本发明属于生物医学
技术领域：
，具体涉及针对动脉粥样硬化炎症因子的一种联合检测动脉粥硬化的蛋白质芯片及其应用。
背景技术：
：炎症反应在动脉粥样硬化(AS)的发生、发展直至最后斑块表面破裂并发血栓形成的所有阶段均发挥了作用。众多的炎性因子可作为动脉粥样硬化性心血管疾病的重要危险因素预测因子。动脉粥样硬化斑块内的平滑肌细胞能分泌C反应蛋白，其与脂蛋白结合导致补体系统激活，释放大量炎症介质，损伤血管内膜，导致斑块不稳定，促进动脉粥样硬化斑块的发生和发展，但其为非特异性炎症因子。补体Clq分子具有促进吞噬和炎症反应的作用，在血中可与脂联素(adiponectin，APN)结合。研究发现，Clq与AS风险因素呈正相关，血清Clq和Clq-APN/Total-APN在ACS患者组显著高于对照组。血清Clq-APN/Total-APN在冠心病患者也明显升高，是重要的独立危险因素。另外大量研究表明，白细胞介素-6(interleukin，IL-6)作为自分泌递质参与了AS的形成，而且与同斑块的稳定性有关，是AS的一个独立的生物学标记物。检测患者IL-6水平可以一定程度反映病情的变化。IL-1β是一种促炎因子，也参与动脉粥样硬化的炎症反应，并随着动脉粥样硬化的程度加深其水平增高。对于上述因子的定性检测和定量检测，目前常用的检测方法包括酶联免疫法，放射免疫分析，免疫印记法等，但都分别显示出检测指标单一，放射性污染，灵敏度低等缺点。同时，膜对蛋白质的固定只是由于膜对蛋白质的吸附作用产生，固定力弱，经反复冲洗会导致脱落。用膜制成的蛋白质芯片的固相载体，信号弱且不均一。而且蛋白质点阵容易在反应过程中扩散，点阵密度较大时，易造成不同点的信号由于距离太近而相互影响。技术实现要素：本发明为了克服现有技术的上述不足，提供了一种联合检测动脉粥样硬化的蛋白质芯片，该芯片针对动脉粥样硬化的发生、发展直至最后斑块表面破裂并发血栓全过程所涉及到的多个炎性因子CRP、Clq、IL-6和IL-1β，设计了多种炎症因子的联合蛋白质芯片的检测方法，大大提高了对动脉粥样硬化检测的特异性和准确度。本发明的另一目的是提供一种联合检测动脉粥样硬化的蛋白质芯片的应用。为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：一种联合检测动脉粥样硬化的蛋白质芯片，包括：(1)固相载体基片，所述固相载体基片由常规固相载体、位于固相载体上方生物素标记的封闭物层、以及位于封闭物层上方的亲和素层构成；(2)若干特异性抗体，所述若干特异性抗体同时固定在固相载体基片上的，所述特异性抗体与动脉粥样硬化的蛋白质受体能够发生抗体-抗原反应，每种特异性抗体分别固定于所述固相载体形成若干个独立识别位点；(3)反应试剂，所述反应试剂包括检测抗体混合物，所述检测抗体混合物为所述若干特异性抗体的混合溶液，抗体混合物的特异性抗体标记有生物素。作为本发明的进一步方案，所述生物素选自生物素N-羟基丁二酰亚胺酯、长臂生物素中至少一种物质。作为本发明的进一步方案，所述亲和素选自卵白亲和素、链霉亲和素中至少一种物质。作为本发明的进一步方案，所述特异性抗体包括CRP，Clq，IL-6和IL-1β抗体。作为本发明的进一步方案，每个独立识别位点上固定有单一浓度的一种抗体。作为本发明的进一步方案，每种抗体至少以一种浓度分别固定于固相载体基片，每种抗体的单一浓度形成一个独立识别位点。作为本发明的进一步方案，所述每种特异性抗体所对应的独立识别位点在固相载体基片上所占的比例相同。作为本发明的进一步方案，所述反应试剂还包括用于识别生物素标记的抗生素蛋白链菌素，所述抗生物素蛋白链菌素标记有辣根过氧化物酶。