专利名称：脱血红素猪血血红蛋白酶解物及血红素肽的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种脱血红素猪血血红蛋白酶解物及血红素肽的制备方法，具体涉 及以猪血红细胞为原料，通过溶血、控制蛋白酶酶解、等电离心分离制备脱血红素 猪血血红蛋白酶解物及血红素肽，属于食品生物技术领域。
背景技术：
由于历史和传统的原因，我国每年出栏和屠宰猪的数量极其庞大根据国家统 计局的数据，我国2004年猪的出栏量为6.4亿头，除了越200万头活猪出口，绝大多 数出栏的猪都宰国内屠宰。以每头猪收集猪血2,2公斤计算，则2004年我国就有140 万吨猪血产量。猪血血红蛋白是血液中重要的组成部分，约占猪血蛋白总量的65%。 血红蛋白中富含血红素，100g猪血血红蛋白含血红素铁40mg，如不将血红素与血红 蛋白分离，而直接将血红蛋白添加到食品中易导致食品氧化劣变，且产品颜色变深， 这严重制约了猪血资源的开发利用。目前除有小部分血红蛋白用于生产附加值劍氐 的产品，如血豆腐、血肠及词用血粉，但其它大部分血红蛋白均直接排放废弃，造 成了严重的资源浪费和环境污染。从血红蛋白分离血红素和蛋白的方法大多是采用 有机溶剂法，该方法导致有机溶剂残留，蛋白难以回收利用，环境污染较大。后来 亦有学者(Houlier、 Synowiecki、 Ockerman)采用酶水解法来提取血红细胞中的血红 蛋白，酶解后的产物采用活性碳吸附法脱血红素。采用该方法血红细胞的蛋白质回 收率仅为60-70%，酶解产物有较重的苦味，且血红素难以回收利用，这影响了该法 的推广应用。后有学者采用CMC吸附法从血红蛋白酶解产物中提取血红素，虽避免 了添加有机溶剂，但在提取过程中需加入大量的水(9倍)，蛋白质回收的能耗增大， 实际应用受到限制。
测定蛋白质回收率、血红素回收率和水解度的公式如下
蛋白质回收率=脱血红素猪血血红蛋白酶解物中蛋白含量/猪血血红细胞中总蛋白含 量X1000/0
血红素回收率=血红素肽中血红素含量/猪血血红细胞中血红素总量乂100% 水解 度=上清液中氨态氮含量/上清液中总氮含量乂100%
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的上述能耗大、脱血红素猪血血红蛋白酶 解物回收率低或血红素肽回收率低、环境污染较大以及酶解产物有较重的苦味等缺 陷，提供一种脱血红素猪血血红蛋白酶解物和血红素肽的制备方法，使脱血红素血
红蛋白酶解物的蛋白质回收率达80% 85 % ，血红素肽的血红素回收率达到90%-93 %，血红素含量达到25% 30%。本发明采用绿色生产工艺，原料利用率高。
本发明所述的脱血红素猪血血红蛋白酶解物及血红素肽的制备方法包括如下步
骤
(1 )猪血血红蛋白加水调整其蛋白质含量为12.4% 17.5% ，调节溶液pH值到7.1 7.8，加入胰酶和Protamex或木瓜蛋白酶的混合蛋白酶进行水解，当水解度达到 25% 31%时终止反应；
(2) 将步骤(1)得到的水解产物在3000g 4000g条件下离心10min 20min，分 别得到上清液和沉淀；
(3) 将步骤(2)离心得到的上清液调pH至3.5 5.2， 30。C 5(TC水浴保温10 60min后，3000g 4000g离心10min 20min，分别得到上清液和沉淀；
(4) 将步骤(2)和(3)离心得到的沉淀合并，用0.2 0.5倍重量的蒸馏水洗涤， 在3000g 4000g离心10min 20min,分别得到上清液和沉淀；
