本发明属于医药
技术领域：
：，涉及牛肺表面活性提取物中残留抗生素的测定方法，特别是涉及使用超高效液相色谱-串联质谱法(uplc-ms/ms)测定牛肺表面活性提取物中四环素类抗生素的残留，这些四环素类抗生素例如有四环素、金霉素、土霉素、多西环素、美他环素、米诺环素、β-多西环素、差向四环素、差向金霉素、脱水四环素和脱水差向四环素等11种之多。
背景技术：
：：牛肺表面活性提取物是从健康新生小牛肺中分离提取的肺表面活性物质，主要成分包括甘油三酯、磷脂、游离脂肪酸、胆固醇和少量活性蛋白[shul.studyoncompositionanalysisandqualitycontrolofmedicinalcalfpulmonarysurfactant[d].beijing:univ.ofchineseacademyofsciences,2016]，其中磷脂、胆固醇等均是经典的表面活性物质或者人们常将它们作为表面活性剂即乳化剂使用，例如胆固醇(又称为胆甾醇)由于具有表面活性作用通常在药剂中作为水包油乳剂的乳化剂。1959年，avery和mead首次证实了，肺表面活性物质的缺乏是导致新生儿呼吸窘迫综合症的主要原因[averyme,meadj.surfacepropertiesinrelationtoatelectasisandhyalinemembranedisease[j].amajdischild,1959,97(5):517-523]。新生儿呼吸窘迫综合症，是指新生儿出生不久后出现的进行性呼吸困难、呻吟、发绀、吸气三凹征，严重者发生呼吸衰竭等症状，致死率较高[yujl.preventionandtreatmentofneonatalrespiratorydistresssyndrome[j].chinjpractpediatr(中国实用儿科杂志),2003,18(11):643-646；xuzz.neonatalrespiratorydistresssyndrome[j].jiangsumedj(江苏医药),1982,5:26-28]。该病多见于早产儿，尤其是32周前早产儿，由于肺泡尚未发育成熟，表面活性物质缺乏，从而导致该病[chena,shilp,zhengjy,etal.clinicalcharacteristicsandoutcomesofrespiratorydistresssyndromeintermandlate-pretermneonates[j].chinjpediatr(中华儿科杂志),2008,46(9):654-657]。目前，临床上已证实，采用肺表面活性物质替代疗法，可以显著提高患儿治愈率[sweetdg,carnielliv,greiseng,etal.guidelinesforthepreventionandtreatmentofneonatalrespiratorydistresssyndromeineurope[j].chinjpediatr(中华儿科杂志),2011,49(1):27-33；dongsh.applicationofpulmonarysurfactantinneonatalrespiratorydistresssyndrome[j].chinjpractpediatr(中国实用儿科杂志),1988,3(1):11-12；lij,fanxm,songgw,etal.amulticenterclinicaltrialofthesurfactantreplacementtherapyforneonatalrespiratorydistresssyndrome[j].chinjpediatr(中华儿科杂志),2000,38(6):344-347；zhangm,zhoux.neonatalrespiratorydistresssyndrometreatmentdrug-curosurf[j].worldpharmacy(国外医药-合成药生化药制剂分册),2001,22(2):110；xiny,zhengrx.clinicalanalysisof27casesofneonatalrespiratorydistresssyndromecomplicatedwithpneumothorax[j].jcapitunivmedsci(首都医科大学学报),2016,37(2):148-152]。