本发明涉及农作物化学分析领域，具体涉及一种检测大蒜根系分泌物中硫醚类化合物的方法。
背景技术：
：大蒜(alliumsativuml.)是常见的蔬菜，它具有抗癌、杀虫、抑菌等多种功效。大蒜素是大蒜中的主要活性成分，但由于结构不稳定同时易分解为二烯丙基二硫(dads)及其他硫醚类化合物，具备广谱抑菌活性。大蒜体内合成的硫醚类化合物能够通过根系分泌的方式进入土壤中，对土壤中的有害微生物产生抑制作用，造就良好的土壤微生态环境。专利文献cn103063491a公开了一种采用逆流色谱技术分离大蒜中含硫化合物的方法，专利文献cn103820523a提供了一种提取大蒜中具有浓厚味的含硫物质的方法，但上述现有技术涉及的方法均需要从大蒜体内提取化合物的方法，目前尚无大蒜根系分泌物中硫醚类化合物的定量检测方法。另外，由于大蒜根系分泌物中硫醚类化合物含量较低，同时具备较强挥发性，常用的提取和检测方法很难对其进行定量检测，根系分泌物收集后的旋转蒸发或者冷冻干燥浓缩过程易产生较大损失，通过硫醚类化合物标准品建立标准曲线进行定量与实际情况相差较远。技术实现要素：本发明提供一种利用气相色谱-质谱联用仪(gc-ms)和标准品添加回收的方法联合定量检测大蒜根系分泌物中硫醚类化合物的种类及其含量的方法。具体而言，本发明提供的方法包括以下步骤：(1)取硫醚类化合物的标准品，以水为溶剂，按照浓度梯度配制成多份标准品溶液；(2)在不同浓度的标准品溶液中分别加入乙酸乙酯进行萃取，收集乙酸乙酯层，蒸干溶剂后用正己烷复溶并定容，备用；(3)采用气相色谱-质谱联用仪对经步骤(2)处理后的标准品溶液进行检测，得gc-ms谱图；将所述多份标准品溶液的浓度与其各自在所述gc-ms谱图中对应的峰面积进行曲线拟合，得浓度-峰面积标准曲线；(4)将待测的新鲜大蒜的根系浸泡于无菌水中，收集含有待测样品根系分泌物的浸泡液；采用与步骤(2)相同的方法对所述浸泡液进行处理，再采用与步骤(3)相同的方法进行检测，得到待测样品gc-ms谱图；(5)将所述待测样品gc-ms谱图与标准品溶液的gc-ms谱图进行对比，确定待测样品中是否含有与所述标准品相同的硫醚类化合物；(6)将经步骤(5)确定与所述标准品相同的硫醚类化合物在所述待测样品gc-ms谱图中对应的峰面积代入步骤(3)所得的浓度-峰面积标准曲线中，求得所述待测样品中硫醚类化合物的含量。本发明所述硫醚类化合物包括：二烯丙基二硫醚、二丙基二硫醚、烯丙基丙基二硫醚等，优选为二烯丙基二硫醚。为了获得与待测样品浓度匹配且拟合度好的浓度-峰面积标准曲线，本发明优选步骤(1)所述多份标准品溶液的浓度分别为：0、100mg/l、200mg/l、400mg/l、600mg/l。步骤(2)中对样品的检测前预处理是本发明的核心之一。对于大蒜根系分泌物中低浓度的硫醚类化合物而言，耗时较短的乙酸乙酯萃取-蒸干-复溶是合适的浓缩方法，与其它常规操作(如冷冻干燥或萃取后顶空收集)相比，耗时短，且效率高。且本发明经大量实践发现，采用乙酸乙酯萃取并在较低温度下将乙酸乙酯蒸干可以确保检测目标硫醚类化合物被最大程度得提取，损失小，检测准确性高。具体而言，本发明步骤(2)中所述萃取优选采用乙酸乙酯与水溶液体积比1.5～2.5：1的比例萃取2～3次，合并萃取液。所述蒸干溶剂优选在40～60℃条件下通过旋转蒸发将溶液浓缩至干。所述定容优选以正己烷为溶剂定容至1.5～2.5ml。步骤(4)对大蒜根系分泌物中硫醚类化合物的收集也是本发明的核心之一。