本发明属于血液游离核酸标志物检测方法与
技术领域：
：，更具体地，涉及一种利用SOL技术和化学发光技术对血清miRNA标志物进行定量检测的方法。
背景技术：
：：miRNA(microRNA)是一类内源性、长19至24个核苷酸的非编码单链RNA分子。它主要通过碱基互补配对与指导蛋白质合成的信使RNA(messagerRNA，mRNA)相结合，导致其翻译受阻或降解，从而参与调控个体发育、细胞凋亡、增殖及分化等生命。由于超过半数的miRNA在基因组上定位于与肿瘤相关的脆弱位点，故异常表达的miRNA与多种肿瘤的发生，分期，转移和复发有着密切关系。由于miRNA在不同肿瘤中有其特定的表达模式，因此目前有很多研究将miRNA用于肿瘤的诊断和预后监测的分子标志物、治疗靶标及疾病分型的标志物。人体不同组织与细胞产生的miRNA通过与脂蛋白结合或集中于外泌体等细胞外囊泡内的两种方式进入血液。这两种方式保证了血液中的miRNA不受温度、酸碱度、以及核酸酶的影响，在外周血中稳定存在。这使得通过检测血清/血浆/全血中的miRNA标志物成为当下研究肿瘤的热点。例如：Chen等(DavorenPA,McNeillRE,LoweryAJ,etal.IdentificationofsuitableendogenouscontrolgenesformicroRNAgeneexpressionanalysisinhumanbreastcancer.[J].BMCMolBiol,2008,9(1):76)利用PCR技术检测了临床血清样本中的91种miRNA，分析比较后筛选出其中10种miRNA(miR-20a,miR-24,miR-25,miR-145,miR-152,miR-199a-5p,miR-221,miR-222,miR-223,miR-320)作为早期诊断非小细胞肺癌的生物标志物，其灵敏度和特异性达到96.6％和97.2％。越来越多的实验证据表明，miRNA在肿瘤诊断中有较高的灵敏度与特异性，可以作为肿瘤早期诊断的生物标志物。但是，一般的荧光定量PCR技术仍然具有一些固有的缺陷，其中主要的缺点是：1、需要提取样本中的总miRNA；2、需要对提取的miRNA进行逆转录；3、由于miRNA的序列较短，需要用polyA加尾法或茎环结构的探针进行检测，增加了实验的成本和难度；4、检测时需要对目标miRNA进行扩增，难以满足临床检测的需要。因此，开发一种灵敏度高、特异性强，且能满足临床检测需求的新型miRNA检测技术具有重要的研究意义和应用价值。技术实现要素：本发明的目的在于克服现有荧光定量PCR技术操作复杂，无法满足临床检测需求的缺陷，提供一种利用SOL技术和化学发光技术对血清miRNA标志物进行定量检测的方法。本发明提供的方法无需提取血清中的miRNA，通过多次清洗可去除错配和部分互补的miRNA，提高定量检测方法的检测特异性；另外，使用化学发光技术放大目标miRNA的信号值，故无需扩增目标miRNA；灵敏度高、特异性强，可满足临床检测需求。为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：一种利用SOL技术和化学发光技术对血清miRNA标志物进行定量检测的方法，所述方法包括如下步骤：S1：对临床采集的血清样本进行预处理使其中miRNA游离，得血清样品预处理溶液，备用；S2：向酶标板中加入捕获序列溶液，震荡，混合均匀后于25～40℃震荡，将捕获序列固定在酶标板上，弃去溶液，除去多余未反应的捕获序列；所述捕获序列为NH2-(CH2)12-GTTGTAAATTGTAGTAAAGAAGTA；所述酶标板含有可与-NH2反应的基团；S3：将S1中的血清样品预处理溶液、核酸探针a溶液和核酸探针b溶液加入至S2的酶标板中，震荡，混合均匀后，于40～50℃静置条件下杂交15～21h，弃去滤液，清洗至少3次；所述核酸探针a为：CAAACAAACATTCAAATATCAATC-与miRNA一半序列互补区域；所述核酸探针b为：与目标