患儿发病时，将牛肺表面活性提取物的注射制剂于气管内给药，可产生使肺泡扩张和稳定的作用，改善肺的顺应性和气体交换，从而达到治疗新生儿呼吸窘迫综合症的效果[corbetaj,longwa,murphydj,etal.reducedmortalityinsmallprematureinfantstreatedatbirthwithasingledoseofsyntheticsurfactant[j].jpaediatrchildhealth,1991,27:245-249；zhangwt,fudc,wangy.clinicaltreatmentandanalysisof308casesofneonatalrespiratorydistresssyndrome[j].chinjpharmeconom(中国药物经济学),2013,4:321-322]。由于牛肺表面活性提取物，是从新生小牛肺中分离提取得到的，因此，其中是否存在抗生素残留，残留抗生素是否会影响临床治疗效果，仍需进一步研究。目前我国抗生素滥用情况较为严重，四环素类抗生素由于抗菌谱广，被普遍应用于畜牧业[liuxc,dongyh,wangh.investigationontheresiduesoftetracyclineantibioticsinintensiveexcavityoflivestockandpoultryinjiangsuprovince[j].jargo-environsci(农业环境科学学报),2008,27(3):1177-1182；wulq,qianmr,lulz,etal.antibioticresiduesinwastewatersfrommainlivestockfarmsinzhejiangprovince[j].actaagriczhejiangensis(浙江农业学报),2012,24(4):699-705；zhanglh,wangjj,haxj,etal.distributioncharacteristicsofantibioticresistancegenesinvegetablesoilsinbeijing[j].chinjenvironsci(环境科学),2016,37(11):4395-4401]。因此，应建立牛肺表面活性提取物中的四环素类抗生素残留的检测方法是极其有必要的，这涉及到患有呼吸窘迫综合症这种危急病症的新生儿特别是早产新生儿用药的安全性和有效性问题。目前，药典中标准规定使用微生物管碟法进行四环素类抗生素的残留测定[ch.p(2015)voliv(中国药典2015年版.四部)[s].2015:252]。该方法仅用于四环素残留量的测定，不能用于其他常用的四环素类抗生素，如土霉素、金霉素等等，应用范围窄。同时，牛肺表面活性提取物为营养物质，其本身对微生物生长可能有干扰作用，从而导致对比对照品与供试品抑菌圈大小的方法不能真实反映抗生素残留量。因此，本领域技术人员迫切期待开发一种新的方法来测定牛肺表面活性提取物中四环素类抗生素的残留，这些四环素类抗生素例如有四环素、金霉素、土霉素、多西环素、美他环素、米诺环素、β-多西环素、差向四环素、差向金霉素、脱水四环素和脱水差向四环素等等。技术实现要素：本发明的目的在于开发一种新的方法来测定牛肺表面活性提取物中四环素类抗生素的残留量，这些四环素类抗生素例如有四环素、金霉素、土霉素、多西环素、美他环素、米诺环素、β-多西环素、差向四环素、差向金霉素、脱水四环素和脱水差向四环素等等，特别是鉴于此类残留级别量四环素类抗生素在牛肺表面活性提取物中的含量极低，开发的方法要求其极高的精密度以及其它测定性能要求。已经出人意料的发现，本发明建立的基于超高效液相色谱串联质谱(uplc-ms/ms)技术的四环素类抗生素测定方法，该方法可同时测定四环素、金霉素、土霉素、多西环素、美他环素、米诺环素、β-多西环素、差向四环素、差向金霉素、脱水四环素和脱水差向四环素等11种抗生素及已知杂质。该方法的线性范围、灵敏度、精密度、回收率均满足分析要求，可以应用于牛肺表面活性提取物中四环素类抗生素的残留的测定。并且对实际样品测定，已经发现，在某些批次的牛肺表面活性提取物中检出了土霉素和四环素，其中土霉素残留量约为0.03mg/kg，四环素则未达到定量限(0.006mg/kg)。本发明基于此类发现而得以完成。