本发明通过大量实践发现，采用水培收集比本领域的常规方法(如基质栽培法或连续循环装置法)对大蒜根系分泌物中硫醚类化合物的收集率更高，从而确保最终的检测结果更准确。具体而言，本发明采用水培浸泡的方式收集浸泡液作为待测样品，具体的收集方法优选为：将15～25株待测新鲜大蒜的根系浸泡于100～200ml无菌蒸馏水中，隔绝空气静置2～4小时，过滤去除不溶物，即得。本发明采用气相色谱-质谱联用仪对样品进行检测，具体的检测为本领域常规操作。作为本发明的一种优选方案，所述气相色谱条件包括：sh-rxi-5silms色谱柱，柱压为49～50kpa，起始柱温35～45℃，以2.5～3.5℃/min的速度升温至75～85℃，然后以4.5～5.5℃/min的速度升温至255～265℃，保持25～35min；载气为氦气，进样口温度245～255℃，进样量1.5～2.5μl，进样方式为分流进样，分流比为8～12:1。作为本发明的一种优选方案，所述质谱条件包括：ei电离源，离子源温度225～235℃，接口温度245～255℃；扫描范围m/z35-500，采集方式scan，扫描间隔0.25～0.35s。本发明提供的检测大蒜根系分泌物中硫醚类化合物的方法中，采用硫醚类化合物收集效率最高的收集方法(即水培收集)以及损失最低的浓缩方法(即乙酸乙酯萃取-蒸干-复溶)，并通过气相色谱-质谱联用仪检测硫醚类化合物，进一步优选采用标准品添加回收的方法消除浓缩过程目标组分损失所产生的影响，可以实现对大蒜根系分泌物中硫醚类化合物的精确定量。具体实施方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。以下各实施例和对比例中，气相色谱条件包括：sh-rxi-5silms色谱柱，柱压为49.5kpa，起始柱温40℃，以3℃/min的速度升温至80℃，然后以5℃/min的速度升温至260℃，保持30min；载气为氦气，进样口温度250℃，进样量2μl，进样方式为分流进样，分流比为10:1。以下各实施例和对比例中，质谱条件包括：ei电离源，离子源温度230℃，接口温度250℃，扫描范围m/z35-500，采集方式scan，扫描间隔0.3s。实施例1本实施例提供了检测大蒜根系分泌物中二烯丙基二硫醚的方法，具体步骤为：(1)取二烯丙基二硫醚的标准品，以水为溶剂，分别配制成浓度0、100mg/l、200mg/l、400mg/l、600mg/l的标准品溶液；(2)在不同浓度的标准品溶液中以体积比2:1分别加入乙酸乙酯萃取2次，收集乙酸乙酯层，在50℃条件下通过旋转蒸发将溶液浓缩至干，用正己烷复溶并定容2ml，在棕色进样瓶中避光存储备用；(3)采用气相色谱-质谱联用仪对经步骤(2)处理后的标准品溶液进行检测，得gc-ms谱图；将所述多份标准品溶液的浓度与其各自在所述gc-ms谱图中对应的峰面积进行曲线拟合，得浓度-峰面积标准曲线；(4)将20株新鲜大蒜的根系浸泡于150ml无菌蒸馏水中，隔绝空气静置3小时，过滤去除不溶物，得浸泡液；采用与步骤(2)相同的方法对所述浸泡液进行处理(即：以体积比2:1加入乙酸乙酯萃取2次，收集乙酸乙酯层，在50℃条件下通过旋转蒸发将溶液浓缩至干，用正己烷复溶并定容2ml，在棕色进样瓶中避光存储备用)，再采用与步骤(3)相同的方法进行检测，得到待测样品gc-ms谱图；(5)将所述待测样品gc-ms谱图与标准品溶液的gc-ms谱图进行对比，确定待测样品中是否含有二烯丙基二硫醚；(6)将经步骤(5)确定含有的二烯丙基二硫醚在所述待测样品gc-ms谱图中对应的峰面积代入步骤(3)所得的浓度-峰面积标准曲线中，求得所述待测样品中硫醚类化合物的含量。