本发明属于嫁接技术领域，具体涉及一种检测砧木和接穗亲和力的方法。
背景技术：
荧光蛋白如绿色荧光蛋白gfp在蓝色波长范围的光线激发下，会发出绿色荧光，红色荧光蛋白rfp在紫外光的照射下会发出红光，在生物学中经常被用作报告基因。目前砧木和接穗之间的亲和力鉴定主要通过嫁接后植株的成活率以及接穗的生长情况和结果特性来判定。在分子水平上尚缺乏砧木和接穗亲和力评估的方法。
本申请通过构建带有荧光蛋白报告基因的细胞分裂素基因和细胞程序性死亡基因载体，转入砧木和接穗，可以追踪伤口愈合过程中砧木和接穗的功能，分析其信号强弱，从而判定砧木和接穗的亲和性。
技术实现要素：
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种检测砧木和接穗亲和力的方法。该方法能从分子水平上评估砧木和接穗的亲和力，准确性高，方便实用。
为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
一种检测砧木和接穗亲和力的方法，包括以下步骤：
1）取同一种砧木两份：砧木1和砧木2，取同一种接穗两份：接穗1和接穗2；
2）将带有细胞程序性死亡基因的gfp和rfp分别活化后转入农杆菌，然后将带有gfp信号的载体转入砧木1，带有rfp信号的载体转入接穗1，获得带有荧光信号的砧木1和接穗1；
3）将带有细胞分裂素基因的gfp和rfp分别活化后转入农杆菌，然后将带有gfp信号的载体转入砧木2，带有rfp信号的载体转入接穗2，获得带有荧光信号的砧木2和接穗2；
4）将待检测植物的砧木和接穗在基质中培养四周，苗子为三叶一心时，用嫁接刀按45度角切割后，砧木1和接穗1、砧木2和接穗2分别通过嫁接夹固定，在湿度为85%-90%的黑暗25℃环境下生长，之后逐渐增强光照降低湿度，保证伤口愈合；
5）嫁接后每3天，通过激光共聚焦观察细胞分裂素和细胞程序性死亡基因所带的gfp或rfp的信号分布和强弱，分析砧木和接穗的伤口愈合，进而判断其亲和性。
优选的，步骤5）中待嫁接后第21d，分别取砧木的茎段和接穗的茎段，提取rna，反转录为cdna后，检测砧木茎中带有细胞程序性死亡基因或细胞分裂素基因的gfp信号强弱和接穗茎段中带有细胞程序性死亡基因或细胞分裂素基因的rfp信号强弱；若砧木和接穗中带有细胞程序性死亡基因的荧光信号都低，而带有细胞分裂素基因的荧光信号都强（强是指荧光点的分布比例大于70%），则说明砧木和接穗相互亲和，宜用作嫁接栽培；若砧木和接穗中带有细胞程序性死亡基因的荧光信号都强，且带有细胞分裂素基因的荧光信号都弱（弱是指荧光点的分布比例小于30%），则说明砧木接穗互不亲和，不可以用作嫁接栽培；若砧木中带有细胞程序性死亡基因的gfp的表达高，接穗中带有细胞程序性死亡基因rfp的表达量低，则说明砧木不亲和接穗，接穗亲和砧木，不宜用作嫁接栽培；若砧木中带有细胞程序性死亡基因gfp的表达低，接穗中带有细胞程序性死亡基因rfp的表达量高，则说明砧木亲和接穗，而接穗不亲和砧木，可以用作嫁接栽培；若砧木中带有细胞程序性死亡基因gfp和接穗中的带有细胞程序性死亡基因rfp的表达量都高，则说明砧木接穗互不亲和，不可以用作嫁接栽培；若砧木中带有细胞分裂素基因的gfp的表达高，接穗中带有细胞分裂素基因的rfp的表达量低，则说明砧木亲和接穗，接穗不亲和砧木，不宜用作嫁接栽培；若砧木中带有细胞分裂素基因的gfp的表达低，接穗中rfp的表达量高，则说明接穗亲和砧木，而砧木不亲和接穗，不宜用作嫁接栽培；若砧木中带有细胞分裂素基因的gfp和接穗中的带有细胞分裂素基因的rfp的表达量都低，则说明砧木接穗互不亲和，不可以用作嫁接栽培。
本发明的优点在于：
本发明利用荧光蛋白在植物中可被检测的特性检测砧木和接穗的亲和力，从分子层面鉴定了砧木和接穗亲和性的大小，减少了成本，提高了效率。因此，本发明所提供的方法是简便、高效的鉴定砧木和接穗亲和力的方法。
附图说明
图1中a为gfp在亲和性不同的砧木和接穗组合中的表达量；b为rfp在亲和性不同的砧木和接穗组合中的表达量。
具体实施方式
为进一步公开而不是限制本发明，以下结合实例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1
选取细胞分裂素相关基因（arr5）；细胞程序性死亡相关基因（pcd），构建载体parr5:gfp，parr5:rfp，ppcd:gfp和ppcd:rfp。将parr5:gfp载体、ppcd:gfp载体转入砧木1和2，获得带有parr5:gfp的砧木植株1和带有ppcd:gfp的砧木植株1；将parr5:rfp载体、ppcd:rfp载体转入接穗1和2，获得带有parr5:rfp的接穗植株1和带有ppcd:rfp的接穗植株1。
将待测的两组砧木和接穗材料，其中砧木1和接穗1亲和，砧木2和接穗2亲和，且砧木1和接穗2不亲和，砧木2和接穗1不亲和，培养至适宜大小，用嫁接刀按45度角切割后，嫁接夹固定，在黑暗条件下，湿度为85%-90%，25℃下生长3d后转移到半遮阴的环境下生长，之后每3d检测砧木和接穗中gfp和rfp信号的强弱。
经检测，带有pcd基因的荧光蛋白强弱情况为：嫁接后第3d，四个组合中砧木gfp和接穗rfp的表达量都显著增加，说明嫁接对砧木和接穗都造成了创伤，之后到21d，砧木1中的gfp和接穗1中的rfp的信号都减弱，说明二者的伤口已愈合，建立了营养输送通道，砧木1和接穗1的亲和性高；砧木1中的gfp和接穗2中的rfp信号虽有减弱，但是显著高于砧木1和接穗1的组合，说明砧木1和接穗2的亲和性不及砧木1和接穗1；砧木2中的gfp和接穗2中的rfp信号都显著减弱，说明砧木2和接穗2亲和性高；砧木2中的gfp和接穗1中的rfp信号也减弱，但是显著高于砧木2和接穗2的组合，说明砧木2和接穗1亲和性不及砧木2和接穗2。
带有arr5的荧光蛋白的变化情况：嫁接后9d，四个组合中砧木gfp和接穗rfp的表达量都显著增加，说明此时砧木和接穗中都在大量进行细胞分裂。之后到21d，砧木1中的gfp和接穗1中的rfp的信号强显示了砧木1和接穗1的亲和性较好；砧木1中的gfp和接穗2中的rfp信号弱，说明砧木1和接穗2的亲和性差；砧木2中的gfp和接穗2中的rfp的表达量逐渐增加，说明二者的亲和性好；砧木2中的gfp和接穗1中的rfp的表达量都低，说明二者亲和性差。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化，皆应属本发明的涵盖范围。
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