本发明提供了测定牛肺表面活性提取物中四环素类抗生素残留量的方法，该方法采用超高效液相色谱-串联质谱法进行测定，包括以下步骤：(1)提供超高效液相色谱仪和三重四极杆质谱仪；提供牛肺表面活性提取物；提供选自下列的对照品：四环素对照品、土霉素对照品、金霉素对照品、多西环素对照品、美他环素对照品、米诺环素对照品、4-差向四环素对照品、4-差向金霉素对照品、β-多西环素对照品、脱水四环素对照品、脱水差向四环素对照品；(2)色谱条件：色谱柱：watershsst3，柱规格2.1×100mm，填料粒径1.8μm，流动相a：0.1％甲酸的乙腈溶液，流动相b：0.1％甲酸的水溶液，流速：0.3ml/min，柱温：30℃，进样量：1μl，使用下列所示梯度洗脱程序进行洗脱：(3)质谱条件采用三重四极杆质谱仪，配有电喷雾离子源，毛细管电压为4.5kv，气化室温度为100℃，鞘气压力为40arb；离子吹扫气压力为40arb，辅助气压力为10arb，毛细管温度为350℃；采用选择反应监测模式，监测条件如下表：(4)配液和测试：(41)精密称取四环素对照品、土霉素对照品、金霉素对照品、多西环素对照品、美他环素对照品、米诺环素对照品、差向四环素对照品、差向金霉素对照品、β-多西环素对照品、脱水四环素对照品以及脱水差向四环素对照品各10mg，精密称定，分别置10ml量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为各对照品储备液(其浓度为1mg/ml)；(42)分别精密量取各对照品储备液1ml，置100ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀；精密量取1ml，置10ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，制成每1ml中约含各组分1μg的溶液，作为分离度试验溶液；取该分离度试验溶液，按“(2)色谱条件”和“(3)质谱条件”项下的色谱和质谱条件进行分离度试验；(43)精密量取上述分离度试验溶液，用甲醇定量稀释成每1ml中含各对照品200ng、100ng、50ng、20ng、10ng、5ng、2ng、1ng和0.5ng的混合溶液，按“(2)色谱条件”和“(3)质谱条件”项下的色谱和质谱条件进行线性范围试验和精密度试验；(44)精密量取每1ml含各对照品100ng的对照品混合溶液0.5ml，置50ml离心管中，另精密称取牛肺表面活性提取物50mg，置同一50ml离心管中，照以下步骤(45)的方法，自“加入mcilvaine缓冲液”起开始处理，平行处理三份，进行回收率试验；(45)精密称取牛肺表面活性提取物50mg，置50ml离心管中，加入mcilvaine缓冲液4～8ml，涡旋使混匀，超声5～15分钟，加入正己烷15～20ml，涡旋5～15分钟，4000～5000rpm离心5～15分钟，弃取下层，清液用于固相萃取上样；采用固相萃取小柱，依次经甲醇、水活化后，取样品上样进行固相萃取，经4～6％甲醇水洗，再用甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液；35～45℃条件下n2吹干，残渣用500μl甲醇复溶后，取1μl用于色谱进样；(5)结果处理：记录“(4)配液和测试”各试验测试所得色谱图，计算各方法学验证参数，对牛肺表面活性提取物样品进行定性分析和定量计算。在本发明中，术语牛肺表面活性提取物亦通常可称为牛肺表面活性剂，两个术语可以通用。根据本发明的方法，其中所述牛肺表面活性提取物是其原料药或者是其制剂。在一个实施方案中，所述制剂是一种冻干粉针剂，其是添加葡萄糖和氯化钠的注射用牛肺表面活性剂。已经发现本发明方法对于原料药和制剂都是适用的，例如本发明实施例1是针对原料药进行测试的结果，在参考实施例1进行的一个补充实施例中，将其中的原料药改用注射用牛肺表面活性剂进行测试，结果与实施例1的各个结果无明显差异。根据本发明的方法，其中所述超高效液相色谱仪可以是赛默飞世尔公司的thermoultimate3000型超高效液相色谱仪。本领域技术人员知晓，其它品牌的超高效液相色谱仪亦是适用的。根据本发明的方法，其中所述三重四极杆质谱仪可以是赛默飞世尔公司的thermotsqquantiva型三重四极杆质谱仪。本领域技术人员知晓，其它品牌的三重四极杆质谱仪亦是适用的。根据本发明的方法，其中所述固相萃取采用oasishlb固相萃取小柱；例如采用oasishlb150mg固相萃取小柱。本领域技术人员知晓，其它品牌的固相萃取小柱亦是适用的。根据本发明的方法，其中所述固相萃取采用采用oasishlb150mg固相萃取小柱，在固相萃取时，固相萃取小柱，经4～6ml甲醇、4～6ml水活化后，取样品上样进行固相萃取，经4～6ml的4～6％甲醇水洗，再用2～4ml甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液。根据本发明的方法，其中所述固相萃取时配合真空固相萃取装置使用，例如是沃特世公司的20位真空固相萃取装置。本领域技术人员知晓，其它品牌的真空固相萃取装置亦是适用的。