miRNA另一半序列互补区域-TACTTCTTTACTACAATTTACAAC；S4：将信号放大序列溶液加入至S3得到的酶标板中，混合均匀后，于40～50℃静置条件下杂交不低于2h，将信号放大序列与核酸探针b杂交；所述信号放大序列为：GATTGATATTTGAATGTTTGTTG，所述信号放大序列上修饰一个或多个生物素；S5：向S4得到的酶标板中加入可与生物素反应的亲和素-过氧化物酶融合蛋白溶液，震荡混合均匀后，通过生物素-亲和素反应将亲和素-过氧化物酶融合蛋白杂交在所述信号放大序列上；S6：向酶标板上加入可与过氧化物酶反应的化学发光底物进行化学发光检测，通过标准曲线即可得到miRNA的含量。传统的PCR技术需要先提取血清样本中的总RNA。但是，在总RNA提取步骤中一般会产生miRNA的损失。这需要先进行大量的核酸提取的步骤，延长了检测时间并增加了检测的工作量；并且还可能导致某些种类miRNA的检测结果不准确。本发明通过对血液样品进行预处理得到游离态的miRNA来测定其含量，避免了提取总RNA所带来的损失，大大缩短了检测时间和工作量；然后，利用SOL技术(短核苷酸链连接技术)，将捕获序列固定在酶标板上，并通过核酸探针a和b与目标miRNA杂交，且目标miRNA与探针之间只能产生比较弱的结合，若当中出现错配和部分互补的情况，目标miRNA与探针之间的结合作用就会进一步降低，此时，通过多次清洗就可以去除去除错配和部分互补的miRNA，大大提高了检测特异性；再利用信号放大序列和化学发光技术对miRNA含量进行检测，灵敏度高，特异性强，可满足临床检测需求。本领域常用的预处理得到游离的miRNA的方法均可用于本发明中。优选地，S1中预处理为：将血液样品溶液与血清预处理液混合，于25～100℃下震荡反应60～120min；所述血清预处理液为Tween20/TE缓冲液与ProteinaseK的混合溶液，所述血清处理液与血清样品溶液的体积比不小于1:1。ProteinaseK可降解血清中的蛋白，Tween20可破坏细胞中的囊泡，通过两者的配合作用，可得到游离的miRNA。通过该方法得到的包含有游离的miRNA的血清样品溶液即可立马进行后续操作，也可存放于-80℃下冷冻保存。优选地，所述TE缓冲液的pH为8.0；所述血清预处理液中Tween20的质量浓度不低于为1％；所述ProteinaseK的浓度不低于为200μg/ml。优选地，所述捕获序列通过酰胺反应固定在酶标板上。更为优选地，S2中的酶标板为马来酸酐化酶标板。马来酸酐化酶标板可与捕获序列中的-NH2反应，从而使得捕获序列固定在酶标板上。优选地，所述酶标板为96孔酶标板。优选地，所述捕获序列溶液为捕获序列PBS缓冲溶液，所述捕获序列的浓度不低于1nM。捕获序列不低于1nM时可保证捕获序列是过量的，从而尽可能多的固定在酶标板上。优选地，S3中核酸探针a溶液为核酸探针aTE缓冲液，核酸探针b溶液为核酸探针bTE缓冲液；所述缓冲液的pH为7～8，所述核酸探针a和b的浓度均不低于1nM。优选地，S3中杂交时间为21h。本领域常用的生物素均可通过常规的杂交方法杂交在信号放大序列上。优选地，S4中信号放大序列上修饰的生物素的数量为1～4个。优选地，S5中的亲和素-过氧化物酶融合蛋白为联霉亲和素-辣根过氧化物酶融合蛋白或亲和素-辣根过氧化物酶融合蛋白。优选地，S5中杂交温度为25～40℃，时间为不低于30min。本领域常用的化学发光底物也可用于本发明中。优选地，S6中化学发光底物为鲁米诺、异鲁米诺及其衍生物类与双氧水溶液中的一种或几种。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明提供的利用SOL技术和化学发光技术对血清miRNA标志物进行定量检测的方法无需提取血清中的miRNA，通过多次清洗可去除核酸探针a、b与目标miRNA杂交中发生的错配与不完全互补，提高了定量检测方法的检测特异性；使用化学发光技术放大目标miRNA的信号值，故无需扩增目标miRNA；灵敏度高、特异性强，可满足临床检测需求。