对比例1与实施例1相比，区别仅在于：步骤(4)中，用基质栽培法或连续循环装置法代替实施例1采用的水培收集法收集待测大蒜样品中的二烯丙基二硫醚。所述基质栽培法具体为：1)取生长健康的大蒜苗在自来水下冲洗干净后放于0.3％次氯酸钠消毒3min。将准备好的大蒜苗放入收集装置，保持根系舒展，缓慢加入75g石英砂，每瓶种植1棵大蒜苗，共20瓶。2)第一次加入无菌水至石英砂含水量饱和，每隔2天加入10ml无菌水，直至加4次无菌水后更换为0.5倍hoagland营养液，每隔2天加入10ml营养液。8天后将营养液更换为无菌水，每隔1天加入10ml无菌水，整个收集过程保持通气阀的开启，利用添加的无菌水冲出石英砂中残余的营养液。无菌水培养2周后即可开始收集根系分泌物。收集时缓慢加入无菌水6ml，多余液体顺着通气阀口流入收集瓶，共计收集72h，收集到的即为根系分泌物。3)经过乙酸乙酯萃取后，利用gc-mc对大蒜根系分泌物进行鉴定。所述连续循环装置法具体为：1)自动连续循环收集装置的结构组成。a.无底玻璃瓶(小口直径4cm，大口直径10cm，高度24cm)，洗净后用锡箔纸包好，以起到遮光的作用；b.带阀门的玻璃管(外径9mm，长15cm)；c.玻璃柱(内径2.5cm，长25cm)；d.u形管、t形管、弯形玻璃管(外径9mm)；e.大、小橡皮塞、矽胶管(内径8mm)，在橡皮塞中心打一个直径为9mm的孔，外面涂一层硅酮，以防止橡皮塞中有机成分的溶出；f.充气泵：型号为sonic9905(ac120v，60hz，2.9w)，每2个t形管连接一个泵，通过调节泵的功率调节水流速度，从而使水流均匀自动循环。2)玻璃棉、石英砂用2mol/l的hcl浸泡24h，用自来水冲洗至ph约为7.0，将石英砂装入60cm×40cm的不锈钢方盘中，160℃干热灭菌8h，冷却后装入无底玻璃瓶中，玻璃棉塞入小口防止石英砂进入玻璃管道。在石英砂中加入0.5倍hoagland营养液。3)种入大蒜蒜瓣(去皮后用1％次氯酸钠浸泡15min，灭菌水冲洗3次)，每个无底玻璃瓶中种植5株，共种植4瓶。用铝箔纸将无底玻璃瓶及瓶口包裹，待大蒜发芽之后，在对应位置扎小孔让其穿出玻璃瓶生长。大蒜生长过程中，从第二周开始每周加入1倍hoagland营养液，期间补充蒸馏水保持水分，大蒜约生长至10-15cm高度时，放尽玻璃瓶中营养液，用自来水冲洗干净后用无菌水冲洗3次，在玻璃瓶底部接上树脂柱(xad-4中性交换树脂用甲醇、乙醚、甲醇分别浸泡24h后无菌水冲洗干净)及其他组件，打开阀门和泵连续收集72h。4)取下树脂填充柱，以甲醇为洗脱剂洗脱树脂柱上的物质(洗4次)，收集洗脱液，使用旋转蒸发仪进行减压浓缩，除去洗脱液中的甲醇；去甲醇后的洗脱液在ph＝5.5～6.0的条件下与二氯甲烷以1:2的比例混匀进行萃取，重复3次，收集萃取液中的有机相为中性条件组分；调节萃取后的洗脱液水相ph＝2，用2倍体积的二氯甲烷再次萃取3次，收集有机相为酸性残余组分；调节萃取后的洗脱液水相ph＝11，用2倍体积的二氯甲烷再次萃取3次，收集有机相为碱性残余组分。将得到的三种组分通过无水caco3除水，用旋转蒸发仪减压浓缩，最终定容到20ml，作为根系分泌物母液，4℃冰箱低温避光保存备用。5)利用gc-mc对大蒜根系分泌物进行鉴定。实施例1(即水培收集)以及本对比例采用的两种方法所测得的大蒜根系分泌物中二烯丙基二硫醚的含量如表1所示。