根据本发明的方法，其中所述mcilvaine缓冲液是照如下方式配制的：柠檬酸12.9g，磷酸氢二钠10.9g，乙二胺四乙酸二钠37.2g，加水至1000ml，用0.1mol/l的hcl或0.1mol/l的naoh调节ph至4.0。本发明方法可以以非常优异的性能有效的测定牛肺表面活性提取物中四环素类抗生素的残余含量。例如，对于三批制药厂商提供的注射用牛肺表面活性提取物进行测定，将结果按重量折算，土霉素残留量均小于0.031mg/kg，而四环素残留量均未达到定量限(约为0.006mg/kg)。由于该药品制剂为每支含牛肺表面活性提取物70mg，因此，每支注射用牛肺表面活性提取物中土霉素含量小于2.2ng，四环素含量小于0.42ng。该制剂临床使用时，用量为70mg/kg出生体重，如按体重较大的5kg婴儿出生体重计算，土霉素残留量小于11ng，四环素残留量小于2.1ng，该残留量并未达到对患者临床治疗产生影响的程度。本发明方法可以有效的对牛肺表面活性提取物制剂进行质量监控。另外，如本发明所述的，除脱水四环素与脱水差向四环素外，其余9种四环素类抗生素及已知杂质回收率均超过60％，结果满足分析要求。脱水四环素与脱水差向四环素为四环素两种已知杂质，采用固相萃取时回收率较低，虽然回收率平行性良好，仍可对其进行半定量测定分析，然而本领域技术人员仍然期待对其回收率进行提高。已经出人意料的发现，当对牛肺表面活性提取物进行样品前处理时，在所用的缓冲液中随所述量的柠檬酸一起还添加0.25g乙二胺后，可以显著的提高脱水四环素和脱水差向四环素二者的回收率，分别可以提高36个百分点以上和24个百分点以上；例如，在参考下文实施例1的补充实施例中，采用上述方法配制的缓冲液，其余结果与实施例1基本相同，但是在表5提供的回收率测试中，脱水四环素的回收率可达62.2～68.8％，脱水差向四环素的回收率可达66.3～69.6％。因此，在本发明的一个实施方案中，所述缓冲液还包含上述量的乙二胺，其是与柠檬酸一起添加的。另外的试验发现，尽管化学性质类似，将乙二胺改用三乙胺时却不能获得上述显著提高回收率的效果，显示本发明上述效果的独特性。另外，由于牛肺表面活性提取物中含有胆固醇，在参照实施例1进行的补充实施例中，向牛肺表面活性提取物额外添加胆固醇(添加量10mg/g)时发现在表5提供的回收率测试中脱水四环素和脱水差向四环素二者的回收率分别会继续降低6～9个百分点和8～12个百分点，并且当胆固醇量继续增加时上述两种抗生素的回收率会降低更多，但是胆固醇的添加不会影响其它抗生素的回收率；另外在向牛肺表面活性提取物额外添加胆固醇(添加量10mg/g)的情况下如果在缓冲液中添加0.25g乙二胺时，脱水四环素和脱水差向四环素的回收率仍然分别可达56～59％和62～64％，这似乎表明牛肺表面活性提取物中包含的胆固醇会造成两种抗生素回收率的降低，而通过在样品处理的缓冲液中添加乙二胺后可以避免这种降低。牛肺表面活性提取物的临床使用的制剂有注射用牛肺表面活性剂，其是从健康新生小牛肺中分离提取的肺表面活性物质。主要组分包括磷脂、胆固醇、甘油三酯、游离脂肪酸和少量肺表面活性物质蛋白(sp-b和sp-c)，其中总磷脂不少于80％，卵磷脂不少于55％，蛋白含量约1-2％。此外还含有相当于葡糖糖和氯化钠作为药用辅料。注射用牛肺表面活性剂用于经临床和胸部放射线检查诊断明确的新生儿呼吸窘迫综合征(简称rds，又称肺透明膜病)的治疗。其仅能用于气管内给药。临床上要在出现rds早期征象后尽早给药，通常在患儿出生后12小时以内，不宜超过48小时，给药越早效果越好。70mg/kg出生体重，给药剂量应根据患儿具体情况灵活掌握，首次给药范围可在40～100mg/kg出生体重，多数病例如能早期及时用药，70mg/kg即可取得良好效果；病情较重，胸片病变明显，动脉血氧分压较低，或有合并症的病例，偏大剂量可有更好效果。应用前检查药品外观有无变色，每支加2ml注射用水，将药品复温到室温(可在室温放置20分钟或用手复温)，轻轻振荡，勿用力摇动，使成均匀的混悬液，若有少量泡沫属正常现象。按剂量抽吸于5ml注射器内，以细塑料导管经气管插管注入肺内，插入深度以刚到气管插管下口为宜。注射用牛肺表面活性剂总剂量分4次，按平卧、右侧卧、左侧卧、半卧位顺序注入。注射用牛肺表面活性剂每次注入时间约为10～15秒，注入速度不要太快，以免药液呛出或堵塞气道，每次给药间隔加压给氧(频率40－60次/分)1～2分钟左右(注意勿气量过大以免发生气胸)，注药全过程约15分钟。给药操作应由2名医务人员合作完成，注药过程中应密切监测患儿呼吸循环情况，肺部听诊可有一过性少量水泡音，不必做特殊处理。给药后4小时内尽可能不要吸痰。