一种利用血红素/伴侣素人工酶检测溶液中物质含量的应用的制作方法

本发明属于生物酶检测
技术领域：
，涉及一种利用血红素/伴侣素人工酶检测溶液中物质含量的应用，尤其涉及一种利用血红素/伴侣素人工酶以邻苯二胺为底物，通过与过氧化氢反应来检测溶液中物质含量的应用。
背景技术：
：过氧化氢酶在自然界中广泛分布，使用铁(III)卟啉IX(血红素)作为氧化还原辅因子，其在常温常压下在氧化大量底物时表现出优秀的催化能力，尤其在需要温和条件下的清洁氧化的领域。在过氧化氢酶发生催化过程中，活性位点血红素中铁是一种环境友好型金属，反应符合当下绿色化学的理念。另一方面，天然过氧化氢酶的一些缺陷限制了它们广泛的应用，比如在制备中容易失活，或是温度升高，操作稳定性低，恢复困难等。因此，对具有改善的稳定性和活性或者针对特定功能的新的有效的过氧化氢酶模拟物的探索表现出显著兴趣。在化学合成材料的帮助下，在这个方向上取得了一定程度的成功，包括但不限于基于金属氧化物的纳米材料，石墨烯氧化物纳米薄片，贵金属纳米粒子，所有这些都被证明具有内在的类过氧化物酶活性。带有催化活性血红素的重组蛋白骨架的功能化提供了另一种新的杂交过氧化物酶类。在这方面研究天然纳米蛋白笼的利用特别有趣，这是由生物建立的用来定位和驱使特定的化学过程。这些自然发生的纳米材料在结构和形态上的变化，本质上是单一的，具有精确的体系结构，这些都是纯粹的合成替代品所无法达到的。它们在环境友好的可持续催化或纳米反应器的设计上构成了一个越来越大的研究领域，这将对反应动力学产生独特的影响或带来产品的独特特性。将这些生物材料应用在化学分析中，其性能也得到了有效提升。技术实现要素：本发明提出一种利用血红素/伴侣素人工酶检测溶液中物质含量的应用，该血红素/伴侣素人工酶相对天然血红素酶具有更多的活性位点及更大的反应容器，可高效用于污水监测及生物诊断应用中。为了达到上述目的，本发明提供了一种利用血红素/伴侣素人工酶通过与过氧化氢反应检测溶液中物质含量的应用。作为优选，血红素/伴侣素人工酶以邻苯二胺为底物，通过与溶液中的过氧化氢反应直接检测溶液中过氧化氢的含量。作为优选，所述检测步骤包括：将2mM邻苯二胺溶液和20μM血红素/伴侣素人工酶溶液以及含1-750μM过氧化氢溶液等体积混合，得到混合液Ⅰ；将所得混合液Ⅰ置于37℃水浴锅中孵育30min；向孵育后的混合液中加入3.5μM硫酸终止反应，得到混合液Ⅱ；测量混合液Ⅱ于492nm处的吸光度；制备所得吸光度与过氧化氢浓度的标准曲线，计算过氧化氢的含量。作为优选，所述过氧化氢含量的线性范围为10-90μM，检测限为7μM。作为优选，所述溶液为工业污水或市政污水。作为优选，血红素/伴侣素人工酶以邻苯二胺为底物，通过与葡萄糖溶液中的过氧化氢反应间接检测葡萄糖溶液中葡萄糖的含量。作为优选，所述检测步骤包括：将5μl200units/mL葡萄糖氧化酶和50μL0.1-1.8mM葡萄糖溶液混合，得到混合液Ⅲ；将所得混合液Ⅲ置于37℃水浴锅中孵育30min；向孵育后的混合液中加入等体积2mM邻苯二胺和20μM血红素/伴侣素人工酶，得到混合液Ⅳ；将所得混合液Ⅳ置于37℃水浴锅中孵育30min；向孵育后的混合液中加入3.5μM硫酸终止反应，得到混合液Ⅴ；测量混合液Ⅴ于492nm处的吸光度；制备所得吸光度和葡萄糖浓度的标准曲线，计算葡萄糖的量。作为优选，所述葡萄糖的线性范围为15μM-200μM，检测限为11μM。