表1：不同收集方法大蒜根系分泌物中二烯丙基二硫醚的含量水培收集基质栽培连续循环装置gc-ms检测浓度(mg/l)65.7a47.3b0c收集时间(h)37272大蒜株数(株)202020由表1可见，通过短时间的水培收集并通过正己烷最终定容到2ml，最终收集到大蒜根系分泌物中二烯丙基二硫醚的浓度为65.7mg/l，而通过基质栽培收集72h的浓度只有47.3mg/l，连续循环装置则并未检测到二烯丙基二硫醚，后两种方法的收集效率显著低于水培收集，可见水培收集是更适合大蒜根系分泌物中硫醚类化合物收集的方法。对比例2与实施例1相比，区别仅在于：步骤(2)中，用冷冻干燥或乙酸乙酯萃取-顶空收集代替实施例1采用的乙酸乙酯萃取-蒸干溶剂-复溶。所述冷冻干燥具体为：1)预冻：将水培法收集到的大蒜根系分泌物倒入玻璃培养皿中，用保鲜膜将培养皿包裹，放入-80℃冰箱冷冻3h。2)打开真空泵，预热20min，关闭泵。3)打开主机开关，当冷凝室内的温度降至-40℃时，将预冻好的样品从-80℃冰箱中取出，放在干燥室内。4)打开真空泵，让系统开始抽气，当压力降至0.1mbar以下时，冷冻干燥开始。5)冷冻干燥24h后，关闭真空泵，关闭主机。6)用2ml正己烷溶解培养皿中的白色粉末，所得溶液用gc-mc进行检测。所述乙酸乙酯萃取-顶空收集具体为：1)将水培法收集到的大蒜根系分泌物用乙酸乙酯进行萃取，将萃取后的有机相分装到10个9cm直径的玻璃培养皿中，将培养皿放置于玻璃缸中，盖上玻璃盖子；2)将玻璃盖子的顶部与装有吸附树脂的样品管以及由空样品管、橡皮管、吸水性变色硅胶管、活性炭管顺次相连而成的排空管分别相连；打开位于所述样品管另一端的气泵，收集72h，使所述待测样品吸附于树脂上，再用正己烷淋洗所述吸附树脂，收集淋洗液5ml，氮吹浓缩至2ml，所得溶液用gc-ms进行检测。实施例1(即乙酸乙酯萃取-蒸干溶剂-复溶)以及本对比例采用的两种方法所测得的大蒜根系分泌物中二烯丙基二硫醚的含量如表2所示。表2不同萃取/浓缩方法检测二烯丙基二硫醚的含量由表2可见，配制较低浓度的二烯丙基二硫醚水溶液，通过乙酸乙酯萃取后再马上进行旋转蒸发进行浓缩，样品的保存率为65.7％，而较长时间的冷冻干燥和顶空收集则会导致样品大量损失，样品浓度降低至检测限以下。由此可见，对于大蒜根系分泌物中低浓度的硫醚类化合物，耗时较短的旋转蒸发是合适的浓缩方法，而耗时较长的冷冻干燥和顶空收集效率很低。对比例3与实施例1相比，区别仅在于：用直接进样法代替实施例1采用添加回收法。所述直接进样具体为：用正己烷溶解不同质量的二烯丙基二硫醚标准品，配制为浓度梯度后直接进样，得到gc-ms谱图；将标准品溶液的不同浓度与其各自在所述gc-ms谱图中对应的峰面积进行曲线拟合，得二烯丙基二硫醚的浓度-峰面积标准曲线。实施例1(即添加回收)以及本对比例采用的直接进样法获得的二烯丙基二硫醚标准品gc-ms峰面积如表3所示。表3：不同处理方法二烯丙基二硫醚标准品gc-ms峰面积经检测，待测样品中二烯丙基二硫醚在所述待测样品gc-ms谱图中对应的峰面积为3410677，将该值代入表3所得拟合曲线中可知，通过标准品溶液直接进行gc-ms检测的拟合曲线计算所得浓度仅为45.8mg/l,而实施例1通过标准品添加回收后进行gc-ms检测的拟合曲线计算所得浓度为65.7mg/l。可见，通过标准品直接进样建立标准曲线的方法计算所得浓度比真实浓度低30.3％，严重影响试验结果的准确性，而通过本发明提供的方法可以得到更接近真实结果的数据。虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。当前第1页12