双黄连注射液中大分子物质的检测方法与流程

本发明涉及医药领域，特别涉及双黄连注射液中大分子物质的两种检测方法。

背景技术：

中药注射剂的发展经历了半个多世纪，形成了一批在临床治疗危急重症中疗效突出的中药大品种。中药注射液给药方式为静脉注射，起效快，但是其化学成分复杂，且多为大分子物质，这些大分子物质既有免疫原性又具有免疫反应性，因此具有致敏的可能性。根据国家食品药品监督管理局出台的“中药注射剂安全性再评价质量控制要点”，明确要求对于具体品种的工艺条件下可能存在、而质量研究中未检出的大类成分，应建立排除性检查方法，必要时应建立高分子量物质检查项。大分子检测目前没有公认方法，由于各仪器检测方法不同，易造成检测的漏检，本发明采用两种方法对中药注射剂双黄连注射液中大分子物质进行测定研究。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供两种双黄连注射液中大分子物质的检测方法。

本发明的目的是通过如下技术方案实现的：

本发明双黄连注射液中大分子物质的检测方法为凝胶色谱法和maldi-tof/tof法，方法包括如下步骤：

a.凝胶色谱法

色谱条件：色谱柱tskgelg2000swxl7.8*300mm；流动相8-12％乙腈溶液；流速0.8-1.0ml/min；柱温3040℃；进样量10-20μl；检测波长214nm；

标准品溶液的制备：精密称取相对分子量为12300的细胞色素c对照品，置于量瓶中，加流动相溶解稀释至刻度，得终浓度为0.1-0.5mg/ml的溶液；精密称取相对分子量为5800的猪胰岛素对照品，置于量瓶中，加流动相溶解稀释至刻度，得终浓度为0.1-0.5mg/ml的溶液；

供试品溶液的制备：分别取不同批号的双黄连注射液，稀释3-8倍，即得供试品溶液；

测定方法：取标准分子量溶液和供试品溶液各10-20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，并根据各组分的峰面积按归一化法计算各组分的百分含量。

该方法中所述色谱条件优选为：色谱柱为tskgelg2000swxl7.8*300mm；流动相10％乙腈溶液；流速1.0ml/min；柱温35℃；进样量20μl；检测波长214nm。

b.maldi-tof/tof法

仪器ab4700型maldi-tof/tof；正离子模式；离子源加速电压10-30kv；检测条件n2激光源；波长337nm；激光频率：180-220hz；离子延迟提取时间280-350ns；质谱信号单次扫描累加1800-2200次；使用peptideiistandardkit(bruker)离子峰校正(m/z400-m/z4000)；质量扫描范围m/z100-m/z1000，m/z500-m/z5000；检测方式：线性方式(飞行管长1.6m)；基质chca；将样品溶液与基质chca按0.5∶1～2∶1混匀后取1μl直接点靶；上线性正离子模式下检测。

该方法中所述色谱条件优选为：仪器ab4700型maldi-tof/tof；正离子模式；离子源加速电压20kv；检测条件n2激光源；波长337nm；激光频率：200hz；离子延迟提取时间330ns；质谱信号单次扫描累加2000次；使用peptideiistandardkit(bruker)离子峰校正(m/z400-m/z4000)；质量扫描范围m/z100-m/z1000，m/z500-m/z5000；检测方式：线性方式(飞行管长1.6m)；基质chca；将样品溶液与基质chca按1∶1混匀后取1μl直接点靶；上线性正离子模式下检测。

附图说明

图1：批号110918211双黄连注射液凝胶色谱法分子量测定结果

图2：批号110918211双黄连注射液maldi-tof分子量测定结果

下述实施例用于进一步证明但不限于本发明。

具体实施方式

实施例1：采用凝胶色谱法检测双黄连注射液中高分子量物质

a.仪器与试剂lc-10at高效液相色谱(日本岛津)，spd-10av紫外检测仪，cbm-10a系统控制器，色谱柱(tskgelg2000swxl7.8*300mm5ucat#08540ser#s0052)，乙腈(fisher色谱纯试剂)，三氟乙酸(国药集团化学试剂有限公司20100503)，新鲜超纯水(优普超纯水机制造)。

b.色谱条件以三氟乙酸-乙腈-水＝0.05∶10∶90为流动相，检测波长为214nm。流速为1ml/min。

c.对照品溶液制备精密称取细胞色素c对照品(分子量分别为12300，中国药品生物制品检定所140670-200501)1.54mg，置于5ml量瓶中，加流动相溶解稀释至刻度，得溶液终浓度为0.308mg/ml。精密称取猪胰岛素对照品(分子量分别为5800，中国药品生物制品检定所140720-200901)1.78mg，同上操作，得溶液终浓度为0.356mg/ml的标准品溶液。

d.供试品溶液配制取双黄连注射液(批号110917211、110918211、110919211，多多药业有限公司)1ml，稀释额5倍，备用。

e.测定取标准分子量溶液和供试品溶液各20ul，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，并根据各组分的峰面积按归一化法计算各组分的百分含量。

f.结果在胰岛素色谱峰的前面没有色谱峰出现，提示双黄连注射液中没有分子量超过5800的大分子出现。结果见说明书附图1。

实施例2：采用maldi-tof/tof测定双黄连注射液中(2000-30000分子量)各物质精确分子量。

a.仪器与材料ab4700型maldi-tof/tof(ab公司)，chca(fluka)，tfa(sigma)，acn(fisher)。

b.仪器参数正离子模式；离子源加速电压20kv；检测条件n2激光源；波长337nm；激光频率：200hz；离子延迟提取时间330ns；质谱信号单次扫描累加2000次；使用peptideiistandardkit(bruker)离子峰校正(m/z400-m/z4000)；质量扫描范围m/z100-m/z1000，m/z500-m/z5000；检测方式：线性方式(飞行管长1.6m)；基质chca。

c.样品双黄连注射液(批号：110917211、110918211、110919211，多多药业有限公司)。

d.实验方法将样品溶液与基质chca按1∶1混匀后取1ul直接点靶；上线性正离子模式下检测。

e.测定结果分子量超过m/z1000的物质相对峰面积很弱，110917211、110918211、110919211三批次样品检测到超过m/z1000的分子量，每批次分子量最大的依次为1051.02、1035.04、1035.02。对低端分子量进行扫描，离子强度大的集中在m/z100-m/z300，m/z400-m/z550，见说明书附图2。

技术特征：

技术总结
本发明公开了双黄连注射液中大分子物质的检测方法，包括凝胶色谱法和MALDI‑TOF/TOF法，两种检测方法可以对实验结果进行相互验证，能够简单、快捷、全面的检测双黄连注射液中的大分子物质；从凝胶色谱法的结果可以得出3批次双黄连注射液中未检测出分子量超过5800的大分子；由MALDI‑TOF/TOF结果可以得出双黄连注射液中分子量超过m/z1000的物质相对峰面积很弱，离子强度大的集中在m/z100‑m/z300和m/z400‑m/z550。

技术研发人员：蹇小兵;何翔;焦玉红
受保护的技术使用者：多多药业有限公司
技术研发日：2017.11.20
技术公布日：2019.05.28