本发明属于毛细管电色谱柱制备技术领域，具体涉及一种手性键合毛细管电色谱开管柱的制备方法及其应用。
背景技术：
手性广泛存在于自然界中，是生物体系的基本特征，但人类对手性物质的认识和研究还很浅显。近年来，随着人们对医药、食品、生命科学和环境分析等关系民生领域的关心和关注，大量存在于这些领域中的手性分析检测问题也日益凸显[Analytica Chimica Acta,931(2016):1-24]。
色谱法是当前用于手性分离检测方法中最有效的方法。其中，毛细管电色谱作为近年来新兴的一种高效、快速的色谱微分离技术，已应用于手性分离检测上。但由于毛细管电色谱柱(按固定相形式不同，分为填充柱、整体柱和开管柱)制备技术的局限性，限制了其应用范围。开管柱制备过程简单，柱子渗透性好，不易产生气泡及涡流扩散，相对于填充柱有较高的柱效，且不需要烧制柱塞，可以以一种相对简单且经济的模式实现对手性物质的有效分离分析[Journal of Chromatography A,1467(2016):145-154]。但一般采用涂覆方式制备的开管柱，固定相容易脱落，使用寿命短；而采用键合方式制备的开管柱，通过化学键将固定相稳固的键合到毛细管内壁上，则可克服这方面的缺点和不足。因此，设计和制备各种键合开管柱已成为本领域探索的热点。
β-环糊精(β-CD)因其独特的结构和性能，作为色谱固定相的研究已受到广泛关注[Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis,130(2016):110-125]。但作为手性固定相，往往需要对其进行选择性修饰，引入不同的基团，使其在手性拆分过程中改变其与对映体的相互作用力或与对映体能有更多的作用位点，从而提高其应用的普适性或选择性。作为键合开管柱的固定相，一般需要制备具有功能性基团的β-环糊精衍生物。
综上所述，设计具有功能性基团的β-环糊精衍生物，通过简单操作，建立使用寿命长，重现性和稳定性好，可用于手性分析检测的键合毛细管开管柱的制备方法，亟待出现。
技术实现要素：
本发明目的在于克服现有电色谱柱制备方法的缺点和不足，并提供一种能满足电色谱分离要求，制备方法简易，使用寿命长，重现性和稳定性好，且具有手性拆分能力的电色谱柱的制备方法。
本发明所采用的具体技术方案如下：
手性键合毛细管电色谱开管柱的制备方法，其步骤如下:
1)将质量比为(0.25～0.45)：1的二苯基甲烷二异氰酸酯和单-6-乙二胺基β-环糊精溶于二甲基亚砜中，于惰性气体保护下常温搅拌4～6h，然后加入丙酮析出沉淀，将沉淀物经过过滤、干燥得到单-6-脲键桥连β-环糊精；
2)依次用HCl溶液、水和NaOH溶液冲洗毛细管柱，然后两端封口放置一定时间，再用水冲洗至中性，继续用甲醇冲洗后氮气吹干；
3)将体积比为70:(22～25):(5～8)的3-氨基丙基三乙氧基硅烷、乙醇与水混合物注入经过2)处理的毛细管柱中，两端封口于30～45℃下进行反应使毛细管内壁氨基化，反应完成后用甲醇冲洗并干燥；
4)将单-6-脲键桥连β-环糊精和偶氮二异丁腈，加入到一定体积的二甲基亚砜中，其中单-6-脲键桥连β-环糊精与二甲基亚砜的质量体积比为6～10％，混匀后充入经过3)处理的毛细管柱中，两端封口，40～50℃水浴反应24～48h，依次用甲醇、超纯水冲洗，得到手性键合毛细管电色谱开管柱。
作为优选，所述的单-6-乙二胺基β-环糊精的制备方法为：将单-6-对甲苯磺酰基β-环糊精溶解于乙二胺中，反应后加入丙酮后析出白色沉淀，过滤；对沉淀物通过加水溶解后添加丙酮析出的方式进行若干次纯化，纯化产物干燥后得到单-6-乙二胺基β-环糊精。