附图说明图1为本发明提供的方法的流程原理图；图2为SOL技术(短核苷酸链连接技术)的作用机制图；图3为实施例1～2提供的方法检测的血清miRNA的化学发光强度图；图4为实施例2～4提供的方法中核酸探针a和b、目标miRNA(miR-16)、捕获序列与信号放大序列核酸杂交琼脂糖凝胶电泳图；图5为实施例2、5和对照例1～2的提供的方法检测的血清miRNA的化学发光强度图；图6为实施例2、6～8提供的方法检测的血清miRNA的化学发光强度图；图7为化学发光检测值与miR‐16浓度之间的线性关系(从10fM至50pM)图；图8为化学发光检测体系的选择性测试图。具体实施方式下面结合实施例进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下例实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域常规条件或按照制造厂商建议的条件；所使用的原料，试剂等，如无特殊说明，均为可从常规市场等商业途径得到的原料和试剂。本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。实施例1～8本实施例1～8提供了一种利用SOL技术和化学发光技术对血清miRNA标志物进行定量检测的方法。如图1所示，方法如下：(1)血清样本的预处理Tween20(10％)溶液用TE缓冲液(pH8.0)稀释至终浓度为1％，再加入ProteinaseK至终浓度为200μg/ml，配置为血清处理液。血清样本解冻后，涡旋混匀5到10次。配置好的处理液与血清样本分别置于恒温混匀仪内在37℃轻微震荡混匀30分钟。血清样本与处理液以体积比1:1混合，在60℃以300rpm的速度震荡反应60～90分钟。处理完成后的血清溶液应立即进行下一步的反应，或存储于–80℃冰箱。(2)酰胺反应连接捕获序列于96孔酶标板将10XPBS缓冲液用DEPC处理水稀释为1XPBS缓冲液。用1XPBS缓冲液200μl清洗马来酸酐化酶标板中的每孔3次。将捕获序列溶解于1XPBS缓冲液中至终浓度为1nM，然后取100μl加入酶标板中的每孔。加入捕获序列溶液的酶标板放置于恒温混匀仪内在37℃轻微震荡过夜。弃去过夜后96孔酶标板内的溶液，每孔加入SuperBlockBlockingBuffer200μl，在室温中(25℃)轻微震荡1小时。Tween20(10％)溶液用1XPBS缓冲液稀释至终浓度为0.05％，配置为洗液。弃去每孔中的溶液，用洗液清洗三遍；用滤纸盖住96孔板，翻转后轻轻敲打致酶标板每孔中的溶液完全流出，用多孔板封板膜完全覆盖酶标板表面，放入4℃冰箱保存，随用随取。捕获序列为NH2-(CH2)12-GTTGTAAATTGTAGTAAAGAAGTA。(3)核酸杂交连接血清中的目标miRNA与核酸探针a和b将上一步处理好的酶标板从冰箱中拿出，放置于37℃环境。将核酸探针a和核酸探针b溶于TE缓冲液(pH8.0)至两者的终浓度不小于1nM。将处理好的血清溶液在每孔加入90μl，再加入配制好的核酸探针a与核酸探针b溶液各5μl，放置于恒温混匀仪内在37℃轻微震荡10min；混合均匀后，停止震荡，用多孔板封板膜完全覆盖酶标板表面，升温至40～50℃，杂交15～21h。核酸探针a为：CAAACAAACATTCAAATATCAATC-与目标miRNA一半序列互补区域；核酸探针b为：与目标miRNA另一半序列互补区域-TACTTCTTTACTACAATTTACAAC。如下表为本实施例中针对不同的miRNA所对应的核酸探针a和b，此表仅为例举，根据miRNA的种类不同，可以选择相应的核酸探针。