本发明涉及药物分析技术领域，具体地，涉及他达拉非片有关物质的分析检测方法。
背景技术：
他达拉非是环磷酸鸟苷(cGMP)特异性磷酸二酯酶5(PDE5)的选择性、可逆性抑制剂，是治疗勃起功能障碍(ED)的首选药物之一。他达拉非由Lilly-Icos公司开发，2002年11月获欧盟批准，2003年2月首次在英国、瑞典、丹麦、德国及澳大利亚等多个国家上市，2007年在美国上市，2008年以每日一次的规格在欧洲上市。2008年11月，增加了美国礼来的他达拉非治疗肺动脉高血压(PAH)的新适应症。目前美国药典收载了关于他达拉非片有关物质的检测方法，但在实际检测过程中发现，主峰(他达拉非)与主峰后的杂质峰不能有效分离。
因此，关于他达拉非片的检测方法有待研究。
技术实现要素：
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种具有灵敏度更高或分离度更好等优点的分析检测他达拉非有关物质的方法。
在本发明的一个方面，本发明提供了一种他达拉非片有关物质的分析检测方法。根据本发明的实施例，所述方法是利用结合紫外检测器的高效液相色谱法进行的，其中，色谱柱为苯基键合硅胶柱；流动相由水、酸试药和有机溶剂组成，酸试药选自磷酸、三氟乙酸、醋酸和草酸中的至少一种，有机溶剂选自甲醇、乙腈、乙醇中的至少一种。通过对影响色谱检测效果的各方面因素进行考察和验证，发明人惊奇地发现，采用苯基柱，可以有效改善各组分的保留时间，从而很好的分离他达拉非片制备过程引入的杂质和降解杂质，灵敏度高，专属性强、准确度高、重现性好。
根据本发明的实施例，酸试药选自三氟乙酸。
根据本发明的实施例，有机溶剂选自乙腈。
根据本发明的实施例，紫外检测器的检测的波长为285±2nm。
根据本发明的实施例，高效液相色谱法的柱温为30～40℃。
根据本发明的实施例，高效液相色谱法的流速为0.8～1.2ml/min。
根据本发明的实施例，流动相中水、有机相和酸试药的体积比例为(60～70):(30～40):(0.05～0.15)。
根据本发明的实施例，高效液相色谱法的洗脱方式为等度洗脱。
根据本发明的实施例，前面所述的方法包括以下步骤：
(1)供试品溶液的制备：取他达拉非片，研细，精密称定细粉适量，用体积比为50:50的乙腈-水溶液使其溶解制成每1ml中含他达拉非0.2mg的溶液，离心取上清液即得所述供试品溶液；
(2)色谱条件：采用Agilent Zorbox SB-phenyl柱，250mm×4.6mm，5μm或与其等效的色谱柱，流动相为体积比为(30～40):(60～70):(0.05～0.15)的乙腈-水-三氟乙酸，检测波长为285±2nm，流速为0.8～1.2ml/min，柱温为30～40℃，等度洗脱；
(3)取所述供试品溶液30μl，按照上述色谱条件，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。
根据本发明的实施例，前面所述的方法包括：(1)供试品溶液的制备：取他达拉非片，研细，精密称定细粉适量，用体积比为50:50的乙腈-水溶液使其溶解制成每1ml中含他达拉非0.2mg的溶液，离心取上清液即得所述供试品溶液；(2)色谱条件：采用Agilent Zorbox SB-phenyl柱，250mm×4.6mm，5μm，流动相为体积比为30:70:0.05的乙腈-水-三氟乙酸，检测波长为285±2nm，流速为0.8ml/min，柱温为30℃，等度洗脱；(3)取所述供试品溶液30μl，按照上述色谱条件，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。
根据本发明的实施例，前面所述的方法包括：(1)供试品溶液的制备：取他达拉非片，研细，精密称定细粉适量，用体积比为50:50的乙腈-水溶液使其溶解制成每1ml中含他达拉非0.2mg的溶液，离心取上清液即得所述供试品溶液；(2)色谱条件：采用Agilent Zorbox SB-phenyl柱，250mm×4.6mm，5μm，流动相为体积比为35:65:0.1的乙腈-水-三氟乙酸，检测波长为285±2nm，流速为1.0ml/min，柱温为35℃，等度洗脱；(3)取所述供试品溶液30μl，按照上述色谱条件，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。