注射用牛肺表面活性剂多数通常只应用1次即可，如患儿呼吸情况无明显好转，需继续应用呼吸机，明确呼吸衰竭是由rds引起，必要时在第一次用药后12～24小时(至少6小时)可应用第2次，重复给药最多应用3次，剂量与首次给药相同。毒理研究显示，成年家兔按80mg/kg气管内连续给予本品4天，肺内可见中度炎症和较多含空泡的吞噬细胞。在幼兔按80mg/kg气管内连续给予本品7天，有轻到中度炎症，一周后大都恢复；此外还可见不同的吞噬脂质反应，包括吞噬细胞浸润、吞噬细胞肉芽肿和停药一周后的纤维化小结等，这些研究保证了牛肺表面活性剂的良好临床安全性。附图说明图1微生物培养法检测四环素与土霉素残留结果图(a：四环素；b：土霉素)。图2混合对照品溶液分离度试验色谱图。图3空白溶液专属性试验色谱图。图4：样品溶液测定结果色谱图(a：批号150301；b：批号150302；c：批号150205)。具体实施方式通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。以下实施例进一步说明本发明，而不是限制本发明。为便于理解，本发明涉及的一些化学物质的中文名和英文名对照如下：实施例1：测定牛肺表面活性提取物中四环素类抗生素残留1、仪器与材料1.1、仪器thermoultimate3000超高效液相色谱仪(赛默飞世尔公司，美国)，thermotsqquantiva三重四极杆质谱仪(赛默飞世尔公司，美国)，xa205型十万分之一天平(梅特勒-托利多公司，瑞士)，20位真空固相萃取装置(沃特世公司，美国)，milli-q纯水机(默克密理博，德国)，zy-300ⅳ型抑菌圈测量仪(先驱威锋有限公司，中国)，dhp-0162型电热恒温培养箱(上海一恒科学仪器有限公司，中国)。1.2、材料1.2.1、标准品和对照品四环素标准品(批号130306-201419)、土霉素标准品(批号130305-201321)、盐酸四环素对照品(批号130488-200403)、土霉素对照品(批号130487-200703)、盐酸金霉素对照品(批号130489-200202)、多西环素对照品(批号130485-201202)、美他环素对照品(批号130499-200802)、米诺环素对照品(批号130514-200401)、4-差向四环素对照品(批号130401-200209)、4-差向金霉素对照品(批号130404-201201)、β-多西环素对照品(批号130405-200907)、脱水四环素对照品(批号130402-200203)和脱水差向四环素对照品(批号130403-200204)均购自中国食品药品检定研究院。1.2.2、试剂及实验材料柠檬酸、乙二胺四乙酸二钠均为分析纯，购自北京现代东方精细化学品有限公司。甲醇、乙腈、正己烷和甲酸为色谱纯，磷酸氢二钠、磷酸氢二钾和磷酸二氢钾为分析纯，均购自merck公司。抗生素ii号培养基(批号140417)，购自北京三药科技开发公司。oasishlb150mg固相萃取小柱，购自waters公司。藤黄微球菌菌[cmcc(b)28001](批号28001-ba1)，购自中国食品药品检定研究院。1.2.3、样品牛肺表面活性提取物(批号分别为150301，150302，150205)，由某药品生产企业提供。2、实验方法2.1、样品前处理方法精密称取牛肺表面活性提取物50mg，置50ml离心管中，加入mcilvaine缓冲液4～8ml(本实施例用6ml)，涡旋使混匀，超声5～15分钟(本实施例为10分钟)，加入正己烷15～20ml(本实施例为18ml)，涡旋5～15分钟(本实施例为10分钟)，4000～5000rpm(本实施例为4500rpm)离心5～15分钟(本实施例为10分钟)，弃取下层，清液用于上样；采用150mg的oasishlb固相萃取小柱，经4～6ml(本实施例为5ml)甲醇、4～6ml(本实施例为5ml)水活化后，取样品上样进行固相萃取(配合使用真空固相萃取装置)，依次经4～6ml(本实施例为5ml)的4～6％(本实施例为5％)甲醇水洗，再用2～4ml(本实施例为3ml)甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液；35～45℃(本实施例为40℃)条件下n2吹干，残渣用500μl甲醇复溶后，取1μl用于色谱进样。记录试验测试所得色谱图，结合本实施例所得方法学验证参数，对牛肺表面活性提取物样品进行定性分析和定量计算。其中，所述mcilvaine缓冲液是照如下方式配制的：柠檬酸12.9g，磷酸氢二钠10.9g，乙二胺四乙酸二钠37.2g，加水至1000ml，用0.1mol/l的hcl或0.1mol/l的naoh调节ph至4.0。