一种核酸适配体荧光试纸条及其制备方法和应用与流程

本发明涉及生物检测技术领域，具体而言，涉及一种核酸适配体荧光试纸条及其制备方法和应用。

背景技术：

试纸条作为一种简单快速的分析工具已被广泛用于临床诊断、食品安全以及环境监测中。目前试纸条主要有胶体金和荧光两种检测方式，其中胶体金试纸条通过显色反应来显示结果，具有肉眼可见无需其他仪器的优点；但其缺点是灵敏度低，且只能通过比较颜色深浅达到半定量的目的。相对于胶体金试纸条，荧光试纸条灵敏度高，搭配便携式的荧光检测仪可以对样品中的靶标物进行精确定量，因此成为近年来试纸条发展的方向。

但是无论胶体金试纸条还是荧光试纸条，目前基本都是基于抗原抗体反应的试纸条，抗原抗体作为活性蛋白需要低温储运保存，因此货架期较短，限制了该技术在偏远条件落后地区的应用。而且由于很多小分子物质制备半抗原困难，难以刺激产生高亲和力的抗原抗体，更是限制了这一技术的应用。

核酸适配体是近年来新发现的一类识别分子，主要是指长度在10-100碱基之间的单链dna，能够通过构象折叠后与靶标分子高亲和力高特异性结合。核酸适配体是通过体外筛选得来的，因此与抗体相比，其靶标不受限制，小到金属离子大到蛋白质分子都可以筛选适配体，筛选的适配体经测序后可以批量合成，易于修饰，稳定性好，能够代替抗体被用于各式各样的抗体分析方法中，因此也被成为化学抗体。

同样的核酸适配体也被代替抗体用于试纸条开发中，其原理类似于传统的试纸条。但是目前基于核酸适配体的胶体金或荧光试纸条并不多，其主要原因是不同适配体序列长度不一，大部分适配体序列比较长，因此和互补链形成双链的亲和力要大于适配体和靶标形成复合物的亲和力，因此导致已经结合了靶标的适配体在检测线处仍然发生解离，无法实现对靶标的精确检测。检测线固定抗原虽然使得竞争力一致，但对于很多小分子靶标来说与偶联蛋白结合后限制了与适配体的结合，使得适配体无法在检测线处结合，无法实现灵敏和准确检测。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明提出了一种核酸适配体荧光试纸条，结构简单，检测灵敏，准确度高。

本发明又提出了一种核酸适配体荧光试纸条的制备方法，操作简单，灵活性强。

本发明是这样实现的：

本发明提出一种核酸适配体荧光试纸条，包括底板、样品垫、纳米材料垫、反应膜以及吸水垫，样品垫、纳米材料垫、反应膜以及吸水垫的端部依次连接形成检测层，检测层与底板连接，反应膜设有检测线和质控线，检测线设置于靠近纳米材料垫的一端，质控线设置于靠近吸水垫的一端；

纳米材料垫附着有荧光素标记的核酸适配体和/或荧光标记的带有连接序列的核酸适配体以及游离荧光素，检测线固定有核酸适配体的互补链或核酸适配体连接序列的互补链，质控线处设置有与荧光素相对应的抗荧光素抗体。

本发明提出一种核酸适配体荧光试纸条的制备方法，包括：将样品垫、纳米材料垫、反应膜以及吸水垫依次粘贴至底板的同一侧。

本发明提出一种核酸适配体荧光试纸条在食品安全、环境监测以及临床诊断中的应用。

上述方案的有益效果：

本发明实施例提供的一种核酸适配体荧光试纸条，用纳米材料垫取代了常规试纸条中的金标垫，纳米材料点可以紧紧吸附住荧光素标记的核酸适配体并淬灭其荧光，当有靶标时，只有和靶标结合的适配体才会解离，荧光恢复并且随样品前行到检测线，通过适配体和互补链或适配体连接序列与其对应的互补链结合，使检测线出现荧光并且随靶标浓度增加而增强。该方法具有通用性，可以应用于各种长短的适配体，也适用于各种分子大小的靶标；本方法测量结果灵敏准确可靠，避免了适配体互补链与适配体靶标亲和力不一致以及小分子靶标偶联抗原使亲和力变化导致的测量不准确。该试纸条将荧光素标记的适配体吸附于纳米材料，通过纳米材料对荧光素的淬灭作用，提高荧光素的稳定性。

