本发明涉及分析化学领域，特别涉及一种环孢素a眼凝胶的杂质控制方法。
背景技术：
环孢素a(cyclosprine,cya)是由11个氨基酸组成的环状多肽,是土壤中一种真菌的活性代谢物。1978年英国首次将cya应用于临床肾移植,此后cya又用于肝、心、肺、胰腺、骨髓等器官的移植,均取得令人满意的效果,明显提高病人的生存率。1984年环孢素a进入中国,形成了"环孢素a+硫唑嘌呤+激素"的三联免疫抑制方案,大大提高了移植存活率,同时也使移植术后急性排斥反应的发生率大幅下降。cya作为一种强效免疫抑制剂,近年来人们对它的研究越来越多,广泛应用于各种疾病的治疗。
环孢素具有难溶性，制成均一的凝胶或者液体制剂，需要将环孢素溶解，通常加入聚氧乙烯蓖麻油，蓖麻油或者吐温等助溶剂，以保证环孢素溶解，且在储存使用过程中不析出。但是增溶剂一般紫外出峰都很强烈，存在辅料干扰风险，且环孢素工艺杂质和降解杂质众多。现有各种原料的杂质控制方法，无法有效的检出这些杂质。
环孢素凝胶、环孢素眼用乳剂以及环孢素注射液都含有增溶剂,这些增溶剂大都有以下几种：聚氧乙烯蓖麻油35、聚氧乙烯蓖麻油40，蓖麻油等；这类增溶剂紫外响应值很高，出风强烈，且极性和环孢素类似，因此这些辅料往往对环孢素杂质检测影响很大。暂时还没有关于控制环孢素制剂杂质的专利发表。文献和各国药典收录的环孢素制剂，也没有杂质控制项目和控制方法。
对于眼用制剂，国家要求按照注射剂管理，因此制剂的杂质控制十分严格。但是目前国内外专利和药典法案，环孢素胶囊，环孢素注射液等都没有对杂质提出控制方法和限度,因此给临床应用带来风险，也降低了产品的质量。如何解决检测中辅料干扰问题和众多杂质的分离控制成为急待解决的问题。
已经公布的控制环孢素杂质的方法，是中国药典环孢素原料方法,分析方法为：
色谱柱：c18色谱柱(150×4.6mm,5μm)
流动相：乙腈-水-叔丁基甲醚-磷酸(430:520:50:1)
流速：1.0ml/min
柱温：70℃
波长：220nm
进样量：80μl
上述方法的问题是：同时检测多个杂质的专属性不好，杂质与主峰分离度欠佳，个别杂质峰出峰过早，空白辅料干扰出峰早的杂质检测。混标色谱图如图1。从图1可看出，前面两个杂质分离度很差，而且主峰后的杂质根本无法实现基线分离,无法同时对多个已知杂质进行控制。无法实现杂质与杂质、杂质与主峰的分离,且辅料峰干扰严重，影响了杂质的检测。因此需建立一个新的有关物质方法，能够检测和分离以上6个已知杂质(环孢素b、环孢素c、环孢素d、环孢素h、异环孢素a、异环孢素h)和未知杂质。
技术实现要素：
本发明的一个目的是提供一种环孢素a眼凝胶的杂质控制方法，用高效液相色谱进行测定，其中色谱条件如下：
检测波长为210-230nm；
柱温为60-68℃；
流速为0.8-1ml/min；
流动相：thf-水-磷酸。
作为优选，流动相thf-水-磷酸的体积比为400:600:1.5-2。
作为优选，所述柱温为65℃。
作为优选，所述色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(300mm*3.9mm，4um)。
作为优选，所述检测波长为220nm。
作为优选，所述色谱柱为waters色谱柱、thermo色谱柱、pheromone色谱柱或ymc色谱柱。
更优选的，所述流动相thf-水-磷酸的体积比为400:600:1.58。
本发明所述方法以色谱柱十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(300mm×3.9mm，4μm)；以thf-水-磷酸(400:600:1.58)为流动相；检测波长为220nm；柱温为65℃，流速为0.8ml/min，可以检测和分离6个已知杂质环孢素b、环孢素c、环孢素d、环孢素h、异环孢素a、异环孢素h和未知杂质，见图2所示；单个已知和未知限度设定为1％，动物实验和临床实验表明此方法控制制剂达到这个标准的制剂，表现了良好的安全性。
附图说明
图1为中国药典的杂质系统适应性混标色谱图；
图2为实施例12的杂质系统适应性混标色谱图；
图3为实施例1的杂质系统适应性混标色谱图；
图4为实施例2的杂质系统适应性混标色谱图；
图5为实施例3的杂质系统适应性混标色谱图；
图6为实施例4的杂质系统适应性混标色谱图；
图7为实施例5的杂质系统适应性混标色谱图；
图8为实施例6的杂质系统适应性混标色谱图；
图9为实施例7的杂质系统适应性混标色谱图；
图10为实施例8的杂质系统适应性混标色谱图；
图11为实施例9的杂质系统适应性混标色谱图；
图12为实施例10的杂质系统适应性混标色谱图；
图13为实施例11的杂质系统适应性混标色谱图。
具体实施方式
本发明公开了一种环孢素a眼凝胶的杂质控制方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1、色谱条件：
流动相：乙腈-水-叔丁基甲醚-磷酸(430：520:50:1)
波长：210nm；
流速：1.0ml/min；
柱温：70℃；
进样体积：80ul；
色谱柱：watersc18(150mm*4.6mm，5um)填料