2.2、色谱条件采用thermoultimate3000超高效液相色谱仪(赛默飞世尔公司，美国)；色谱柱：watershsst3(2.1×100mm，1.8μm)；流动相a：0.1％甲酸的乙腈溶液，流动相b：0.1％甲酸的水溶液；流速：0.3ml/min，柱温：30℃；进样量：1μl；流动相使用梯度洗脱程序，见表1。表1：流动相梯度洗脱程序t/min流动相a(％)流动相b(％)01585215852.0120807208010604010.19551595515.0115852015852.3、质谱条件采用thermotsqquantiva三重四极杆质谱仪(赛默飞世尔公司，美国)，配有电喷雾离子源(esi)，毛细管电压为4.5kv，气化室温度为100℃，鞘气压力为40arb；离子吹扫气压力为40arb，辅助气压力为10arb，毛细管温度为350℃；采用选择反应监测模式(srm)，监测条件见表2。表2：串联质谱选择反应监测(srm)条件2.4、微生物管碟法条件按照《中国药典》2015年版中抗生素残留量检查法进行测定[ch.p(2015)voliv(中国药典2015年版.四部)[s].2015:252]。采用藤黄微球菌[cmcc(b)28001]作为实验菌；使用抗生素ii号培养基，调节ph值使灭菌后为6.5～6.6；采用药典规定的ph6.0磷酸盐灭菌缓冲液(ph6.0)[ch.p(2015)voliv(中国药典2015年版.四部)[s].2015:252]。培养条件为37℃，18～22小时。精密称取四环素标准品和土霉素标准品适量，约相当于10000单位，分别置100ml量瓶中，加5ml0.1mol/l盐酸溶液溶解，用ph6.0磷酸盐灭菌缓冲液稀释至刻度，摇匀，作为各标准品储备液。精密量取各储备液，用ph6.0磷酸盐灭菌缓冲液稀释分别制成约含土霉素1单位/ml、0.1单位/ml和0.01单位/ml的土霉素标准溶液和约含四环素1单位/ml、0.1单位/ml和0.01单位/ml的四环素标准溶液。精密称取样品约100mg，置10ml量瓶中，加ph6.0磷酸盐灭菌缓冲液溶解并稀释至刻度，摇匀，过滤，取上清液作为供试品溶液。2.5、方法学验证条件精密称取四环素对照品、土霉素对照品、金霉素对照品、多西环素对照品、美他环素对照品、米诺环素对照品、差向四环素对照品、差向金霉素对照品、β-多西环素对照品、脱水四环素对照品以及脱水差向四环素对照品约10mg，精密称定，分别置10ml量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为各对照品储备液。分别精密量取各对照品储备液1ml，置100ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀；精密量取1ml，置10ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，制成每1ml中约含各组分1μg的溶液，作为分离度试验溶液。按“2.2”、“2.3”项下色谱和质谱条件进行分离度试验。精密量取上述分离度试验溶液，用甲醇定量稀释成每1ml中约含各对照品200ng、100ng、50ng、20ng、10ng、5ng、2ng、1ng和0.5ng的混合溶液，按“2.2”、“2.3”项下色谱和质谱条件进行线性范围试验和精密度试验。精密量取对照品混合溶液(每1ml约含各对照品100ng)0.5ml，置50ml离心管中，另精密称取牛肺表面活性提取物约50mg，置同一50ml离心管中，按“2.1”项下前处理方法，自“加入mcilvaine缓冲液”起开始处理，平行处理三份，进行回收率试验。在上述分离度试验、线性范围试验和精密度试验、回收率试验等试验中，记录各试验测试所得色谱图，计算各方法学验证参数，这些参数可对牛肺表面活性提取物样品进行定性分析和定量计算。3、结果与讨论3.1、微生物管碟法结果与讨论根据《中国药典》中抗生素残留量检查法，对四环素、土霉素分别试验。采用ph6.0磷酸盐缓冲液作为空白溶液，在同一培养皿上等距离均匀放置6个钢管，分别按顺序加入空白溶液、0.01单位/ml标准品溶液、样品溶液、0.1单位/ml标准品溶液、样品溶液和1单位/ml标准品溶液。结果如图1所示。通过图1可以看出，四环素和土霉素的1单位/ml标准品溶液均有明显抑菌作用，而0.01单位/ml的标准品溶液均没有明显抑菌作用，可见该方法的检出限均大于0.01单位/ml，折算成样品重量比约为0.1mg/kg。此外，实验结果可以看出，样品溶液均有明显的增菌作用。这是由于牛肺表面活性提取物为营养物质，富含微生物生长的营养成分，包括脂类、蛋白等等，可以促进菌类增长，因此样品溶液菌落明显多于空白溶液。