进一步的，所述的单-6-对甲苯磺酰基β-环糊精的制备方法为：将β-环糊精溶解于氢氧化钠溶液中，然后在冷水浴条件下再加入对甲苯磺酰氯，将混合液搅拌反应4～6h，过滤，用HCl溶液调节滤液pH＝6～7，然后将混合溶液静置于0～4℃环境下过夜，然后过滤分离出沉淀物，对沉淀物进行重结晶，重结晶产物干燥后得到单-6-对甲苯磺酰基β-环糊精。
进一步的，重结晶方法为：用蒸馏水重结晶2次，体积比1：1的乙腈：水的混合溶液重结晶1次。
进一步的，制备单-6-对甲苯磺酰基β-环糊精时，所述的混合液中，氢氧化钠溶液的浓度为30％，每100mL氢氧化钠溶液中溶解5.0gβ-环糊精和1.5～1.8g对甲苯磺酰氯。
作为优选，步骤2)中，毛细管柱需事先进行预处理，除去毛细管柱内部的灰尘。
作为优选，步骤2)中，HCl溶液和NaOH溶液的浓度均为1mol/L，HCl溶液、水和NaOH溶液的冲洗时间分别为30min、30min和1h，两端封口后于40℃下放置时间为6h，甲醇冲洗时间为20min。
作为优选，单-6-对甲苯磺酰基β-环糊精在乙二胺中的反应温度为80℃，反应时间为4～6h。
本发明的另一目的在于提供一种根据上述任一方案中的方法制备的手性键合毛细管电色谱开管柱。该开管柱可用于对手性物质进行手性拆分。
本发明相对于现有技术而言，具有以下有益效果：
(1)利用β-环糊精的特殊结构和分子特征，设计出其具有异氰酸基的衍生物，与氨基化毛细管内壁键合，制备了满足电色谱分离要求，方法简单、重现性和稳定性好的手性毛细管电色谱开管柱。
(2)将环糊精单体、脲基、氨基等功能化基团引入到开管柱固定相中，形成具有多机理、多模式的固定相，有效提高柱效和分离选择性。
(3)随键合方法的使用次数增加，可以获得具有不同厚度固定相的电色谱开管柱，有效提高样品容量，改善固定相机械强度和稳定性。
附图说明
图1为开管柱的制备流程图。
图2为实施例1中制备的开管柱截面的扫描电镜照片。
图3为实施例1中制备的开管柱分离四种手性药物的色谱分离图，其中a)为组氨酸，b)为布洛芬，c)为阿替洛尔，d)为索他洛尔。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步阐述和说明。本发明中各个实施方式的技术特征在没有相互冲突的前提下，均可进行相应组合。
本发明提供一种手性键合毛细管电色谱开管柱的制备方法，其工艺流程如图1所示，其具体步骤为：
(1)单-6-对甲苯磺酰基β-环糊精的制备：
将5.0gβ-环糊精(β-CD)溶解于100mL浓度30％的氢氧化钠溶液中，冷水浴中加入1.5～1.8g对甲苯磺酰氯，搅拌反应4～6h，过滤，用1mol/L HCl溶液调节滤液pH为6～7，有白色沉淀析出，将该混合物放置于冰箱(0～4℃)中过夜，过滤，沉淀用蒸馏水重结晶2次，乙腈:水(体积比1:1)重结晶1次，50℃真空干燥，得到单-6-对甲苯磺酰基β-环糊精(6-OTs-β-CD)。
(2)单-6-乙二胺基β-环糊精的制备
称取3.0g 6-OTs-β-CD，加入40～50mL 乙二胺，搅拌溶解，80℃下反应4～6h，加入丙酮析出白色沉淀，过滤。沉淀加水溶解，丙酮析出，过滤，重复该操作1次，再将沉淀在50℃真空干燥，得到单-6-乙二胺基β-环糊精(EDA-β-CD)。
(3)单-6-脲键桥连β-环糊精的制备
称取2.0g EDA-β-CD和0.5～0.9g二苯基甲烷二异氰酸酯溶于20mL二甲基亚砜(DMSO)中，氮气保护下，常温搅拌4～6h，加入丙酮析出沉淀，过滤，50℃真空干燥，得到最终产物---单-6-脲键桥连β-环糊精(UB-β-CD)，其结构为：
(4)手性键合毛细管电色谱开管柱的制备