作为本发明的进一步方案，所述固相载体选自玻璃片、塑料片、硝酸纤维膜和PDVF膜中的任一种。本发明还提供了联合检测动脉粥样硬化的蛋白质芯片的应用，所述蛋白质芯片应用于制备检测动脉粥样硬化的试剂盒。本发明的有益效果在于：1.本发明的技术方案针对动脉粥样硬化的发生、发展直至最后斑块表面破裂并发血栓全过程所涉及到的多个炎性因子人类C反应蛋白(CRP)、血清补体(Clq)、白细胞介素-6(IL-6)和白细胞介素-1β(IL-1β)，设计了多种炎症因子的联合蛋白质芯片的检测方法，大大提高了对动脉粥样硬化检测的特异性和准确度。2.本发明的蛋白质芯片的固相载体的表面结合有生物素标记的封闭物层和亲和素层时，不仅可显著降低蛋白质点样点的扩散作用，而且可提高检测灵敏度。具体实施方式展示一下实例来具体说明本发明的某些实施例，且不应解释为限制本发明的范围。对本发明公开的内容可以同时从材料、方法和反应条件进行改进，所有这些改进，均应落入本发明的的精神和范围之内。实施例1：一种联合检测动脉粥样硬化的蛋白质芯片的制备众多的炎性因子可作为动脉粥样硬化性心血管疾病的重要危险因素预测因子。为了检测样品中是否存在相应的炎症因子，从而预测动脉粥样硬化，制备固定有针对如下蛋白质的特异性抗体的蛋白质芯片，分别为人类C反应蛋白(CRP)、血清补体(Clq)、白细胞介素-6(IL-6)和白细胞介素-1β(IL-1β)。1.抗体的制备采用针对表1中所列蛋白质的特异性抗体、抗体的来源、浓度、及其针对的蛋白质名称均在表1中详细说明。表1特异性抗体所针对的抗原蛋白质名称、特异性抗体来源及浓度信息炎性因子厂商浓度人类C反应蛋白(CRP)raybiotech0.1ngto10ng/ml血清补体(Clq)raybiotech0.1ngto10ng/ml白细胞介素-6(IL-6)raybiotech0.1ngto10ng/ml白细胞介素-1β(IL-1β)raybiotech0.1ngto10ng/ml2.蛋白质芯片固相载体的制备选择Whatman公司生产的孔径0.4mm亲水性NC膜，用长臂生物素(BCNHS)化的2-10％、pH7.8的PBS脱酯奶粉缓冲液封闭，室温下封闭1-2小时或4℃过夜。PH7.8的PBS缓冲液洗涤3次，室温凉干；用0.5％的链霉亲和素溶液浸泡30分钟，晾干。3.点样将50-500nl的含0.5-100ng的特异性的抗体的Tris缓冲液(含有0.01-10g/100ml牛白蛋白)用全自动点样仪点于NC膜上，每阵列16(4×4)个样点，每个样点直径0.4mm，室温凉干。生物素标记的bovineIgG作为阳性对照。由于本实施例的底膜上分布有多个芯片点阵，根据实际情况，将点完样的NC膜放于设置若干方格的配套的方盒内，通过方盒之间的方格将每个芯片点阵划分为相互独立的反应区。4.晾干、保存将点样好的底膜置于方盒内并放于室温条件下静置5分钟到8分钟，于2℃到8℃保存备用。在本实施例中，全自动了点样仪采用Bio-Rad公司生产的产品；亲水性NC膜购自Whatman公司。在发明技术方案的上述步骤中，仪器和材料的采用并不局限于本实施例的列举，而是以能够解决本发明的技术问题，并实现相应的技术效果为依据。实施例2：用本发明的蛋白质芯片检测样品中炎性因子，从而预测预测动脉粥样硬化在本实施例中方盒设置有8个方格，通过方盒之间的方格将每个芯片点阵划分为相互独立的反应区，本实施例中采用的设置有8个方格的方盒由为申请人自制。