根据本发明的实施例，前面所述的方法包括：(1)供试品溶液的制备：取他达拉非片，研细，精密称定细粉适量，用体积比为50:50的乙腈-水溶液使其溶解制成每1ml中含他达拉非0.2mg的溶液，离心取上清液即得所述供试品溶液；(2)色谱条件：采用Agilent Zorbox SB-phenyl柱，250mm×4.6mm，5μm，流动相为体积比为40:60:0.15的乙腈-水-三氟乙酸，检测波长为285±2nm，流速为1.2ml/min，柱温为40℃，等度洗脱；(3)取所述供试品溶液30μl，按照上述色谱条件，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。
附图说明
图1是本发明一个实施例中他达拉非的紫外扫描图。
图2是本发明另一个实施例中他达拉非片中有关物质色谱图。
图3是本发明一个对比例中他达拉非片中有关物质色谱图。
图4是本发明另一个对比例中他达拉非片中有关物质色谱图。
图5是本发明又一个实施例中他达拉非片中有关物质色谱图。
图6是本发明又一个实施例中他达拉非片中有关物质色谱图。
图7是本发明又一个实施例中他达拉非片中有关物质色谱图。
图8是本发明又一个实施例中他达拉非片中有关物质色谱图。
图9是本发明又一个实施例中他达拉非片中有关物质色谱图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
在本发明的一个方面，本发明提供了一种他达拉非片有关物质的分析检测方法。根据本发明的实施例，所述方法是利用结合紫外检测器的高效液相色谱法进行的，其中，色谱柱为苯基键合硅胶柱；流动相由水、酸试药和有机溶剂组成，酸试药选自磷酸、三氟乙酸、醋酸和草酸中的至少一种，有机溶剂选自甲醇、乙腈、乙醇中的至少一种。通过对影响色谱检测效果的各方面因素进行考察和验证，发明人惊奇地发现，采用苯基柱，可以有效改善各组分的保留时间，从而很好的分离他达拉非片制备过程引入的杂质和降解杂质，灵敏度高，专属性强、准确度高、重现性好。
根据本发明的实施例，为了使他达拉非与与其相关杂质有效分离，在本发明的一些实施例中，酸试药选自三氟乙酸。由此，不仅可以有效分离他达拉非和杂质，并且分离的效果更佳。
根据本发明的实施例，为了使他达拉非与与其相关杂质有效分离，在本发明的一些实施例中，有机溶剂选自乙腈。由此，不仅可以有效分离他达拉非和杂质，并且分离的效果更佳。
根据本发明的实施例，为了进一步改善检测效果，紫外检测器的检测的波长为285±2nm。他达拉非在波长为285nm处具有最大吸收，由此，检测灵敏度和准确性更好。
根据本发明的实施例，选择色谱柱柱温的原则为即要保证样品组分完全分离，又要保证样品所有组分都不会在色谱柱内冷凝，且峰形较好，同时分析时间越短越好。所以确定柱温要综合考虑色谱柱固定液的使用温度、色谱柱类型、样品组分的复杂程度、色谱柱升温方式以及汽化温度等。在本发明的一些实施例中，高效液相色谱法的柱温为30～40℃。由此，有利于他达拉非和杂质进行有效分离，如果温度过高或过低，分离效果均不理想。
根据本发明的实施例，为了可以快速有效地达到分离检测效果，在本发明的一些实施例中，高效液相色谱法的流速为0.8～1.2ml/min。由此，有利于他达拉非和杂质进行快速有效的分离，如果流速过快或过慢，分离效果均不理想。
根据本发明的实施例，为了获得合适宜的保留时间、分离效果和峰型，在本发明的一些实施例中，流动相中水、有机相和酸试药的体积比例为(60～70):(30～40):(0.05～0.15)。由此，可以获得较佳的分离效果，分离度、保留时间、准确度、峰型等指标均较理想。
根据本发明的实施例，为了获得最佳的分离效果，在本发明的一些实施例中，高效液相色谱法的洗脱方式为等度洗脱。发明人发现，采用上述色谱条件，通过较简单的等度洗脱即可获得较好的分离效果，操作简单、方便，节约成本。
根据本发明的实施例，前面所述的方法包括以下步骤：
(1)供试品溶液的制备：取他达拉非片，研细，精密称定细粉适量，用体积比为50:50的乙腈-水溶液使其溶解制成每1ml中含他达拉非0.2mg的溶液，离心取上清液即得所述供试品溶液；