表1核酸探针a和bmiR-16核酸探针aCAAACAAACATTCAAATATCAATCCGCCAATATTTmiR-16核酸探针bACGTGCTGCTATACTTCTTTACTACAATTTACAACmiR-21核酸探针aCAAACAAACATTCAAATATCAATCTCAACATCAGTmiR-21核酸探针bCTGATAAGCTATACTTCTTTACTACAATTTACAAClet-7a核酸探针aCAAACAAACATTCAAATATCAATCAACTATACAAClet-7a核酸探针bCTACTACCTCATACTTCTTTACTACAATTTACAAC(4)核酸杂交连接信号放大序列与DNA-RNA杂合探针将信号放大序列溶于TE缓冲液(pH8.0)至终浓度为1nM。将上一步反应完后的酶标板弃去每孔中的溶液，用洗液清洗三遍，用滤纸盖住96孔板，翻转后轻轻敲打致酶标板每孔中的溶液完全流出。酶标板每孔中加入信号放大序列溶液100μl，放置于恒温混匀仪内在37℃轻微震荡10分钟；混合均匀后，停止震荡，用多孔板封板膜完全覆盖酶标板表面，升温至40～50℃，杂交2小时。本发明所用的信号放大序列通过常规方法修饰有生物素，修饰的生物素可以多个，下表2是含1～4个修饰的生物素的信号放大序列。表2含1～4个修饰的生物素的信号放大序列(5)利用链霉亲和素-生物素反应联接联霉亲和素-辣根过氧化物酶融合蛋白于信号放大序列上将SA-Poly-HRP(联霉亲和素-辣根过氧化物酶融合蛋白)用其专用的Poly-HRPStreptavidinandDilutionBuffer以1:2500的比例稀释。将上步杂交信号放大序列的酶标板弃去每孔中的溶液，用洗液清洗三遍，用滤纸盖住96孔板，翻转后轻轻敲打致酶标板每孔中的溶液完全流出。酶标板每孔加入稀释后的SA-Poly-HRP溶液100μl，放置于恒温混匀仪内在37℃轻微震荡10分钟；混合均匀后，停止震荡，用多孔板封板膜完全覆盖酶标板表面，保持在37℃，反应30分钟。(6)加入化学发光底物并检测信号将SuperSignalWestPicoChemiluminescentSubstrate(化学发光底物溶液)其中的一瓶SuperSignalWestPicoLuminol/Enhancer溶液与另一瓶SuperSignalWestPicoStablePeroxide溶液以1:1的比例混合成工作液，工作液仅在室温中保持稳定8小时。同时，将上一步处理后的酶标板弃去每孔中的溶液，用洗液清洗三遍，用滤纸盖住96孔板，翻转后轻轻敲打致酶标板每孔中的溶液完全流出。酶标板每孔加入工作液100μl，用多孔板封板膜完全覆盖酶标板表面，放置于室温中5min；揭去多孔板封板膜，放置于多功能酶标仪内检测其荧光强度，积分时间为500ms，在15min内检测完毕。各实施例的条件如下表3所示。对照例1～3对照例1～3提供了不同条件的定量检测的方法。如表3所示，对照例1和2中步骤(4)的杂交时间不同，分别为3h和9h，其余均与实施例2一致。表3实施例1～8和对照例1～2的条件本实施例和对照例中所使用的miRNA如下表4所示。表4miRNA序列表miR-16rUrArGrCrArGrCrArCrGrUrArArArUrArUrUrGrGrCrGmiR-21rUrArGrCrUrUrArUrCrArGrArCrUrGrArUrGrUrUrGrAlet-7arUrGrArGrGrUrArGrUrArGrGrUrUrGrUrArUrArGrUrUlet-7brUrGrArGrGrUrArGrUrArGrGrUrUrGrUrGrUrGrGrUrUlet-7crUrGrArGrGrUrArGrUrArGrGrUrUrGrUrArUrGrGrUrUlet-7drArGrArGrGrUrArGrUrArGrGrUrUrGrCrArUrArGrUrUlet-7erUrGrArGrGrUrArGrGrArGrGrUrUrGrUrArUrArGrUrUlet-7frUrGrArGrGrUrArGrUrArGrArUrUrGrUrArUrArGrUrU如图3所示，为实施例1～2提供的方法检测的血清miRNA的化学发光强度图。