(5) 将步骤(3)和(4)离心得到的上清液调pH为7.0，浓縮，喷雾干燥，得到 淡黄色粉状脱血红素血红蛋白酶解物。猪血血红蛋白的蛋白质回收率可达80% 85 %，产物无苦味，其蛋白质的含量为90% 93%;(6)将步骤(4)离心得到的沉淀置于-5。C -2(TC条件下冻藏12h 24h， 25。C解冻 后加0.5倍重量的蒸馏水洗涤，在3000g 4000g条件下离心10min 20min，弃去 上清液，得到沉淀，将沉淀在同样条件下冻藏、洗涤、离心，重复2 4次，将沉 淀干燥得血红素肽。
在步骤(1)中，用2MNaOH将溶液pH值调节到7.1 7.8。 在步骤(1)中，用95。C 10(TC加热5min 10min终止酶解反应。 在步骤(3)中，用2MHCl将溶液pH值调节到3.5 5.2。 在步骤(5)中，用2MNaOH将上清液pH值调节到7.0。
在步骤(6)中，采用冷冻干燥法将沉淀干燥为黑色粉末，此时血红素含量达25% 30%，肽或蛋白质的含量70% 75%。
所述猪血血红蛋白溶液可以采用现有技术得到，本发明采用下述方法制备得 到检疫合格的生猪经空心刀采血，加入0.33%拧檬酸钠并混合均匀抗凝，然后经 过3000g 4000g、 5。C 10。C离心10min 20min，下层沉淀为血红细胞。血红细胞 加1.0 1.5倍体积的水再经20Mpa 60Mpa均质或超声波功率为1000W 1500W 超声处理2min 5min得到猪血血红蛋白溶液。
所述的蛋白酶均为食品级蛋白酶，其混合蛋白酶具体比例(U/U)如下
胰酶Protamex = 1 2 : 9;
胰酶木瓜蛋白酶=1 2 : 8。
本发明与现有技术相比，具有如下优点本发明通过高压均质或超声处理对血 红细胞进行溶血处理，采用复合蛋白酶对血红蛋白进行高效可控水解，采用等电点 沉淀法实现蛋白质酶解产物与血红素肽的高效分离，制备了符合食品工业应用要求 的脱血红素酶解血红蛋白粉和血红素肽。该方法反应条件温和，无二次污染，蛋白 质回收率最高可达85%，比目前文献报道的最好水平提高了 10% 15%。血红素回 收率达到93%左右，血红素肽中血红素含量达到25% 30%，两种产物均无不良风 味。
具体实 式
实施例l
第一步检疫合格的生猪经空心刀采血，加入0.33%柠檬酸钠并混合均匀抗凝， 3000g、 5。C离心20min，得到下层沉淀血红细胞，血红细胞加1.5倍体积的水后， 20MPa均质溶血得到猪血血红蛋白溶液。
第二步将猪血血红蛋白溶液加水调整其蛋白质含量至12.4%，混合均匀后用2M NaOH将溶液pH值调节到7.]，加入胰酶和Protamex进行水解，比例(U/U)为胰 酶:Protamex = 1:9。当水解度达到30。/。时，IO(TC加热5min终止酶解反应。 第三步将7K解产物在3000g条件下离心20min，分别得到沉淀和上清液。
第四步:将第三步得到上清液调pH至3.5， 30'C水浴30min后，在3000g离心20min， 分别得到上清液和沉淀。
第五步将第三步和第四步的沉淀合并，加0.2倍重量的蒸馏水洗涤，在3000g离 心20min，分别得到上清液和沉淀。
第六步将第四步和第五步的上清液合并，调pH值至7.0，浓缩、喷雾干燥得到淡 黄色脱血红素酶解物。其蛋白质含量为91.5%，蛋白回收率为80.6%。 第七步将第五步所得沉淀置于-5"冻藏12h，解冻后加0.5倍重量的蒸馏水洗涤， 在3000g条件下离心20min，弃去上清液，得到沉淀，将该沉淀按该步骤中上述操 作重复处理2次，得血红素肽。
第八歩采用冷冻干燥法将第七步所得血红素肽干燥为黑色粉末，血红素的回收率 达90.6 % ，血红素肽中血红素含量为26.8 % 。
实施例2
第一步检疫合格的生猪经空心刀采血，加入0.33%柠檬酸钠并混合均匀抗凝，然 后经过4000g、 I(TC离心IO分钟，得到下层沉淀血红细胞，血红细胞加1.4倍体积 的水再经60Mpa均质溶血得到猪血血红蛋白溶液。