由此可见，微生物管碟法不能用于测定牛肺表面活性提取物中的抗生素残留。3.2、uplc-ms/ms法结果与讨论3.2.1、方法分离情况采用“2.5”项下分离度试验对照品混合溶液，按“2.2”、“2.3”项下条件进行测定，结果详见图2。如图2可以看出，分子量不同的组分，可以通过在选择反应监测模式(srm)中采用不同的监测离子对进行区分，即使保留时间相近或一致，仍可单独进行定性定量分析。此外，虽然混合对照品中存在反应监测模式(srm)无法区分的一系列同分异构体，如差向四环素与四环素、差向金霉素与金霉素、β-多西环素与多西环素、脱水差向四环素与脱水四环素等等，然而在此方法中，这些同分异构体均能实现基线分离，从而可以对其分别进行定性定量分析。因此，该方法可以成功应用于以上11种四环素类抗生素及已知杂质的检测分析。3.2.2、专属性试验用甲醇作为空白，按“2.2”、“2.3”项下条件进行测定，结果如图3所示。可以看出，由于采用选择反应监测模式(srm)，母离子与碰撞后产生的子离子均为确定离子，且对于每种物质均采用三对离子对进行定性确认，因此，空白对11种四环素类抗生素及已知杂质的检测无干扰。说明该方法对四环素类抗生素的检出专属性较强。3.2.3、线性范围、检出限与定量限取上述“2.5”项下各浓度对照品混合溶液，按“2.2”、“2.3”项下条件进行测定，以对照品溶液浓度值为横坐标，以连续进样六次得到的峰面积的平均值为纵坐标，进行线性回归。将上述对照品混合溶液用甲醇进一步稀释制成每1ml含各对照品0.2ng和0.1ng的对照品混合溶液，进行定量限与检出限测定。以信噪比大于10时的浓度为定量限，信噪比大于3时的浓度为检测限。各对照品线性范围、定量限及检测限结果详见表3。表3：线性范围、定量限(loq)及检测限(lod)结果化合物线性方程r2线性范围(ng/ml)loq(ng/ml)lod(ng/ml)米诺环素y＝317.7x-12100.9971～2001.00.48土霉素y＝1121x-19090.9991～2001.00.50差向四环素y＝861.2x-109230.9925～2005.21.0四环素y＝1575x-40360.9980.5～2000.540.11差向金霉素y＝516x-50030.9935～2004.70.94金霉素y＝677.5x-17500.9991～2000.990.50β-多西环素y＝2133x-45300.9990.5～2000.560.11多西环素y＝1726x-21910.9980.5～2000.460.092美他环素y＝1383x-37460.9991～2001.00.54脱水四环素y＝2822x-57690.9990.5～2000.530.11脱水差向四环素y＝1594x-19870.9940.5～2000.510.21由上述结果可以看出，11种四环素类抗生素及已知杂质在其定量限至200ng/ml范围内，线性关系良好(r2均大于0.99)。且检出限均小于1ng/ml，折算成样品重量比为0.01mg/kg，与药典中抗生素残留量检查法相比，灵敏度至少提高一个数量级。3.2.4、精密度试验按上述“2.5”项中描述配制系列浓度对照品混合溶液，按“2.2”、“2.3”项下条件进行测定，分别进样六次，计算峰面积的相对标准偏差。结果详见表4的精密度测定结果。表4：精密度试验结果表中，*c：化合物浓度；**—：该浓度低于loq由表4结果可以看到，在0.5ng/ml以上浓度范围内，相对标准偏差均不大于5.0％，0.5ng/ml浓度中，相对标准偏差也均小于10％，可满足常规分析要求。3.2.5、回收率试验按上述“2.5”项中描述配制回收率试验溶液。另取本品约50mg，同法处理，作为基质溶液。按“2.2”、“2.3”项下条件进行测定，平行测定三次，计算回收率，结果详见表5。表5：回收率测定结果化合物回收率范围(％，n＝3)平均回收率(％)米诺环素80.6～85.283.6土霉素69.3～75.371.3差向四环素83.3～88.486.1四环素69.0～76.671.9差向金霉素67.3～69.568.4金霉素73.7～77.575.6β-多西环素77.1～79.878.8多西环素79.2～85.282.2美他环素58.6～61.660.1脱水四环素24.6～29.527.9脱水差向四环素40.5～51.847.7结果表明，除脱水四环素与脱水差向四环素外，其余9种四环素类抗生素及已知杂质回收率均超过60％，结果满足分析要求。脱水四环素与脱水差向四环素为四环素两种已知杂质，采用固相萃取时回收率较低，虽然回收率平行性良好，仍可对其进行半定量测定分析，然而本领域技术人员仍然期待对其回收率进行提高。