作为优选，所述血红素/伴侣素人工酶具有直径为4.5nm的纳米空腔，且所述纳米空腔中同时含有多个血红素活性位点。与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：本发明所提供的血红素/伴侣素人工酶具有直径约为4.5nm的纳米空腔，相对天然血红素酶而言，具有更多的活性位点，可构建作为多活性位点的纳米反应容器，提供足够的反应空间供底物进入空腔中进行催化氧化反应。此外，该血红素/伴侣素人工酶相对于现有的无机材料而言，属于环境友好性材料，环境污染小，易处理，其反应在常温常压水相中进行，副产物少，利用其进行相关化学反应的分析，符合绿色化学的概念。进一步，血红素和伴侣素价格便宜，由其经简单透析法得到的血红素/伴侣素也价格合理，具有大规模生产的优势。附图说明图1是本发明所提供的血红素/伴侣素人工酶的透射电子显微镜图片(左侧TEM图)，并与伴侣素结晶结构进行比较(右侧数据来源于蛋白数据库1SS8)；图2是本发明制备的血红素/伴侣素人工酶在2mM邻苯二胺溶液中混合过氧化氢的剂量反应曲线及颜色趋势图；图3是本发明制备的血红素/伴侣素人工酶在2mM邻苯二胺溶液中不断添加葡萄糖的剂量反应曲线。具体实施方式下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明实施例提供了一种利用血红素/伴侣素人工酶通过与过氧化氢反应检测溶液中物质含量的应用。具体的，在上述反应中，在血红素/伴侣素人工酶存在的条件下，以邻苯二胺为底物，通过与过氧化氢进行反应，可生成一种水溶性终产物，该产物为橙色并在450nm处有特征吸收峰，通过加入3M硫酸溶液终止OPD反应，通过读取492nm处的吸收峰，可计算得到相应物质的含量。在一可选实施例中，血红素/伴侣素人工酶以邻苯二胺为底物，通过与溶液中的过氧化氢反应直接检测溶液中过氧化氢的含量。具体的，所述检测步骤包括：将2mM邻苯二胺溶液和20μM血红素/伴侣素人工酶溶液以及含1-750μM过氧化氢溶液等体积混合，得到混合液Ⅰ；将所得混合液Ⅰ置于37℃水浴锅中孵育30min；向孵育后的混合液中加入3.5μM硫酸终止反应，得到混合液Ⅱ；测量混合液Ⅱ于492nm处的吸光度；制备所得吸光度与过氧化氢浓度的标准曲线，计算过氧化氢的含量。在一可选实施例中，血红素/伴侣素人工酶以邻苯二胺为底物，通过与葡萄糖溶液中的过氧化氢反应间接检测葡萄糖溶液中葡萄糖的含量。由于葡萄糖氧化酶可催化葡萄糖生成过氧化氢和葡萄糖酸，因此，其也可参与OPD反应来计算得到相关物质的量。在一具体应用中，该方法可用于检测血清中的葡萄糖含量。具体的，所述检测步骤包括：将5μl200units/mL葡萄糖氧化酶和50μL0.1-1.8mM葡萄糖溶液混合，得到混合液Ⅲ；将所得混合液Ⅲ置于37℃水浴锅中孵育30min；向孵育后的混合液中加入等体积2mM邻苯二胺和20μM血红素/伴侣素人工酶，得到混合液Ⅳ；将所得混合液Ⅳ置于37℃水浴锅中孵育30min；向孵育后的混合液中加入3.5μM硫酸终止反应，得到混合液Ⅴ；测量混合液Ⅴ于492nm处的吸光度；制备所得吸光度和葡萄糖浓度的标准曲线，计算葡萄糖的量。在一可选实施例中，所述血红素/伴侣素人工酶具有直径为4.5nm的纳米空腔。