第二步将猪血血红蛋白溶液加水调整其蛋白质含量为13.5%，混合均匀后用2M
NaOH将溶液pH值调节到7.3，加入胰酶和Protamex，比例为胰酶:Protamex = 2:9，
当水解度达到28%时，95'C加热10min终止酶解反应。
第三步将水解产物在3500g离心15min，分别得到沉淀和上清液。
第四步将第三步的上清液调pH至4.0， 40。C水浴30min后，3500g条件下离心
15min，分别得到上清液和沉淀。
第五步将第三步和第四步的沉淀合并，加0.3倍重量的蒸馏水洗涤，在4000g条 件下离心10min，分别得到上清液和沉淀。
第六步将第四步和第五步的上清液合并，调pH值为7.0，浓縮，喷雾干燥得到淡 黄色产物。其蛋白质含量为90.2%，蛋白回收率为82.1%。
第七步将第五步所得沉淀置于-10'C冻藏12h，解冻后加0.5倍重量的蒸馏水洗涤， 在3000g条件下离心20min，弃去上清液，得到沉淀，将该沉淀按该步骤中上述操 作重复处理3次，得血红素肽产品。
第八步将第七步所得血红素肽冷冻干燥得黑色粉末，血红素含量为25.9%，血红 素的回收率达91.2%。
实施例3
第一步检疫合格的生猪经空心刀采血，加入0.33%柠檬酸钠并混合均匀抗凝， 3500g、 5"C离心15分钟，得到下层沉淀血红细胞。血红细胞加1.3倍体积的水经超 声波功率为1100W超声3min溶血得到猪血血红蛋白溶液。
第二步猪血血红蛋白溶液加水调整其蛋白质含量为16.5%，用2MNaOH将溶液
pH值调节到7.4，加入胰酶和木瓜蛋白酶，比例为胰酶:木瓜蛋白酶二 2:8 (U/U)，
当水解度达到26%时，IO(TC加热10min终止酶解反应。
第三步将酶解产物在4000g离心10min，分别得到沉淀和上清液。
第四步将第三步的上清液调pH至4.5， 5(TC水浴10min后，在3500g离心15min，
分别得至l让清液和沉淀。
第五步将第三步和第四步的沉淀合并，加0.5倍重量的蒸馏水洗涤，在4000g条 件下离心10min，分别得到上清液和沉淀。
第六步将第四步和第五步的上清液合并，调pH值为7.0，浓縮，喷雾干燥得到淡 黄色产物。其蛋白质含量为90.5%，蛋白回收率为84.3%。
第七步将第五步所得沉淀置于-2(TC冻藏12h，解冻后加0.5倍重量的蒸馏水洗涤， 在3500g条件下离心15min，弃去上清液，得到沉淀。将该沉淀按该步骤中上述操 作重复处理4次，得血红蛋白肽。
第八步将第七步所得血红蛋白肽冷冻干燥为黑色粉末。黑色粉末的血红素含量为 26.4%,血红素的回收率达92.7%。
实施例4
第一步检疫合格的生猪经空心刀采血，加入0.33%柠檬酸钠并混合均匀抗凝， 3500g、 5。C离心15分钟，得到下层沉淀血红细胞。血红细胞加1.1倍体积的水经超 声波功率为1500W超声2min溶血得到猪血血红蛋白溶液。
第二步猪血血红蛋白溶液加水调整其蛋白质含量为17.5%，混合均匀后用2M
NaOH将溶液pH值调节到7.7，加入胰酶和木瓜蛋白酶，比例为胰酶木瓜蛋白酶
=1:8 (U/U)，当水解度为25%时，IO(TC加热8min终止酶解反应。
第三步将酶解产物在4000g离心20min，分别得到沉淀和上清液。
第四步..将第三步的上清液调pH至5.0， 40。C水浴40min后，4000g离心10min，
分别得到上清液和沉淀。
第五步将第三步和第四步的沉淀合并，加0.2倍重量的蒸馏水洗涤，在4000g离 心15min，分别得到上清液和沉淀。
第六步将第四步和第五步的上清液合并，调pH值为7.0， ？农縮，喷雾干燥得到淡 黄色产物。淡黄色产物的蛋白质含量为91.4%，蛋白回收率为84.1%。