3.2.6、样品测定结果对药品制造企业提供的3批牛肺表面活性提取物样品进行检测，三批中均检出土霉素残留，其中两批检出四环素残留，数据结果详见表6，色谱图详见图4。表6：牛肺表面活性提取物测定结果批号土霉素峰面积四环素峰面积土霉素结果*(ng/ml)四环素结果**(ng/ml)15030155828.463.1低于loq150302474/2.9未检测到15020518320.892.7低于loq*：以回收率71.3％计算所得结果；**：四环素的lod为0.11ng/ml，loq为0.54ng/ml。将结果按重量折算，土霉素残留量均小于0.031mg/kg，而四环素残留量均未达到定量限(约为0.006mg/kg)。由于该药品制剂为每支含牛肺表面活性提取物70mg，因此，每支注射用牛肺表面活性提取物中土霉素含量小于2.2ng，四环素含量小于0.42ng。该制剂临床使用时，用量为70mg/kg出生体重，如按5kg婴儿出生体重计算，土霉素残留量小于11ng，四环素残留量小于2.1ng，该残留量并未达到对患者临床治疗产生影响的程度。实施例2：测定牛肺表面活性提取物中四环素类抗生素残留参考实施例1进行，不同的仅是在“2.1、样品前处理方法”中改动并照如下方式处理：精密称取牛肺表面活性提取物50mg，置50ml离心管中，加入mcilvaine缓冲液8ml，涡旋使混匀，超声5分钟，加入正己烷20ml，涡旋5分钟，5000rpm离心5分钟，弃取下层，清液用于上样；采用150mg的oasishlb固相萃取小柱，经4ml甲醇、6ml水活化后，取样品上样进行固相萃取(配合使用真空固相萃取装置)，依次经4ml的6％甲醇水洗，再用2ml甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液；35℃条件下n2吹干，残渣用500μl甲醇复溶后，取1μl用于色谱进样。记录试验测试所得色谱图，结合本实施例所得方法学验证参数，对牛肺表面活性提取物样品进行定性分析和定量计算。实施例3：测定牛肺表面活性提取物中四环素类抗生素残留参考实施例1进行，不同的仅是在“2.1、样品前处理方法”中改动并照如下方式处理：精密称取牛肺表面活性提取物50mg，置50ml离心管中，加入mcilvaine缓冲液4ml，涡旋使混匀，超声15分钟，加入正己烷15ml，涡旋15分钟，4000rpm离心15分钟，弃取下层，清液用于上样；采用150mg的oasishlb固相萃取小柱，经6ml甲醇、4ml水活化后，取样品上样进行固相萃取(配合使用真空固相萃取装置)，依次经6ml的4％甲醇水洗，再用4ml甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液；45℃条件下n2吹干，残渣用500μl甲醇复溶后，取1μl用于色谱进样。记录试验测试所得色谱图，结合本实施例所得方法学验证参数，对牛肺表面活性提取物样品进行定性分析和定量计算。以上实施例2和实施例3试验所得各种结果，与实施例1的结果基本接近，无明显差异，这表明本发明方法具有优良的适应性。本发明，建立了基于uplc-ms/ms的四环素类抗生素测定方法，特别是建立了测定牛肺表面活性提取物中多种四环素类抗生素残留的方法。该方法采用uplc-ms/ms方法，以watershsst3色谱柱(2.1mm×100mm,1.8μm)为固定相，分别以含0.1％甲酸的乙腈溶液和0.1％甲酸的水溶液为流动相a和流动相b，梯度洗脱，流速0.3ml·min-1，柱温30℃，进样量1μl。本发明方法可同时测定四环素、金霉素、土霉素、多西环素、美他环素、米诺环素、β-多西环素、差向四环素、差向金霉素、脱水四环素和脱水差向四环素等11种抗生素及已知杂质。所有化合物在从定量限至200ng/ml的范围内线性良好(r2＞0.99)。该方法与现有药典中规定的微生物管碟法相比，专属性好，灵敏度高，操作简便。其灵敏度、精密度、回收率均满足分析要求，可以应用于牛肺表面活性提取物中四环素类抗生素的残留的测定。同时，该方法也具备应用于其他样品中四环素类抗生素残留的测定的潜力。最终，在牛肺表面活性提取物中检出了土霉素和四环素，其中土霉素残留量小于0.031mg/kg，四环素则未达到定量限(0.006mg/kg)，该残留量尚未达到对患者临床治疗产生影响的程度。以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本
技术领域：
：的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。当前第1页12当前第1页12