(2)色谱条件：采用Agilent Zorbox SB-phenyl柱，250mm×4.6mm，5μm或与其等效的色谱柱，流动相为体积比为(30～40):(60～70):(0.05～0.15)的乙腈-水-三氟乙酸，检测波长为285±2nm，流速为0.8～1.2ml/min，柱温为30～40℃，等度洗脱；
(3)取所述供试品溶液30μl，按照上述色谱条件，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。
由此，利用该分析检测方法，能够快速有效地将他达拉非和杂质分离，且分离度高、专属性强、准确度高、重现性好。
根据本发明的实施例，前面所述的方法包括：a.(1)供试品溶液的制备：取他达拉非片，研细，精密称定细粉适量，用体积比为50:50的乙腈-水溶液使其溶解制成每1ml中含他达拉非0.2mg的溶液，离心取上清液即得所述供试品溶液；(2)色谱条件：采用Agilent Zorbox SB-phenyl柱，250mm×4.6mm，5μm，流动相为体积比为30:70:0.05的乙腈-水-三氟乙酸，检测波长为285±2nm，流速为0.8ml/min，柱温为30℃，等度洗脱；(3)取所述供试品溶液30μl，按照上述色谱条件，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。
根据本发明的实施例，前面所述的方法包括：(1)供试品溶液的制备：取他达拉非片，研细，精密称定细粉适量，用体积比为50:50的乙腈-水溶液使其溶解制成每1ml中含他达拉非0.2mg的溶液，离心取上清液即得所述供试品溶液；(2)色谱条件：采用Agilent Zorbox SB-phenyl柱，250mm×4.6mm，5μm，流动相为体积比为35:65:0.1的乙腈-水-三氟乙酸，检测波长为285±2nm，流速为1.0ml/min，柱温为35℃，等度洗脱；(3)取所述供试品溶液30μl，按照上述色谱条件，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。
根据本发明的实施例，前面所述的方法包括：(1)供试品溶液的制备：取他达拉非片，研细，精密称定细粉适量，用体积比为50:50的乙腈-水溶液使其溶解制成每1ml中含他达拉非0.2mg的溶液，离心取上清液即得所述供试品溶液；(2)色谱条件：采用Agilent Zorbox SB-phenyl柱，250mm×4.6mm，5μm，流动相为体积比为40:60:0.15的乙腈-水-三氟乙酸，检测波长为285±2nm，流速为1.2ml/min，柱温为40℃，等度洗脱；(3)取所述供试品溶液30μl，按照上述色谱条件，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。
由此，利用该分析检测方法，能够快速有效地将他达拉非和杂质分离，且分离度高、专属性强、准确度高、重现性好。
实施例
实施例1：检测波长的确定
取他达拉非适量，用体积比为50：50的乙腈-水溶液溶解并稀释制成每1ml中含他达拉非0.2mg的溶液，在HPLC-PDA上于200nm～400nm进行全扫描，紫外扫描图参见图1。由图1可知，根据他达拉非的紫外吸收情况，选择285±2nm作为检测波长。
实施例2：色谱柱选择(苯基柱)
色谱条件：采用250mm×4.6mm，5μm的Agilent Zorbox SB-phenyl柱，流动相为体积比为35:65:0.1的乙腈-水-三氟乙酸，检测波长为285nm，流速为1.0ml/min，柱温为35℃，等度洗脱。
实验步骤：
1.取他达拉非片，研细，精密称定细粉适量，用体积比为50:50的乙腈-水溶解他达拉非片，并定量稀释制成每1ml中含他达拉非0.2mg的溶液，离心取上清液作为供试品溶液；空白溶剂为体积比50:50的乙腈-水混合液。
2.取供试品溶液及空白溶剂按照上述色谱条件，分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图，他达拉非片中有关物质色谱图见图2。
由图2的结果可知，该色谱图中主峰17.996min与主峰后杂质实现完全分离，分离度大于2.0，且峰形良好。
