一种测定香蕉果实中的离子浓度及流动方向的方法与流程

本发明属于植物生理学领域，具体涉及一种利用多功能非损伤微电极探测系统测定香蕉果实中的离子浓度及流动方向的方法。

背景技术：
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多功能非损伤微电极探测系统是一种扫描离子选择电极技术，可以在不损伤活体样品的情况下获得进出样品的各种离子或分子浓度、流速及其三维运动方向的信息。原理是通过微电极和微传感器获取离子和分子的信号，基于Nernst方程和Fick’s第一扩散定律计算离子和分子的浓度和流速，能够获得非常细微的信号，流速能够达到10^-12mol·cm^-2.s^-1(Smith P J S.Non-invasive ion probes—tools for measuring transmembrane ion flux.Nature,1995,378:645～646)。目前，多功能非损伤微电极探测系统可以测定H⁺、Ca²⁺、K⁺、NH4⁺、Al³⁺、Na⁺、Cd²⁺、NO3^-、Cl^-以及O2、CO2、NO等多种离子和分子，为获得生物样品离子和分子信息提供了良好的实验平台。所测样品可以是单个细胞、组织、器官甚至是完整的生物体。该技术具有非损伤性、长时间、多电极、高分辨率、高灵敏度、多角度测定等优点，可获得其它技术难以检测到的生理特征和生命活动规律，从而在理论研究和应用领域产生实质性的突破。

在植物生理研究领域，多功能非损伤微电极探测系统可以直接测定植物的离子流动，尤其是植物的根(Sun J,Chen S,Dai S,et al.,NaCl-induced alternations of cellular and tissue ion fluxes in roots of salt-resistant and salt-sensitive poplar species,Plant Physiol,2009,149:1141-1153)，通常用来测定根、叶等组织器官在胁迫条件尤其是盐胁迫条件下的离子流动变化(Zhao N,Wang S,Ma X,et al.,Extracellular ATP mediates cellular K⁺/Na⁺homeostasis in two contrasting poplar species under NaCl stress,Trees,2016,30:825-837)。此项技术目前在植物学研究领域内的应用非常有限，对于体积较大的植物组织或器官，例如香蕉以及其它果实等组织则难以利用此项技术探究其生理活动规律。事实上，香蕉在采摘以后会发生一系列生理生化及代谢活动，在此过程中细胞膜透性不断增加，通过细胞膜的离子浓度及流动方向也会发生相应变化，这种离子变化对于研究香蕉果实采后衰老及逆境胁迫发生机制具有重要意义，但是香蕉果皮切面离子流动浮动比较大，测定非常困难。因此急需开发一种利用多功能非损伤微电极探测系统测定果实中的离子浓度及流动方向的方法。

食品级润滑油是一种含有两种主要成分的多相润滑剂，它主要包含一种具有润滑特性的油和一种具有增稠效果的金属皂。

技术实现要素：
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本发明的目的是开发一种利用多功能非损伤微电极探测系统测定果实中的离子浓度及流动方向的方法，利用该方法可以测定香蕉果实中的H⁺和Ca²⁺浓度及流动方向，这对研究香蕉果实采后衰老、胁迫响应及其发生机制具有重要意义。

本发明的利用多功能非损伤微电极探测系统测定香蕉果实中的离子浓度及流动方向的方法，其特征在于，至少在香蕉果实切片的切面涂抹一层食品级润滑油，然后用多功能非损伤微电极探测系统测定香蕉果实切片中的离子浓度及流动方向。

所述的香蕉果实为香蕉果皮。

所述的用多功能非损伤微电极探测系统测定香蕉果实切片中的离子浓度及流动方向是用多功能非损伤微电极探测系统测定香蕉果皮切片切面的H⁺和Ca²⁺浓度及流动方向。

所述的一层食品级润滑油，其厚度优选为1-2mm。

所述的香蕉果皮切片是从香蕉果皮切取一个长方体，然后再使用食品级润滑油涂抹此长方体的切面。

优选，所述的长方体，其体积是0.2～1cm³。

本发明发现，食品级润滑油可以阻止香蕉果皮切面离子流动，使多功能非损伤微电极探测系统测定香蕉果实中的离子浓度及流动方向成为可能。

本发明的有益效果是：

本发明提出的一种利用多功能非损伤微电极探测系统测定香蕉果实中H⁺和Ca²⁺浓度及流动方向的方法，按照本发明提出的使用食品级润滑油涂抹香蕉果皮切片切面的方法，能够使切面的H⁺和Ca²⁺浓度浮动在0pmol/(cm².s)，即食品润滑油可以完全阻止香蕉果皮切片切面的离子流动，因此，可以利用多功能非损伤微电极探测系统测定香蕉果实中的H⁺和Ca²⁺浓度及流动方向，这对研究香蕉果实采后衰老、胁迫响应及其发生机制具有重要意义。

附图说明：

图1是实施例1香蕉果皮H⁺和Ca²⁺的测定过程(A，香蕉果皮切片在培养皿中的放置图；B，测定过程中电极放置的俯视图和侧视图；C，实际测定过程图；D，Ca²⁺电极的校准曲线；E，H⁺电极的校准曲线)；