本试纸条采用了荧光标记，具有较高的灵敏度，通过荧光读卡仪测定荧光强度，可以实现对靶标分子的精确定量检测。

本试纸条采用游离荧光素作为质控，通过质控线荧光标记，为试纸条的有效性提供保证。

本试纸条采用检测线荧光信号与质控线荧光信号的比值作为检测结果依据，避免不同试纸条以及不同操作环境条件造成的差异，提高了不同操作之间的可比性，使结果更加准确可靠。

该试纸条结构简单，检测方便，检测灵敏准确，可以室温储存，具有广泛的应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明提供的核酸适配体荧光试纸条的结构示意图；

图2为本发明实施例2的检测磺胺二甲氧嘧啶的标准曲线；

图3为本发明实施例3的检测赭曲霉毒素a的标准曲线。

图标：100-核酸适配体荧光试纸条；110-样品垫；120-纳米材料垫；130-反应膜；131-检测线；133-质控线；140-吸水垫；150-检测层；160-底板。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

下面对本发明实施例的一种核酸适配体荧光试纸条及其制备方法和应用进行具体说明。

本发明提供的一种核酸适配体荧光试纸条，包括底板、样品垫、纳米材料垫、反应膜以及吸水垫，样品垫、纳米材料垫、反应膜以及吸水垫的端部依次连接形成检测层，检测层与底板连接，反应膜设有检测线和质控线，检测线设置于靠近纳米材料垫的一端，质控线设置于靠近吸水垫的一端；

纳米材料垫附着有荧光素标记的核酸适配体和/或荧光标记的带有连接序列的核酸适配体以及游离荧光素，检测线固定有核酸适配体的互补链或核酸适配体连接序列的互补链，质控线处设置有与荧光素相对应的抗荧光素抗体。

样品垫吸附待测样品，样品从样品垫经过层析作用流动至纳米材料垫，较优的，样品垫由纤维素膜制作而成。吸水垫用于吸收样品，可以为吸水滤纸。

较优的，纳米材料垫可以为多孔纳米材料膜或由纳米材料修饰的玻璃纤维素膜。纳米材料包括但不限于氧化石墨烯、还原石墨烯、纳米金、二硫化钼以及碳纳米管中的至少一种。纤维素膜包括但不限于玻璃纤维、纤维素滤纸及聚酯膜中的至少一种。

本发明的重点在于用纳米材料垫取代了常规试纸条的金标垫，可以适用各种长度的核酸适配体及各种各样的靶标。而常规试纸条将胶体金或荧光素标记的适配体固定到金标垫上，然后与检测线上的抗原或互补链进行反应显色或发出荧光。这种方法常常受到限制：首先如果在检测线固定互补链，这对于序列比较长的适配体来说，由于适配体与互补链的亲和力大于适配体与靶标的亲和力，从而无法实现竞争反应；其次如果在检测线固定靶标，对于小分子靶标来说，需要和载体蛋白偶联后再固定，由于这种偶联限制了适配体与靶标分子的充分结合，降低了亲和力，甚至最后无法结合，最终导致无法检测。

本发明试纸条检测原理为：

当用本发明的核酸适配体荧光试纸条检测样品时，将待测样品滴加到样品垫上，样品会在毛细作用下层析上行，当样品进入到纳米材料垫时，样品中的靶标会和荧光标记的核酸适配体结合，形成复合物并使荧光素标记的核酸适配体从纳米材料表面解离，同时纳米材料垫中的游离荧光素在样品带动下，与靶标-适配体复合物一起层析到硝酸纤维素膜上。