对比例1：色谱柱选择(美国药典所述C8柱)
美国药典所述他达拉非片有关物质检测方法如下：
色谱条件：采用150mm×4.6mm，3.5μm的Agilent SB-C8柱，流动相为乙腈-水-三氟乙酸(体积比35：65：0.1)检测波长为285nm，流速为1.0ml/min，柱温为35℃，等度洗脱。
实验步骤：
1.取他达拉非片，研细，精密称定细粉适量，用体积比50:50的乙腈-水振摇使他达拉非片溶解，并定量稀释制成每1ml中含他达拉非0.2mg的溶液，离心取上清液作为供试品溶液；空白溶剂为体积比50:50的乙腈-水混合液。
2.取供试品溶液及空白溶剂按照上述色谱条件，分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图，他达拉非片中有关物质色谱图见图3。
由图3的结果可知，该色谱图中主峰严重拖尾，主峰9.256min后有杂质没有被有效分离。
对比例2：色谱柱选择(C18柱)
为提高杂质与主峰之间的分离度，更换色谱柱为C18柱，色谱条件如下：
色谱条件：采用250mm×4.6mm，5.0μm的Venusil ASB C18柱，流动相为体积比为35：65：0.1的乙腈-水-三氟乙酸，检测波长为285nm，流速为1.0ml/min，柱温为35℃，等度洗脱。
实验步骤：
1.取他达拉非片，研细，精密称定细粉适量，用体积比50:50的乙腈-水振摇使他达拉非片溶解，并定量稀释制成每1ml中含他达拉非0.2mg的溶液，离心取上清液作为供试品溶液；空白溶剂为体积比50:50的乙腈-水混合液。
2.取供试品溶液及空白溶剂按照上述色谱条件，分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图，他达拉非片中有关物质色谱图见图4。
由图4的结果可知，该色谱图中主峰9.617min与主峰后杂质分离度较C8柱实验结果有改善，但仍未实现有效分离。
实施例3
色谱条件同实施例2。
实验步骤：
1.高温破坏样品检测：取他达拉非片，研细，精密称定细粉240mg于50mL量瓶中，加入40ml 50％乙腈水溶液，于振荡器中振摇20分钟，于80度水浴放置3小时后，放冷，用50％乙腈水溶液定容至刻度，摇匀，取续滤液作为供试品溶液；取供试品溶液30μl按照实施例2中的色谱条件进行色谱检测，图谱见图5。
2.光降解样品检测：取他达拉非片，研细，精密称定细粉240mg于50mL量瓶中，加入40ml 50％乙腈水溶液，于光照箱中放置6小时后，用50％乙腈水溶液定容至刻度，摇匀，取续滤液作为供试品溶液；取供试品溶液30μl按照实施例2中的色谱条件进行色谱检测，图谱见图6。
3.酸破坏样品检测：取他达拉非片，研细，精密称定细粉240mg于50mL量瓶中，加入40ml 50％乙腈水溶液，于振荡器中振摇20分钟，加入1mol/L盐酸水溶液2ml，于80度水浴放置3小时后，放冷，用1mol/L氢氧化钠水溶液调溶液至中性，50％乙腈水溶液定容至刻度，摇匀，取续滤液作为供试品溶液；取供试品溶液30μl按照实施例2中的色谱条件进行色谱检测，图谱见图7。
4.碱破坏样品检测：取他达拉非片，研细，精密称定细粉240mg于50mL量瓶中，加入40ml 50％乙腈水溶液，于振荡器中振摇20分钟，加入1mol/L氢氧化钠水溶液1ml，放置3小时后，放冷，用1mol/L盐酸水溶液调溶液至中性，50％乙腈水溶液定容至刻度，摇匀，取续滤液作为供试品溶液；取供试品溶液30μl按照实施例2中的色谱条件进行色谱检测，图谱见图8。
5.氧化破坏样品检测：取他达拉非片，研细，精密称定细粉240mg于50mL量瓶中，加入40ml 50％乙腈水溶液，于振荡器中振摇20分钟，加入30％过氧化氢溶液2ml，放置3小时后，50％乙腈水溶液定容至刻度，摇匀，取续滤液作为供试品溶液；取供试品溶液30μl按照实施例2中的色谱条件进行色谱检测，图谱见图9。
由强制降解试验得到的色谱图可以发现，他达拉非片溶液在光照破坏、高温破坏条件下比较稳定，但在酸、碱、氧化破坏条件下均有较大程度的降解。各个降解杂质与主峰之间均得到很好的分离，该有关物质分析方法可用于检测降解杂质。
实施例4