1、加样称取7.5克脱脂奶粉，加入100mL磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)，混匀制成封闭液；向每个方格内加2毫升封闭液后放置于室温下培养30分钟，吸出每个方格中的封闭液，并用用磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)冲洗4次，晾干。将100微升～5毫升经封闭液稀释过的样品放入有膜的方格内，然后放在摇床上室温下摇动1至2小时，或者亦可在4℃下反应12-18小时。2、洗膜从方格内吸出样品，用1～5毫升磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)冲洗1次，之后放在摇床上室温摇动5分钟，再重复此清洗步骤两次。3、加入标记有生物素的抗体混合液向每个方格加入生物素标记的、混合有针对表1中所列抗原蛋白质的特异性抗体的混合液500微升～2毫升，然后放在摇床上室温摇动1至2小时。亦可在4℃下反应12-18小时。而后从方格内吸出标记有生物素的抗体混合液，重复步骤2的洗膜步骤。4、加入HRP-Streptavidin向每个方格加入500微升～2毫升稀释过的辣根过氧化物酶标记的抗生物素蛋白链菌素(HRP-Streptavidin)，然后放在摇床上室温条件下摇动1至2小时，亦可在4℃下反应12-18小时。而后从方格内吸出HRP-Streptavidin，重复步骤2的洗膜步骤。其中，HRP-Streptavidin购自BD公司实验前，需要用封闭液(7.5克脱脂奶粉溶于100mL磷酸盐缓冲液(pH＝7.4))进行20,000倍稀释。5、检测用镊子夹出底膜并置于垂直状态使多余的液体滴干，然后将膜放在清洁的塑料片上，使底膜固定有抗体的一面朝上，加入500微升沉淀型的四甲基联苯胺(TMB)显色液(购自BIOFX公司)到每张底膜上并在室温下显色放置2分钟，此过程必须确保发光液完全覆盖到整张膜；再用另一张干净的朔料片覆盖于底膜表面，小心地将朔料片中的气泡挤压出去，在将朔料片中的气泡挤压出去的过程中应当避免在膜上用力。上述步骤后，将底膜放在室温下5到10秒成像，拍摄时采用低温CCD，并采用相配套的UV扫描仪中读取数据。3.结果判断(1)若点样有某个炎性因子的位置显色，表明为阴性，则样品中不含有该项炎性因子；(2)若点样有某个炎性因子的位置不显色，表明为阳性，则样品中含有该项炎性因子。在本实施例中，生物素标记的bovineIgG作为阳性对照，其作用是识别膜的方向和比较不同膜的相对表达程度，以阳性对照为标准，通过比较信号的强弱，可以得到细胞素的相对表达程度高低，另外还可以通过测光密度技术可将信号的强弱数字化。在比较几张膜时，其结果可用阳性对照的数据标准化，而本发明蛋白质芯片的实验结果可用分析软件进一步分析，其功能不但可以编译和组织实验数据，而且能够减少在实验结果分析过程中复杂的计算和繁琐的操作。本实施例说明本发明的蛋白质芯片能够准确地检测出相应的炎症因子，而根据相同的原理和实验方法，对于其他与动脉粥样硬化相关的各类炎症因子，只要本发明的蛋白质芯片阵列存在其相对应的独立识别位点，既可以通过上述实验检测出来。本发明的技术方案针对动脉粥样硬化的发生、发展直至最后斑块表面破裂并发血栓全过程所涉及到的多个炎性因子人类C反应蛋白(CRP)、血清补体(Clq)、白细胞介素-6(IL-6)和白细胞介素-1β(IL-1β)，设计了多种炎症因子的联合蛋白质芯片的检测方法，大大提高了对动脉粥样硬化检测的特异性和准确度。应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。当前第1页1 2 3