靶标-适配体复合物到达检测线时，会和检测线上固定的生物素修饰的核酸适配体的互补链或核酸适配体连接序列的互补链结合，检测线出现荧光。且靶标量越多，解离的靶标-适配体复合物越多，结合到检测线上的荧光标记的适配体越多，检测线荧光信号越强；反之样品中的靶标越少，检测线处荧光信号越低，从而可以通过荧光给信号强弱对样品中的靶标进行定量。

如果样品中不含待检测的靶标，则荧光素标记的核酸适配体与纳米材料紧密结合，而不会被解离，从而检测线处没有荧光。无论样品中是否有待检测靶标，纳米材料垫上的游离荧光素上行到质控线时会被质控线处的抗荧光素抗体结合，质控线出现荧光。若质控线处没有荧光出现，则表明本试纸条失效，更换试纸条重新测定。质控线可以及时知晓试纸条是否失效，提高检测的准确性。

一种核酸适配体荧光试纸条的制备方法包括：

纳米材料修饰的纳米材料垫的制备方法：选取纤维素膜作为制备纳米材料垫的原料，将纳米材料悬浮溶液喷洒至纤维素膜，在110～130℃的条件下干燥7～9h，除去玻璃纤维素膜上的水分，得到经纳米材料改性的纤维素膜。根据需要裁剪即得纳米材料垫。

吸附有荧光标记适配体的纳米材料垫的制备方法：将荧光标记的核酸适配体和/或荧光标记的带有连接序列的核酸适配体以及游离荧光素滴加至纳米材料，孵育15～25min后，在35～40℃的条件下干燥，除去纳米材料的水分。较优的，荧光素可以采用异硫氰酸荧光素(fitc)、藻红蛋白(pe)、花青素5(cy5)、羧基荧光素(fam)、量子点、上转移及荧光微球等，本发明对其不做限定。核酸适配体根据靶标不同选用特异性的核酸适配体并设计相应的连接序列。较优的，核酸适配体连接序列包括polytn、polyan、polycn、polygn中的一种，其中n为6～25的整数。

反应膜为发生荧光显色反应的部分。在本发明实施例中，采用硝酸纤维素膜作为反应膜，在本发明的其他实施例中，反应膜可以采用其他材料。反应膜设有检测线用于检测靶标。

反应膜检测线制备方法：将生物素修饰的核酸适配体的互补链或核酸适配体连接序列的互补链与亲和素孵育25～35min，然后直接喷至检测线处。较优的，与核酸适配体连接序列相对应的核酸适配体连接序列的互补链包括polyan、polytn、polygn、polycn中的一种，其中n为6～25的整数。

反应膜靠近吸水垫的一端还设置有质控线，用于验证试纸条是否有效。反应膜质控线的制备方法：将与标记适配体的荧光素相对应的抗荧光素抗体喷至质控线处，待干燥即可。

纳米材料垫与反应膜制备完成后，将样品垫、纳米材料垫、反应膜以及吸水垫依次粘贴至底板的同一侧。该荧光试纸条结构简单，检测灵敏，准确度高。

本发明还提供了上述核酸适配体荧光试纸条在食品安全、环境监测以及临床诊断中的检测应用，包括：

s1.用试纸条检测靶标物标准品，得到标准品在试纸条的检测线和质控线的荧光信号强度比值，制作靶标标准品的浓度对应信号强度比值的线性回归曲线，计算回归方程；

s2.用试纸条检测待测样品，得到待测样品在试纸条的检测线和质控线的荧光信号强度比值，根据s1得到的回归方程，得到待测样品中靶标物的含量。

检测检测线和质控线的荧光信号强度比值的方法包括：取靶标标准品或待测样品滴加到试纸的样品吸收垫上，8～12min后，将试纸条放入试纸条检测仪器esequant-lr3中进行检测，分别测定检测线和质控线的荧光信号强度；将检测线的荧光信号强度(t)比上质控线的荧光信号强度(c)，得到t/c值，即为检测线和质控线的荧光信号比值。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

请参照图1，本发明提供了一种核酸适配体荧光试纸条100，包括底板160、样品垫110、纳米材料垫120、反应膜130以及吸水垫140，样品垫110、纳米材料垫120、反应膜130以及吸水垫140的端部依次连接形成检测层150，检测层150与底板160连接。