色谱条件：采用250mm×4.6mm，5μm的Agilent Zorbox SB-phenyl柱，流动相为体积比为40:60:0.05的乙腈-水-三氟乙酸，检测波长为285nm，流速为1.2ml/min，柱温为30℃，等度洗脱。
实验步骤：
1.取他达拉非片，研细，精密称定细粉适量，用体积比为50:50的乙腈-水溶解他达拉非片，并定量稀释制成每1ml中含他达拉非0.2mg的溶液，离心取上清液作为供试品溶液；空白溶剂为体积比50:50的乙腈-水混合液。
2.取供试品溶液及空白溶剂按照上述色谱条件，分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图。结果表明，主峰与主峰后杂质实现完全分离，分离度大于2.0，且峰形良好。
实施例5
色谱条件：采用250mm×4.6mm，5μm的Agilent Zorbox SB-phenyl柱，流动相为体积比为30:70:0.15的乙腈-水-三氟乙酸，检测波长为285nm，流速为0.8ml/min，柱温为40℃，等度洗脱。
实验步骤：
1.取他达拉非片，研细，精密称定细粉适量，用体积比为50:50的乙腈-水溶解他达拉非片，并定量稀释制成每1ml中含他达拉非0.2mg的溶液，离心取上清液作为供试品溶液；空白溶剂为体积比50:50的乙腈-水混合液。
2.取供试品溶液及空白溶剂按照上述色谱条件，分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图。结果表明，主峰与主峰后杂质实现完全分离，分离度大于2.0，且峰形良好。
实施例6
色谱条件：采用250mm×4.6mm，5μm的Agilent Zorbox SB-phenyl柱，流动相为体积比为33:67:0.05的乙腈-水-三氟乙酸，检测波长为285nm，流速为1.0ml/min，柱温为35℃，等度洗脱。
实验步骤：
1.取他达拉非片，研细，精密称定细粉适量，用体积比为50:50的乙腈-水溶解他达拉非片，并定量稀释制成每1ml中含他达拉非0.2mg的溶液，离心取上清液作为供试品溶液；空白溶剂为体积比50:50的乙腈-水混合液。
2.取供试品溶液及空白溶剂按照上述色谱条件，分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图。结果表明，主峰与主峰后杂质实现完全分离，分离度大于2，较佳的分离度可大于4.0，且峰形良好。
实施例7
色谱条件：采用250mm×4.6mm，5μm的Agilent Zorbox SB-phenyl柱，流动相为体积比为35:65:0.15的乙腈-水-三氟乙酸，检测波长为285nm，流速为1.0ml/min，柱温为37℃，等度洗脱。
实验步骤：
1.取他达拉非片，研细，精密称定细粉适量，用体积比为50:50的乙腈-水溶解他达拉非片，并定量稀释制成每1ml中含他达拉非0.2mg的溶液，离心取上清液作为供试品溶液；空白溶剂为体积比50:50的乙腈-水混合液。
2.取供试品溶液及空白溶剂按照上述色谱条件，分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图。结果表明，主峰与主峰后杂质实现完全分离，分离度大于2，较佳的分离度可大于4.0，且峰形良好。
实施例8
色谱条件：采用250mm×4.6mm，5μm的Agilent Zorbox SB-phenyl柱，流动相为体积比为35:65:0.15的乙腈-水-三氟乙酸，检测波长为285nm，流速为0.8ml/min，柱温为33℃，等度洗脱。
实验步骤：
1.取他达拉非片，研细，精密称定细粉适量，用体积比为50:50的乙腈-水溶解他达拉非片，并定量稀释制成每1ml中含他达拉非0.2mg的溶液，离心取上清液作为供试品溶液；空白溶剂为体积比50:50的乙腈-水混合液。
2.取供试品溶液及空白溶剂按照上述色谱条件，分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图。结果表明，主峰与主峰后杂质实现完全分离，分离度大于2，较佳的分离度可大于4.0，且峰形良好。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。