毛细管柱使用之前必须对其进行预处理，除去毛细管柱内部的灰尘及有害物质，活化内壁的硅羟基并使其带有特殊基团。本发明中分别用1mol/L HCl溶液、水和1mol/L NaOH溶液冲洗毛细管柱(50μm i.d.，365μm o.d.，Length：60cm)30min、30min和1h，然后，两端封口于40℃下放置6h，再用水冲洗至中性，甲醇冲洗20min后，氮气吹干。3-氨基丙基三乙氧基硅烷(KH550)是具有硅烷氧基和氨基的双官能团试剂，其可以与毛细管内壁的硅羟基发生化学反应，使毛细管内壁氨基化。将体积比为70:(22～25):(5～8)的KH550、乙醇与水混合物注入上述毛细管柱中，两端封口，30～45℃反应24h。反应完成后，再用甲醇冲洗，氮气吹干。柱内壁键合结构为：
将UB-β-CD和0.0030g偶氮二异丁腈(AIBN)，加入到一定体积的DMSO中，其中UB-β-CD与DMSO的质量体积比(w/v)为6～10％，超声混匀，将该混合物充入上述的毛细管柱中，两端封口，40～50℃水浴反应24～48h，依次用甲醇、超纯水冲洗。即获得了一种结构确定的手性键合毛细管开管柱，其固定相结构为：
制备到上述毛细管开管柱后，本发明采用傅里叶红外光谱仪(溴化钾压片法)和热重分析仪对步骤(1)、(2)、(3)制备的β-环糊精衍生物进行表征。采用扫描电子显微镜对步骤(4)制备的毛细管开管柱表面形貌和状态进行表征。
手性键合毛细管电色谱开管柱的手性拆分试验如下：
采用本发明制得的手性键合毛细管电色谱开管柱(填充长度45cm)，20mmol/L的磷酸盐缓冲液，在不同缓冲溶液pH、分离柱温和分离电压下，对组氨酸、布洛芬、阿替洛尔和索他洛尔四种手性物质进行手性拆分应用。
下面结合实施例对本发明做进一步说明，但不仅限于此。
实施例1
本实施例中，手性键合毛细管电色谱开管柱的制备方法，具体步骤如下：
(1)单-6-对甲苯磺酰基β-环糊精的制备：
将5.0gβ-CD溶解于100mL浓度30％的氢氧化钠溶液中，冷水浴中加入1.6g对甲苯磺酰氯，搅拌反应5h，过滤，用1mol/L HCl溶液调节滤液pH 6～7，有白色沉淀析出，将该混合物放置于冰箱(0～4℃)中过夜，过滤，沉淀用蒸馏水重结晶2次，乙腈:水(体积比1:1)重结晶1次，50℃真空干燥，得到单-6-对甲苯磺酰基β-环糊精(6-OTs-β-CD)。
(2)单-6-乙二胺基β-环糊精的制备
称取3.0g 6-OTs-β-CD，加入45mL 乙二胺，搅拌溶解，80℃下反应4h，加入丙酮析出白色沉淀，过滤。沉淀加水溶解，丙酮析出，过滤，重复该操作1次，沉淀50℃真空干燥，得到单-6-乙二胺基β-环糊精(EDA-β-CD)。
(3)单-6-脲键桥连β-环糊精的制备
称取2.0g EDA-β-CD和0.6g二苯基甲烷二异氰酸酯溶于20mL DMSO中，氮气保护下，常温搅拌5h，加入丙酮析出沉淀，过滤，50℃真空干燥，得到最终产物---单-6-脲键桥连β-环糊精(UB-β-CD)，其结构为：
(4)手性键合毛细管电色谱开管柱的制备
分别用1mol/L HCl溶液、水和1mol/L NaOH溶液冲洗毛细管柱(50μm i.d.，365μm o.d.，Length：60cm)30min、30min和1h，然后，两端封口40℃下放置6h，再用水冲洗至中性，甲醇冲洗20min后，氮气吹干。再将体积比为70:25:5的KH550、乙醇与水混合物注入毛细管柱中，两端封口，40℃反应24h。再用甲醇冲洗，氮气吹干。柱内壁键合结构为：
将UB-β-CD和0.0030g AIBN，加入到一定体积的DMSO中，其中UB-β-CD质量为0.03g，DMSO体积为0.5mL，超声混匀，将该混合物充入上述的毛细管柱中，两端封口，40℃水浴反应24h，依次用甲醇、超纯水冲洗。即获得了一种结构确定的手性键合毛细管开管柱，其固定相结构为：