在本发明的实施例中，核酸适配体荧光试纸条100可以为常规的长条形，样品垫110、纳米材料垫120、反应膜130以及吸水垫140均为相对应的长条形，在其他实施例中，核酸适配体荧光试纸条100可以为圆形或其他形状，样品垫110、纳米材料垫120、反应膜130以及吸水垫140的形状也相应的进行改变，本发明对其外形不做限定。

反应膜130设有检测线131和质控线133，检测线131设置于靠近纳米材料垫120的一端，质控线133设置于靠近吸水垫140的一端。检测线131与质控线133之间保持一定距离，以区分荧光的显色原因，区分靶标与游离荧光素。

实施例2

本实施例提供了一种磺胺二甲氧嘧啶核酸适配体试纸条、制备方法及其检测和应用。

一、磺胺二甲氧嘧啶核酸适配体试纸条的制备方法包括：

选取玻璃纤维素膜作为制备纳米材料垫的原料，将氧化石墨烯悬浮溶液喷洒至玻璃纤维素膜，在120℃的条件下干燥8h，除去玻璃纤维素膜上的水分，得到经氧化石墨烯改性的玻璃纤维。裁剪即得纳米材料。

将cy5荧光素标记的含有连接序列polyt15的磺胺二甲氧嘧啶适配体(cy5-gaggg-caacgagtgtttatagattttttttttttttt)滴加到纳米材料垫上，孵育20分钟，在37℃的条件下干燥，除去纳米材料的水分。

选取硝酸纤维素膜作为反应膜。将生物素修饰的适配体连接链的互补序列polya15(btiotin-aaaaaaaaaaaaaaa)与亲和素孵育30min，然后喷至检测线处；将抗cy5的抗体喷至质控线处。

将样品垫、纳米材料垫、反应膜以及吸水垫依次粘贴至底板的同一侧。

二、试纸条的检测原理：

如图1所示，当含有磺胺二甲氧嘧啶的样品加入样品垫上时，样品在毛细作用下流动到纳米材料垫，样品中的磺胺二甲氧嘧啶与纳米材料垫上的核酸适配体结合，使其从纳米材料垫上解离，并带着游离的荧光素一起继续向前流动。当流动到检测线时，结合有靶标的核酸适配体上的连接序列会与检测线上的连接序列的互补序列结合，从而在检测线处出现荧光，而且样品中的磺胺二甲氧嘧啶越多，检测线上的荧光强度越强；反之样品中的磺胺二甲氧嘧啶越少，检测线上的荧光强度越低，从而可以根据荧光强度的高低对样品中的磺胺二甲氧嘧啶进行定量检测。同时液体中游离荧光素继续上行至质控线处并被此处的抗体捕获，出现荧光信号。检测线和质控线上的荧光可以用试纸条检测仪器esequant-lr3检测出荧光信号强度。

如图1所示，当样品中不含有磺胺二甲氧嘧啶时，核酸适配体无法从纳米材料垫上解离，因此检测线处无适配体结合，也就没有荧光信号。而纳米材料垫上的游离荧光素仍然可以在样品液体的带动下上行到反应膜的质控线处并被抗荧光素抗体捕获，质控线出现荧光信号。

三、磺胺二甲氧嘧啶核酸适配体试纸条的检测方法。

取系列浓度磺胺二甲氧嘧啶标准品滴加到试纸的样品吸收垫上，10分钟后，将试纸条放入试纸条检测仪器esequant-lr3中，进行检测，分别测定检测线和质控线的荧光信号强度；将检测线的荧光信号强度(t)比上质控线的荧光信号强度(c)，得到t/c值，制作磺胺二甲氧嘧啶标准品的浓度对数对应荧光信号t/c比值的线性回归曲线，计算回归方程；

