坏血酸显色剂用于抗坏血酸光学在线监测时，其线性测定范围可完全涵盖抗坏血酸的生理浓度范围，具体优选为1～50μm。本发明提供的方法可潜在应用到活体脑神经生理过程中抗坏血酸浓度的检测。

与现有技术相比，本发明提供的显色剂原料易得，制备简便，进而可用来检测特定浓度范围、尤其是生理浓度范围内的抗坏血酸；本发明采用的方法还可以快速、实时连续的分析抗坏血酸变化情况，具有应用于监测活体脑神经生理过程中抗坏血酸变化情况的能力，并对建立其它光学传感体系方法具有一定的指导意义。

附图说明

图1a本发明所述方法的流程示意图，图1b为利用本发明所述显色剂对抗坏血酸浓度进行检测的原理示意图。

图2实施例2所述方法对aa的响应曲线示意图，其中横坐标为时间，纵坐标为光强数值；其中的插图为光强差值与aa浓度的线性回归曲线。

图3为实验例1中，毛细管中通入显色剂及不同浓度的aa后，在显微镜下使用彩色拍照模式(图3a)及黑白拍照模式(图3b)得到的照片，目镜均为10x，物镜均为20x；图3a、图3b中的插图均为对毛细管中间区域的放大图，即利用40x物镜及整体手动放大1.6x；图3c为20x彩色、40x彩色、20x黑白、40x黑白四种不同拍照模式下不同浓度的aa的响应情况。

图4为实验例2所述显微镜下拍摄连续体系的稳定性测试结果，其中横坐标为时间，纵坐标为光强数值。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径获得。

下述实施例中的试剂包括：六水合氯化钴(cocl2·6h2o)；氢氧化钠(naoh)；次氯酸钠(naclo)；抗坏血酸(aa)；柠檬酸(c6h8o7·h2o，ca)；乙二胺四乙酸二钠(c10h14n2o8na·2h2o，edta)；3,3',5,5'-四甲基联苯胺(c16h20n2，tmb)；二甲基亚砜((ch3)2so，dmso)，所有试剂均为分析纯，所提及的水溶剂均为二次水。

实施例1：显色剂的制备

(1)羟基氧化钴悬浊液的制备：首先，将10mm的cocl2溶液1ml与1.0m的naoh溶液250μl混合后超声处理1分钟；再加入0.9m的naclo溶液50μl后超声处理10分钟，最后定容到40ml，即得到40μg/ml的coooh悬浊液备用。

(2)3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液的制备：将10mgtmb分散于1ml的dmso中，加入0.1mm的ca溶液1ml、0.5m的edta溶液20μl后定容至40ml即得到2mm的tmb溶液。

(3)将上述tmb溶液(2mm)与coooh悬浊液(40μg/ml)等体积比混合，充分混匀后，此tmb-coooh体系即可为检测抗坏血酸的显色剂，并置于冰箱中备用。

实施例2

采用实施例1提供的显色剂，在光学在线体系中对抗坏血酸进行监测。具体步骤如下：

(1)将实施例1提供的显色剂与去离子水持续以3μl/min的速度同步通入固定在光学显微镜下的内径250nm的透明毛细管中，通入15min后用光学显微镜(物镜40x、手动放大1.6x、黑白模式)在150s内对所述透明毛细管连续等时间间隔拍照30张，用图像分析软件imagej将连续拍照所得的30张照片的光强信号分别转化为30个数字信号，取平均值，作为光强数值i0；

(2)待去离子水通入20min后，将5份浓度分别为1μm、5μm、10μm、20μm以及50μm的抗坏血酸标准品依次与所述显色剂持续以3μl/min的速度同步通入所述透明毛细管中，每个标准品的通入时间均为20min，采用与步骤(1)相同的方法进行拍照、信号转化后，得到5个光强数值i1，i2，i3，i4和i5，分别求得与所述i0的光强差值i1-i0，i2-i0，i3-i0，i4-i0和i5-i0；

(3)以所述5份标准品的浓度1μm、5μm、10μm、20μm以及50μm为横坐标、相应的光强差值i1-i0、i2-i0、i3-i0、i4-i0以及i5-i0为纵坐标，在平面直角坐标系中做图，得到回归曲线y＝3.39c(μm)+23.8；

(4)将待测抗坏血酸样品与所述显色剂持续以3μl/min的速度同步通入所述透明毛细管中，采用与步骤(1)相同的方法进行拍照、信号转化后，得到光强数值ix，求得与i0的光强差值ix-i0；

(5)将所述光强差值ix-i0作为y，代入步骤(3)所得回归曲线中，求得浓度c，即为待测抗坏血酸样品的浓度。

本实施例所得回归曲线如图2所示，其线性相关系数为0.973，说明本发明提供的方法对浓度1～50μm的aa有良好的响应。

本发明提供的方法可稳定工作，且检测结果准确，为后续进行的活体动物脑中aa基础值的检测及动物模型中aa变化情况的监测，提供了有力保障。

实验例1：不同拍摄模式对检测抗坏血酸灵敏度的影响

显微镜中的彩色及黑白两种拍摄模式会影响后续图像识别效果。因此设计了在不同拍摄模式下对抗坏血酸的识别实验来选择最优的拍摄模式；所述的四种拍摄模式具体为：20x物镜下的彩色拍摄模式、40x物镜及整体手动放大1.6x下的彩色拍摄模式、20x物镜下的黑白拍摄模式、40x物镜及整体手动放大1.6x下的黑白拍摄模式。在离心管中将显色剂与不同浓度的抗坏血酸按体积比10:2的比例混合后，利用注射器将反应后体系手动通入毛细管中，并在显微镜下拍照，其中抗坏血酸的浓度为1，5，10，20，50μm。两种彩色拍摄模式及黑白20x物镜下，tmb显色剂对抗坏血酸响应的线性相关性较差，且分辨度不高。由于20x物镜下可观察到毛细管管壁，在图像处理时需要手动确定光强识别范围，由此可能造成误差，且光在毛细管管壁可能会发生一定的折射及散射，从而造成误差。在40x物镜及整体手动放大1.6x下的黑白拍摄模式下，视野中全部可调为毛细管中部，在软件识别时可使用整幅画面识别，避免了人为产生的误差，且避免了光在毛细管管壁发生的折射或散射。彩色模式下，视野内为蓝色，且蓝色是由于吸收了黄色光，故受到环境光的影响较大，因此彩色模式下的传感灵敏度均较低。最佳的拍摄模式为40x物镜及整体手动放大1.6x下的黑白拍摄模式。

本实验例1所得结果可参考图3所示。其中，毛细管中通入显色剂及不同浓度的aa后，在显微镜下使用彩色拍照模式得到的照片如图3a所示，黑白拍照模式得到的照片如图3b所示，目镜均为10x，物镜均为20x；图3c为四种不同拍照模式下不同浓度的aa的响应情况。

实验例2

本实验例将去离子水切换为20μm的aa，即将显色剂与20μm的aa持续以3μl/min的速度同步通入内径250nm的透明毛细管中，拍摄模式为黑白模式、40x物镜、10x目镜及整体手动放大1.6x、拍摄间隔为5s，毛细管内径250μm，曝光时间42.02ms。由图4可知，在连续通入aa的900s左右达到稳定状态且可持续保持在对aa响应的稳定状态，基于此将连续体系中通入aa后的稳定时间确定为至少900s。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。