(5)采用傅里叶红外光谱仪(溴化钾压片法)和热重分析仪对步骤(1)、(2)、(3)制备的β-环糊精衍生物的结构和热稳定性进行了表征。采用扫描电子显微镜对步骤(4)制备的毛细管开管柱表面形貌和状态进行了表征。结果表明，成功地制备了各种β-环糊精衍生物，且纯度高，热稳定性好。毛细管内壁紧密而均匀地键合了一层花纹状物质，厚度在1～2μm之间(如图2所示)，固定相通过化学键稳固的键合到毛细管内壁上，相比涂覆的固定相具有更好的机械强度和稳定性。
(6)手性键合毛细管电色谱开管柱的手性拆分能力试验
采用本发明制得的手性键合毛细管电色谱开管柱(填充长度45cm)，20mmol/L的磷酸盐缓冲液，对组氨酸、布洛芬、阿替洛尔和索他洛尔四种手性物质进行手性拆分应用。从图3中可以看出四种手性物质对映体均达到基线分离，证明了本发明制得的毛细管开管柱具有很强的手性拆分能力。四种手性物质对映体达到基线分离的电色谱条件为：
组氨酸：缓冲溶液pH7.0，分离柱温20℃，分离电压15kV
布洛芬：缓冲溶液pH7.0，分离柱温22℃，分离电压10kV
阿替洛尔：缓冲溶液pH7.5，分离柱温22℃，分离电压20kV
索他洛尔：缓冲溶液pH5.5，分离柱温22℃，分离电压10kV。
实施例2
本实施例中，手性键合毛细管电色谱开管柱的制备方法，具体步骤如下：
(1)单-6-对甲苯磺酰基β-环糊精的制备：
将5.0gβ-CD溶解于100mL浓度30％的氢氧化钠溶液中，冷水浴中加入1.6g对甲苯磺酰氯，搅拌反应6h，过滤，用1mol/L HCl溶液调节滤液pH 6～7，有白色沉淀析出，将该混合物放置于冰箱(0-4℃)中过夜，过滤，沉淀用蒸馏水重结晶2次，乙腈:水(体积比1:1)重结晶1次，50℃真空干燥，得到单-6-对甲苯磺酰基β-环糊精(6-OTs-β-CD)。
(2)单-6-乙二胺基β-环糊精的制备
称取3.0g 6-OTs-β-CD，加入45mL乙二胺，搅拌溶解，80℃下反应4h，加入丙酮析出白色沉淀，过滤。沉淀加水溶解，丙酮析出，过滤，重复该操作1次，沉淀50℃真空干燥，得到单-6-乙二胺基β-环糊精(EDA-β-CD)。
(3)单-6-脲键桥连β-环糊精的制备
称取2.0g EDA-β-CD和0.75g二苯基甲烷二异氰酸酯溶于20mL DMSO中，氮气保护下，常温搅拌5h，加入丙酮析出沉淀，过滤，50℃真空干燥，得到最终产物---单-6-脲键桥连β-环糊精(UB-β-CD)，其结构为：
(4)手性键合毛细管电色谱开管柱的制备
分别用1mol/L HCl溶液、水和1mol/L NaOH溶液冲洗毛细管柱(50μm i.d.，365μm o.d.，Length：60cm)30min、30min和1h，然后，两端封口40℃下放置6h，再用水冲洗至中性，甲醇冲洗20min后，氮气吹干。再将体积比为70:22:8的KH550、乙醇与水混合物注入毛细管柱中，两端封口，45℃反应24h。再用甲醇冲洗，氮气吹干。柱内壁键合结构为：
将UB-β-CD和0.0030g AIBN，加入到一定体积的DMSO中，其中UB-β-CD质量为0.04g，DMSO体积为0.5mL，超声混匀，将该混合物充入上述的毛细管柱中，两端封口，40℃水浴反应36h，依次用甲醇、超纯水冲洗。即获得了一种结构确定的手性键合毛细管开管柱，其固定相结构为：
(5)采用傅里叶红外光谱仪(溴化钾压片法)和热重分析仪对步骤(1)、(2)、(3)制备的β-环糊精衍生物的结构和热稳定性进行了表征。采用扫描电子显微镜对步骤(4)制备的毛细管开管柱表面形貌和状态进行了表征。结果表明，与实施例1类似，毛细管内壁紧密而均匀地键合了一层花纹状物质。