将胺二甲氧嘧啶标准品替换为待测样品，用上述试纸检测待测样品，记录在试纸的检测线和质控线的荧光信号比值，根据步骤(1)的回归方程，得到待测样品中黄曲霉毒素的浓度。

四、磺胺二甲氧嘧啶试纸条性能研究。

1、检测磺胺二甲氧嘧啶灵敏度与线性范围

配制不同浓度磺胺二甲氧嘧啶水溶液，分别用实施例2制备的试纸条进行测定。用试纸条检测仪器esequant-lr3分别测定检测线和质控线处的荧光强度。利用检测线荧光强度与质控线荧光强度比值(表1)，绘制检测磺胺二甲氧嘧啶的标准曲线如图2所示，结果表明，试纸条的灵敏度20ng/ml；线性范围为20ng/ml～500ng/ml。回归方程为y＝1.4064x-1.8343，r²＝0.9693。

表1磺胺二甲氧嘧啶标准品的检测结果

2、特异性研究

分别配制浓度均为为100ng/ml的磺胺二甲氧嘧啶溶液、氯霉素溶液、四环素溶液、恩诺沙星溶液和金刚烷胺溶液，均用该试纸条进行测定，结果(表2)表明，只有磺胺二甲氧嘧啶在t线处出现了显著的荧光信号，其他药物检测线处几乎没有荧光信号，因此表明本试纸条具有很好的特异性。

表2磺胺二甲氧嘧啶试纸条特异性检测结果

五、磺胺二甲氧嘧啶试纸条在检测牛奶中磺胺二甲氧嘧啶中的应用

1、标准曲线绘制

同本实施例第一部分中检测磺胺二甲氧嘧啶灵敏度与线性范围研究中的标准曲线方法，得到的回归方程为：y＝1.4064x-1.8343，r²＝0.9693，为磺胺二甲氧嘧啶标准曲线一元回归方程。

2、样品提取

选择5份经国标方法(lc-msms)测定不含有磺胺二甲嘧啶的牛奶样品，分别加入不同浓度的磺胺二甲氧嘧啶，然后进行样品提取，提取方法为：取2ml牛奶于pvc管中，然后加入2ml去离子水，在全温振荡培养箱中(27℃；180r)振荡摇匀10min后，加入7ml的乙酸乙酯，在相同条件下，振荡摇匀15min，之后在5000r/4℃条件下离心15min，然后取上清液再加入7ml乙酸乙酯，相同条件下再进行振荡摇匀与离心，第二次离心结束后取其上清液，氮吹至沉淀，最后用2ml去离子水溶解。

3、样品测定

取上述制备好的待测样品100μl滴加到试纸条的样品吸收垫上，观察样品层析沿着硝酸纤维素膜流动，直到被上面的吸水垫吸附；10分钟后，将试纸条放入试纸条检测仪器esequant-lr3中，进行检测，分别测定检测线和质控线的荧光信号强度；将检测线的荧光信号强度(t)比上质控线的荧光信号强度(c)，将得到的计算值代入上述步骤1的回归方程，计算得到待测样品中磺胺二甲氧嘧啶的浓度。

4、检测结果：

5份牛奶样品检测结果如表3所示。从结果可以看出，5份样品的回收率均在89％～105％之间，回收率较好，说明本发明试纸条具有较高的准确性。另外本方法标准差小于10％，说明本方法具有很好的稳定性。因此可以用于实际样品中磺胺二甲氧嘧啶的检测。

表3本发明试纸条检测牛奶中磺胺二甲氧嘧啶结果

实施例3

本实施例提供了一种赭曲霉毒素a试纸条制备及应用。

一、赭曲霉毒素a试纸条的制备方法：

选取玻璃纤维素膜作为制备纳米材料垫的原料，将氧化石墨烯悬浮溶液喷洒至玻璃纤维素膜，在110℃的条件下干燥7h，除去玻璃纤维素膜上的水分，得到经氧化石墨烯改性的玻璃纤维。裁剪即得纳米材料。

将fam荧光素标记的含有连接序列polyt15的赭曲霉毒素a适配体(fam-gatcgggtgtgggtggcgtaaagggagcatcggacattttttttttttttt)滴加到纳米材料垫上，孵育15分钟，在35℃的条件下干燥，除去纳米材料的水分。