第七步将第五步所得沉淀置于-2(TC冻藏24h，解冻后加0.5倍重量的蒸馏水洗涤， 在3000g离心18min，弃去上清液，得到沉淀，将该沉淀按该步骤中上述操作重复 处理3次，得血红蛋白肽。
第八步将第七步所得血红蛋白肽冷冻千燥为黑色粉末。黑色粉末中血红素含量为 29.9%，血红素的回收率达90.4%。
权利要求
1、一种脱血红素猪血血红蛋白酶解物及血红素肽的制备方法，其特征在于包括如下步骤(1)猪血血红蛋白溶液加水调整其蛋白质含量为12.4％～17.5％，调节溶液pH值到7.1～7.8，加入胰酶和Protamex或木瓜蛋白酶的混合蛋白酶进行酶解，当水解度达到25％～31％时终止酶解反应；(2)将步骤(1)得到的酶解产物在3000g～4000g条件下离心10min～20min，分别得到上清液和沉淀；(3)将步骤(2)离心得到的上清液调pH至3.5～5.2，30℃～50℃水浴10min～60min后，在3000g～4000g条件下离心10min～20min，分别得到上清液和沉淀；(4)将步骤(2)和(3)离心得到的沉淀合并，用0.2～0.5倍重量的蒸馏水洗涤，在3000g～4000g离心10mm～20min，分别得到上清液和沉淀；(5)将步骤(3)和(4)离心得到的上清液合并，调pH至7.0，浓缩，喷雾干燥，得到淡黄色粉状脱血红素猪血血红蛋白酶解物；(6)将步骤(4)离心得到的沉淀置于-5℃～-20℃条件下冻藏12h～24h，解冻后加0.5倍重量的蒸馏水洗涤，在3000g～4000g条件下离心10min～20min，弃去上清液，得到沉淀，将该沉淀按步骤(6)中上述操作重复处理2～4次，冷冻干燥，得血红素肽。
2、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的混合蛋白酶的比例(U/U) 为胰酶Protamex = 1 2 : 9或S夷酶木瓜蛋白酶=1 2 : 8。
3、 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于步骤(1)中，用2MNaOH 调节溶液pH至7.1 7.8。
4、 根据权利要求3所述的方法，其特征在于步骤(1)中，在95。C 10(TC条 件下加热5min 10min后终止酶解反应。
5、 根据权利要求4所述的方法，其特征在于步骤(3)，用2MHCl将溶液pH值调节到3.5 5.2。 '
6、 根据权利要求5所述的方法，其特征在于步骤(5)，用2MNaOH将上清 液pH值调节到7.0。
7、 根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述猪血血红蛋白采用下述方法 制备得到检疫合格的生猪经空心刀采血，加入0.33%柠檬酸钠并混合均匀抗凝， 经过3000g 4000g、 5。C 10。C离心10min 20min，得到下层沉淀血红细胞，血红 细胞加1.0 1.5倍体积的水再经20Mpa 60Mpa均质或超声波功率为1000W 1500W超声处理2min 3min，溶血得到猪血血红蛋白溶液。
全文摘要
本发明公开了一种脱血红素猪血血红蛋白酶解物和血红素肽的制备方法。该方法以猪血红细胞为原料，通过溶血、复合蛋白酶酶解、等电离心分离制备脱血红素猪血血红蛋白酶解物及血红素肽。本发明反应条件温和，脱血红素酶解物的蛋白质回收率达80～85％，血红素肽中血红素回收率达到90～93％以上，血红素含量达到25～30％。两种产物均无不良风味，可直接添加于食品。
文档编号A23J3/00GK101194665SQ20071003182
公开日2008年6月11日 申请日期2007年11月30日 优先权日2007年11月30日
发明者刘通迅, 春 崔, 赵强忠, 赵谋明, 郭善广 申请人:华南理工大学