(6)手性键合毛细管电色谱开管柱的手性拆分能力试验
采用本发明制得的手性键合毛细管电色谱开管柱(填充长度45cm)，20mmol/L的磷酸盐缓冲液，对组氨酸、布洛芬、阿替洛尔和索他洛尔四种手性物质进行手性拆分应用。四种手性物质对映体均达到了基线分离，证明了本发明制得的毛细管开管柱具有很强的手性拆分能力。
实施例3
本实施例中，手性键合毛细管电色谱开管柱的制备方法，具体步骤如下：
(1)单-6-对甲苯磺酰基β-环糊精的制备：
将5.0gβ-CD溶解于100mL浓度30％的氢氧化钠溶液中，冷水浴中加入1.8g对甲苯磺酰氯，搅拌反应6h，过滤，用1mol/L HCl溶液调节滤液pH 6-7，有白色沉淀析出，将该混合物放置于冰箱(0～4℃)中过夜，过滤，沉淀用蒸馏水重结晶2次，乙腈:水(体积比1:1)重结晶1次，50℃真空干燥，得到单-6-对甲苯磺酰基β-环糊精(6-OTs-β-CD)。
(2)单-6-乙二胺基β-环糊精的制备
称取3.0g 6-OTs-β-CD，加入50mL乙二胺，搅拌溶解，80℃下反应4h，加入丙酮析出白色沉淀，过滤。沉淀加水溶解，丙酮析出，过滤，重复该操作1次，沉淀50℃真空干燥，得到单-6-乙二胺基β-环糊精(EDA-β-CD)。
(3)单-6-脲键桥连β-环糊精的制备
称取2.0g EDA-β-CD和0.8g二苯基甲烷二异氰酸酯溶于20mL DMSO中，氮气保护下，常温搅拌6h，加入丙酮析出沉淀，过滤，50℃真空干燥，得到最终产物---单-6-脲键桥连β-环糊精(UB-β-CD)，其结构为：
(4)手性键合毛细管电色谱开管柱的制备
分别用1mol/L HCl溶液、水和1mol/L NaOH溶液冲洗毛细管柱(50μm i.d.，365μm o.d.，Length：60cm)30min、30min和1h，然后，两端封口40℃下放置6h，再用水冲洗至中性，甲醇冲洗20min后，氮气吹干。再将体积比为70:25:5的KH550、乙醇与水混合物注入毛细管柱中，两端封口，40℃反应24h。再用甲醇冲洗，氮气吹干。柱内壁键合结构为：
将UB-β-CD和0.0030g AIBN，加入到一定体积的DMSO中，其中UB-β-CD质量为0.03g，DMSO体积为0.5mL，超声混匀，将该混合物充入上述的毛细管柱中，两端封口，50℃水浴反应24h，依次用甲醇、超纯水冲洗。即获得了一种结构确定的手性键合毛细管开管柱，其固定相结构为：
(5)采用傅里叶红外光谱仪(溴化钾压片法)和热重分析仪对步骤(1)、(2)、(3)制备的β-环糊精衍生物的结构和热稳定性进行了表征。采用扫描电子显微镜对步骤(4)制备的毛细管开管柱表面形貌和状态进行了表征。结果表明，与实施例1类似，毛细管内壁紧密而均匀地键合了一层花纹状物质。
(6)手性键合毛细管电色谱开管柱的手性拆分能力试验
采用本发明制得的手性键合毛细管电色谱开管柱(填充长度45cm)，20mmol/L的磷酸盐缓冲液，对组氨酸、布洛芬、阿替洛尔和索他洛尔四种手性物质进行手性拆分应用。四种手性物质对映体均达到了基线分离，证明了本发明制得的毛细管开管柱具有很强的手性拆分能力。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，然其并非用以限制本发明。有关技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此凡采取等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。