从图中可以看出，随着可知，随着处理时间的延长，化学发光检测值也随之增强，其原因是血清样本经处理后游离的miRNA增多；而90min(41058±643AU)与60min(37619±1605AU)之间的差异(3439AU)较小，证明经过60min至90min的处理时间，血清样本中的大部分miRNA已经游离出来。为了缩短检测时间并降低miRNA因为处理时间过长而导致的降解，我们将血清样本的检测时间优选为为90min。如图4所示，为实施例2～4提供的方法中核酸探针a和b、目标miRNA(miR-16)、捕获序列与信号放大序列核酸杂交琼脂糖凝胶电泳图。其中1为50℃，2为45℃，3为40℃。从图中可以看出可知，在40～50℃温度范围内中，核酸探针与序列均能发生杂交；40℃时的条带较50℃与45℃的条带宽，证明杂交进行得不完全、不彻底。50℃与45℃的杂交条带比较窄，证明核酸杂交进行得较完全与彻底。依据核酸杂交温度一般在Tm温度下5至10℃以及核酸杂交温度越低可降低错配率的经验，选择45℃为核酸杂交优选温度。如图5所示，为实施例2、5和对照例1～2的提供的方法检测的血清miRNA的化学发光强度图。从图中可知，随着处理时间的延长，最终的化学发光检测值也随之增强，但是经过15h杂交时间与21h杂交时间后血清中miR-16的最终化学发光检测值差异不大(15h,40025±960AU；21h,43287±1185AU)；因此，可以认为经过15h至21h的杂交，血清中绝大部分miRNA都能够与核酸探针杂交。为了确保所有的目标miRNA都能充分与其对应的核酸探针a与核酸探针b杂交。杂交21h是更为优选的方案。如图6所示，为实施例2、6～8提供的方法检测的血清miRNA的化学发光强度图。从图中可知，仅修饰一个生物素的信号放大序列1(Amplifier1)，血清中miR-16导致的最终化学发光检测值依然较高(25958±1109AU)；逐渐增加生物素修饰之后，血清中miR-16导致的化学发光检测值从25958±1109AU(Amplifier1)增加至42780±1445AU(Amplifier4)，这证明通过增加信号放大序列上的生物素修饰可以使核酸探针b上连接更多的HRP分子继而引起更强的化学荧光。为了使整个体系的检测灵敏度最高与检测限最低，修饰有生物素的数量为4个。对本实施例2提供的方法进行线性检测范围及最低检测限、检测特异性以及其应用进行测试表征如下：(1)线性检测范围及最低检测限已有研究表明miR-16是一种在血液中浓度较大且较为恒定的miRNA，目前已作为一种肺癌患者血液样本中的内参miRNA被广泛应用于肺癌的早期诊断与术后监测。我们将利用本实施例2提供的方法进行肺癌的诊断，同样将血清样本中的miR-16作为内参，miR-21的化学发光检测值与其比对后，通过得到的比值进行NSCLC的初步诊断。如图7所示，miR-16的浓度(10fM至50pM)与所得的化学发光检测值呈线性相关，miR-16的浓度的浓度越大，所得的化学发光检测值也就越大；其线性方程为：C.I.(化学发光检测值)＝184.390Con.(miRNA浓度)×1015-113.419根据检测到的空白值(727±76.7AU)中的标准偏差值(76.7AU)与最低检测限计算公式(3σ/S，σ为标准偏差，S为线性方程的斜率)得到该方法的最低检测限为1.248fM。已有的文献报道，血液样本中所含有的作为肿瘤标志物的miRNA其含量一般在fM至pM之间，本实施例提供的这种化学发光检测miRNA的新体系miRNA定量检测方法因为其线性范围在10fM至50pM，最低检测限为1.248fM，能够检测出临床血液样本中的miRNA含量，可以被应用于临床NSCLC的初步诊断。(2)检测特异性let-7家族miRNA是由多个结构相似miRNA所组成的一类miRNA，此类miRNA彼此间只有一到两个碱基的差异，因此经常被用来测试miRNA检测系统的特异性。本实施例提供的方法中同样使用了人工合成的1pM的let-7a至let-7f六种miRNA去测试该方法的miRNA检测特异性。