图2是实施例1中涂抹有食品级润滑油的香蕉果皮切片切面的H⁺浓度随时间变化图；

图3是实施例1中涂抹有食品级润滑油的香蕉果皮切片切面的Ca²⁺浓度随时间变化图；

图4是实施例1中香蕉果皮切片切面的H⁺浓度随时间变化图(未涂抹食品级润滑油的对照)；

图5是实施例1中香蕉果皮切片切面的Ca²⁺浓度随时间变化图(未涂抹食品级润滑油的对照)。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：多功能非损伤微电极测试系统测定香蕉果实中的H⁺和Ca²⁺浓度及流动方向

1、材料：

香蕉：采摘后的青色成熟香蕉。

PBS溶液：经过灭菌过滤的PBS溶液(pH 7.2-7.4)。

食品级润滑油：德国产。

培养皿：直径35mm，深度10mm。

玻璃电极：长度为10cm，WPI,Inc.,Sarasota,FL,USA。

H⁺，Ca²⁺离子交换液：St.Louis,MO,USA

2、设备：

玻璃电极拉制仪：Sutter Instrument Company,Novato,CA,USA

IPA-2(离子/极谱-2通道)放大器：Applicable Electronics,Inc.

多功能非损伤微电极探测系统：Applicable Electronics,Inc.

3、处理方式：

香蕉：随机挑选三根大小、颜色一致的香蕉，切取1.0cm×0.5cm×0.5cm的果皮切片，用超纯水清洗切面三次，2min/次。用吸水纸将切面水分吸干后，在切面处均匀地涂抹一层食品级润滑油，涂抹厚度约为1mm。将果皮切片放在小培养皿中，用胶带在中央固定住，分别浸没在含有0.1μM H⁺的0.01M PBS溶液(pH 7.2-7.4)和含有0.1mM Ca²⁺的0.01M PBS溶液(pH 7.2-7.4)中。将培养皿放置在倒置显微镜下，在视野中找到清晰的切片边缘，使用3D的机械臂和电脑键盘调整微电极使其靠近果皮切片边缘，开始测定，步进距离为30μm。

离子选择电极：取一根拉好的玻璃微移液管(a)，剪断最尖端的部分，只保留大约50–100μm(直径)的尖端。沾取少量待测离子的LIX离子交换液，把玻璃微移液管(a)连接到螺杆式压力调节器上，并放在夹具(holder)上，在视野中找到清晰的图像，在断面尖端灌充LIX离子交换液。用一支20mL注射器(链接有0.2μm过滤盘和2英寸的针头)给另一根玻璃微移液管(b，即玻璃微电极)灌充电解液(不同待测离子的电解液配制方法不同)。在玻璃微电极中灌充约其管长一半的电解液。通过连接着小软管的双向阀把微电极和20mL注射器连接起来，小心地让电极尖端接触到LIX弯液面，轻微释放注射器压力使得LIX液柱虹吸到玻璃微电极(b)至25μm(一小格＝5μm)，调节3D机械臂使玻璃微电极(b)离开液面。小心地把离子选择电极从夹具上取下来。用一根干净的纯银丝作为电极，夹在9V DC电池的(-)负极。准备氯化的银丝插入玻璃电极液面中，夹在9V电池的(+)正极，连通电池几秒钟的时间(小于10秒)直到银丝变灰色，将电镀好的银丝插入填充好离子交换液的玻璃电极中，安装在机械臂上。参比电极选用Dri-Ref(WPI；cat#DRIREF-2)。

离子选择电极校准：采用三点校准法校准，若测定对象为H⁺，则将离子电极和参比电极依次放入pH7、pH6和pH5校准液中；若测定对象为Ca²⁺，则将离子电极和参比电极分别放入0.1mMCaCl2、1mMCaCl2和10mMCaCl2中。启动计算机进入Windows操作环境，点击ASET图标，选择单个或双探针，设置文件名，在顶部的菜单栏点击“MODE”(Sensor Name 1)，点击“MODE”中的选项(或者创建将使用的类型，如：钙)，然后点击continue。跳转至“Calibration”，按电极在校准液pH7的电压读数稳定后，点击Acquire按钮，接着依次是pH6和pH 5，最后Slope值约为57±3mV；若测定对象为Ca²⁺，方法同H⁺，最后的Slope值约为57/2(26～28)mV。

以未涂抹食品级润滑油的香蕉切片作为对照，按与上述涂抹一层食品级润滑油的香蕉切片相同的方法处理。

4、实验结果及分析

如图1D所示，Ca²⁺电极校准的斜率是28，符合Nernst方程，说明实验所制备的Ca²⁺电极符合测定要求。

如图1E所示，H⁺电极校准的斜率是57，符合Nernst方程，说明实验所制备的H⁺电极符合测定要求。

如图2所示，香蕉果皮切片切面的H⁺浓度浮动在0pmol/(cm².sec)，说明实验过程中使用的食品级润滑油，可以完全阻止香蕉果皮切片切面H⁺外渗，因此，利用多功能非损伤微电极测试系统测定香蕉果实H⁺浓度和流动方向的方法是可行的。

如图3所示，香蕉果皮切片切面的Ca²⁺浓度浮动在0pmol/(cm².sec)，说明实验过程中使用的食品级润滑油，可以完全阻止香蕉果皮切片切面的Ca²⁺外渗，因此，利用多功能非损伤微电极测试系统测定香蕉果实Ca²⁺浓度和流动方向的方法是可行的。

如图4、图5所示，未涂抹食品级润滑油的香蕉果皮切片切面的H⁺和Ca²⁺有明显外渗和泄漏，并且其浓度变化毫无规律，无法用于香蕉果实H⁺和Ca²⁺浓度和流动方向的测定。