选取硝酸纤维素膜作为反应膜。将生物素修饰的适配体连接链的互补序列polya15(btiotin-aaaaaaaaaaaaaaa)喷至检测线处，将抗cy5的抗体喷至质控线处。

将样品垫、纳米材料垫、反应膜以及吸水垫依次粘贴至底板的同一侧。

二、赭曲霉毒素a试纸条的检测原理

检测原理同实施例2中磺胺二甲氧嘧啶试纸条的检测原理。

三、赭曲霉毒素a试纸条的检测方法

该检测方法同实施例2中磺胺二甲氧嘧啶试纸条的检测方法。

四、赭曲霉毒素a试纸条性能研究

1、检测赭曲霉毒素a灵敏度确定与标准曲线制备

配制不同浓度赭曲霉毒素a溶液，分别用实施例3制备的试纸条进行测定。用试纸条检测仪器esequant-lr3分别测定检测线和质控线处的荧光强度。利用检测线荧光强度与质控线荧光强度比值(表4)，绘制检测赭曲霉毒素a的标准曲线如图3所示，结果表明，试纸条的灵敏度2ng/ml；线性范围为2ng/ml～50ng/ml。回归方程y＝1.2593x-0.1874，r²＝0.941。

表4赭曲霉毒素a标准品的检测结果

2、特异性研究

分别配制浓度均为为10ng/ml的赭曲霉毒素a、黄曲霉毒素b1、黄曲霉毒素m1、呕吐毒素、伏马毒素和玉米赤霉醇溶液，均用该试纸条进行测定，结果(表5)表明，只有赭曲霉毒素a在t线处出现了显著的荧光信号，其他毒素检测线处几乎没有荧光信号，因此表明本试纸条具有很好的特异性。

表5赭曲霉毒素a试纸条特异性检测结果

五、赭曲霉毒素a试纸条在检测饲料中赭曲霉毒素a的应用

1、标准曲线绘制

同本实施例第一部分中检测赭曲霉毒素a灵敏度与线性范围研究中的标准曲线方法，得到的回归方程为y＝1.2593x-0.1874，r²＝0.941，为赭曲霉毒素a标准曲线一元回归方程。

2、样品提取

选择5份经国标方法(lc-msms)测定含有赭曲霉毒素a饲料样品，进行样品提取，提取方法为：首先将饲料或谷物样品进行粉碎并通过20目筛。取0.5g处理后样品，加入到15ml离心管中。向离心管中准确加入纯净水和乙酸乙酯各2ml，将瓶塞盖紧密封，用力振荡5分钟，4000rpm离心1分钟；用吸管取0.6ml上清液到小玻璃杯中，吹干滤液，然后用0.3ml稀释液复溶杯底固体。此溶解液即为检测液。

3、样品测定

取上述制备好的待测样品100μl滴加到试纸条的样品吸收垫上，观察样品层析沿着硝酸纤维素膜流动，直到被上面的吸水垫吸附；10分钟后，将试纸条放入试纸条检测仪器esequant-lr3中，进行检测，分别测定检测线和质控线的荧光信号强度；将检测线的荧光信号强度(t)比上质控线的荧光信号强度(c)，将得到的计算值代入上述步骤1的回归方程，计算得到待测样品中赭曲霉毒素a的浓度。

4、检测结果：

6份饲料样品检测结果如表6所示。从结果可以看出，6份样品的回收率均在87％～105％之间，与国标方法lc-ms/ms方法具有非常好的一致性，说明本发明试纸条具有较高的准确性。另外本方法标准差小于10％，说明本方法具有很好的稳定性。因此可以用于饲料样品中赭曲霉毒素a的检测。

表6本发明试纸条检测饲料中赭曲霉毒素a结果

综上所述，本发明实施例提供的一种核酸适配体荧光试纸条，用纳米材料垫取代了常规试纸条中的金标垫，解决了目前大部分核酸适配体无法用于试纸条开发的缺陷，为众多分析物提供了一种新的分析方法。而且通过本发明实施例可以看出，本方法与lc-ms/ms等国标方法具有非常好的一致性，但本方法操作简单，成本低廉，更便于基层及现场检测应用。

以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。