该方法利用短核酸链(探针)与目标miRNA杂交的碱基较少(11个碱基)，若出现错配或部分互补的情况则连接不牢，可以通过多次洗液的清洗去除不完全互补的miRNA。根据已有文献的研究，采用let-7a核酸探针a与核酸探针b检测了浓度为1pM人工合成的miRNAlet-7家族中let-7a至let-7f六种miRNA。这些miRNA彼此结构间存在最多3个碱基，最少1个碱基的差异。本发明选用人工合成的1pM的let-7a至let-7f六种miRNA去测试本实施例提供的方法的miRNA检测特异性。如图8所示，为化学发光检测体系的选择性测试图。从图中可知，本实施例2提供的方法最多造成25.01％(let-7c)左右的实验误差。(3)应用SOL技术和化学发光技术检测血清中特异性miRNA标志物进行肺癌检测本发明使用了包括2014年3月至2016年6月采集于深圳市人民医院肺癌患者血清样本28例，其中10例健康对照者与18例不同分期、年龄与性别的NSCLC患者血清样本中的miR-16，miR-21这两种miRNA。我们将在血液中表达较为稳定的miR-16作为内参物质，将在NSCLC患者血清中特异性高表达的miR-21作为miRNA标志物。同时，我们采用了Exiqon公司的miRCURYTMRNAIsolationKits–Biofluids试剂盒提取了临床血清样本中的miRNA，然后用AppliedBiosystems公司的TaqManMicroRNA检测试剂盒与实时荧光定量PCR仪(7500)通过荧光定量PCR的方法检测了所收集到的血清样本中miR-16与miR-21，miR-21检测的Ct值用内参miR-16的Ct值进行均一化，miR-21相对于内参miR-16的倍数用2-ΔCt表示。表5荧光定量PCR检测健康对照者血清中miR-16与miR-21的Ct值及其均一化后的表达倍数ΔCt*为检测血清中miR-21的Ct值减去血清中miR-16的Ct值。表6荧光定量PCR检测NSCLC患者血清样本中miR-16与miR-21的Ct值及其均一化后的表达倍数ΔCt*为检测血清中miR-21的Ct值减去血清中miR-16的Ct值。表7本实施例2提供的方法检测健康对照者血清中miR-16与miR-21的化学发光检测值(C.I.)及其均一化后的表达倍数C.I.*21/16为miR-21化学发光检测值与内参miR-16化学发光检测值的比值。表8本实施例2提供的方法检测NSCLC患者血清样本中miR-16与miR-21的化学发光检测值(C.I.)及其均一化后的表达倍数C.I.*21/16为miR-21化学发光检测值与内参miR-16化学发光检测值的比值。由表5～8的检测数据可知，，与健康对照者相比，NSCLC患者血清中miR-21表达普遍升高，结果符合已有的文献报道。由荧光定量PCR技术检测结果可知，健康对照者血清中miR-21与内参miR-16均一化后的表达倍数一般在0.0174至0.1398，其中位数为0.0325；然而NSCLC患者血清中miR-21与内参miR-16均一化后的表达倍数在0.0179至0.1857，其中位数为0.0709。由本实施例2提供的方法的检测结果可知，健康对照者血清中miR-21检测值与内参miR-16检测值比值倍数一般在0.0254至0.1376，其中位数为0.0434；然而NSCLC患者血清中miR-21与内参miR-16均一化后的表达倍数在0.0217至0.2040，其中位数为0.0946。本实施例2提供的方法的检测结果与荧光定量PCR技术的检测结果较为一致，其中存在的差异可能来自于血清中miRNA的提取与分离过程。由以上结果可知，本实施例2提供的方法可以跟传统的荧光定量PCR技术一样，具有检测和分析血清中miRNA的能力，并且其无需进行核酸的提取与扩增；通过检测NSCLC患者血清中特异性表达的miRNA标志物，应用SOL技术的化学发光检测方法能够被用来进行临床NSCLC的诊断。当前第1页1 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