该血红素/伴侣素人工酶具有直径约为4.5nm的纳米空腔，相对天然血红素酶而言，具有更多的血红素活性位点，可构建作为多活性位点的纳米反应容器，提供足够的反应空间供底物进入空腔中进行催化氧化反应，高效用于污水监测及生物诊断应用中。为了更清楚详细地介绍本发明实施例所提供的利用血红素/伴侣素人工酶通过与过氧化氢反应检测溶液中物质含量的应用，下面将结合具体实施例进行描述。实施例1血红素/伴侣素人工酶的制备将1mM血红素分散到含1.5mMTritonX-100的20mM氢氧化钠去离子水中，得到1mM血红素胶束母液；将血红素胶束母液稀释100μM，将其和1μM伴侣素溶液等体积混合，得到混合液(1)；将混合液(1)装入50kDa透析袋中，放入缓冲液透析48小时，得到血红素/伴侣素人工酶；将血红素/伴侣素人工酶定量，血红素浓度为20μM。如图1所示，左侧TEM图为本实施例所制备的血红素/伴侣素人工酶的透射电子显微镜图片，与伴侣素结晶结构进行比较(右侧数据来源于蛋白数据库1SS8)，从图中可以看出该人工酶具有直径为4.5nm左右的中间空腔，其可作为纳米反应器，同时，该人工酶可结合多个活性位点，构建成多活性位点的纳米反应器，从供底物进入空腔中进行催化氧化反应。实施例2血红素/伴侣素人工酶检测过氧化氢溶液中过氧化氢的含量将2mM邻苯二胺溶液和20μM血红素/伴侣素人工酶溶液以及1-750μM过氧化氢溶液等体积混合，得到混合液Ⅰ；将所得混合液Ⅰ置于37℃水浴锅中孵育30min；将孵育后的混合液中加入3.5μM硫酸终止反应，得到混合液Ⅱ；测量混合液Ⅱ于492nm处的吸光度；将混合液Ⅱ的吸光度和过氧化氢浓度制备标准曲线，计算过氧化氢的量。如图2所示，加入不同浓度的过氧化氢之后，血红素/伴侣素人工酶具有很好的灵敏度，说明此人工酶对过氧化氢有很好的催化效果，可作为过氧化氢的检测酶使用。从图2中可以看出，线性变化曲线取得10-90μM，检测确定范围7μM。线性回归方程为A＝0.1104+0.0025CH2O2，相关系数为0.99554。同时，溶液的颜色变化很明显，肉眼可以观察到(如图2左上侧所示)。实施例3血红素/伴侣素人工酶检测葡萄糖溶液中葡萄糖的含量将5μl葡萄糖氧化酶(200units/mL)和50μL葡萄糖溶液(0-1.8mM)混合，水浴锅中37℃孵育30min；向孵育后的混合液中加入等体积2mM邻苯二胺和20μM血红素/伴侣素人工酶，37℃水浴锅中孵育30min；向孵育后的溶液中再加入3.5μM硫酸终止反应；测量混合液于492nm处的吸光度；将吸光度和葡萄糖浓度制备标准曲线，计算葡萄糖的量。如图3所示，在硫酸淬灭反应后492nm处的吸光度表现出典型的葡萄糖浓度响应曲线。葡萄糖检测的线性范围为15μM-200μM(相关系数为0.99768)，检测限制为11μM。实施例4污水中过氧化氢含量的检测取工业污水稀释3000倍，然后进行过氧化氢检测；将2mM邻苯二胺溶液和20μM血红素/伴侣素人工酶溶液以及稀释后的工业污水等体积混合，得到混合液；将混合液放入37℃水浴锅中孵育30min；向孵育后的混合液中加入3.5μM硫酸终止反应；测量终止反应后的混合液于492nm处的吸光度；将吸光度和过氧化氢浓度标准曲线对比，计算过氧化氢的量，见表1。表1过氧化氢的含量测定样品吸光度(Abs)浓度(μM)10.28971.4420.28168.2430.29774.64由表1可知，本申请所提供的血红素/伴侣素人工酶对过氧化氢具有很好的催化效果，可有效作为过氧化氢的检测酶进行使用。当前第1页1 2 3