系统适用性溶液色谱图见图3。结果显示：有较多的干扰峰干扰杂质的有效检出，且主峰与后面一个杂质(保留时间51.9min)分离度较差，最后二个杂质达不到基线分离，该方法不能用来检测环孢素a眼凝胶的有关物质。
实施例2、色谱条件：
参考《中国抗生素杂志》2002年4月第27卷第4期《hplc法测定环孢素胶囊中环孢素及降解产物的含量》文章，流速为1ml/min，hplc柱hypersilbdsc18250mm*4.6mm，5um、流动相：水-thf-0.4mol/l磷酸正丙胺溶液(0.4mol/l正丙胺溶液，用磷酸调节ph值为2.6)＝590：400:10、柱温70度，波长220nm。
色谱图如图4，结果显示保留时间34.0min、35.3min杂质分离度差，未达到基线分离。
实施例3、色谱条件：
在实施例2的基础上，降低有机相比例，具体条件如下：流速为1ml/min，hplc柱hypersilbdsc18250mm*4.6mm，5um、流动相：[水-0.4mol/l磷酸正丙胺溶液(0.4mol/l正丙胺溶液，用磷酸调节ph值为2.6)＝(885:15)]-thf＝650：350、柱温70度，波长220nm。
色谱图如图5，结果显示：保留时间69.4min、71.0min杂质未达到基线分离。
实施例4、色谱条件：
在实施例3的基础上，更改色谱柱规格，具体条件如下：流速为1ml/min，hplc柱watersnova-pakc18350mm*3.9mm，4um，流动相：[水-0.4mol/l磷酸正丙胺溶液(0.4mol/l正丙胺溶液，用磷酸调节ph值为2.6)＝(885:15)]-thf＝650：350、柱温70度，波长220nm。
色谱图如图6，结果显示采集时间过长，为130min。
实施例5、色谱条件
在实施例4的基础上，将等度改为梯度，考虑到通过仪器比例阀混合流动相基线噪音大，所以配制混合流动相，具体条件如下：流速为1ml/min，hplc柱watersnova-pakc18350mm*3.9mm，4um，流动相a:[水-0.4mol/l磷酸正丙胺溶液(0.4mol/l正丙胺溶液，用磷酸调节ph值为2.6)＝(885:15)]-thf＝630：370，
流动相b：[水-0.4mol/l磷酸正丙胺溶液(0.4mol/l正丙胺溶液，用磷酸调节ph值为2.6)＝(885:15)]-thf＝600：400，，柱温70度，波长220nm。
梯度程序：
色谱图如图7，结果显示基线噪音较大，干扰杂质的检测。
实施例6、色谱条件：
拟去掉流动相中的正丙胺，具体色谱条件如下：流速为0.7ml/min，hplc柱watersnova-pakc18350mm*3.9mm，4um，流动相：thf-水-85％磷酸＝400:600：1.58ml，柱温70度，波长220nm。
色谱图如图8，结果显示采集时间为120min，采集时间过长。
实施例7、色谱条件：
拟更改流动相中的磷酸量，具体色谱条件如下：流速为0.8ml/min，hplc柱watersnova-pakc18350mm*3.9mm，4um，流动相：thf-水-85％磷酸＝400:600：1.8，柱温65度，波长220nm。
色谱图如图9，结果显示，37.7min辅料峰干扰39.3min杂质的检测。
实施例8、色谱条件：
拟降低流动相中有机相的比例，具体色谱条件如下：流速为0.8ml/min，hplc柱watersnova-pakc18350mm*3.9mm，4um，流动相：thf-水-85％磷酸＝380:620：1.58，柱温65度，波长220nm。
色谱图如图10，结果显示140min为辅料峰未出完，采集时间过长。
实施例9、色谱条件：
流动相：水-四氢呋喃-85％磷酸(600:400：1.58)；
波长：220nm；
流速：0.7ml/min；
柱温：70℃；
进样体积：80ul；
色谱柱：c18,300mm*3.9mm，4um
系统适用性溶液色谱图见图11。
待改进地方：90min有辅料峰，采集时间为120min，过长。
实施例10、色谱条件：
流动相：水-四氢呋喃-85％磷酸(600:400：1.80)；
波长：220nm；
流速：0.8ml/min；
柱温：65℃；
色谱柱：c18,300mm*3.9mm，4um
进样体积：100ul；
系统适用性溶液色谱见图12。
待改进地方：37辅料峰与后面一个杂质未完全分离，干扰杂质的检测。
实施例11：色谱条件：
流动相：水-四氢呋喃-85％磷酸(620:380：1.58)；
波长：220nm；
流速：0.8ml/min；
柱温：65℃；
色谱柱：c18,300mm*3.9mm，4um
进样体积：100ul；
系统适用性溶液色谱见图13。
待改进地方：辅料峰保留时间为140min，采集时间过长。
实施例12、色谱条件：
流动相：水-四氢呋喃-85％磷酸(600:400：1.58)；
波长：220nm；
流速：0.8ml/min；
柱温：65℃；
色谱柱：c18,300mm*3.9mm，4um
进样体积：100ul；
系统适用性溶液色谱见图2。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。