本发明属于分析化学领域，具体涉及一种高效液相色谱法测定罗氟司特有关物质的方法。
背景技术：
慢性阻塞性肺病(copd)是一种常见的以持续性气流受限为特征的疾病，是全世界范围内发病率和死亡率最高的疾病之一。作为磷酸二酯酶4(pde-4)抑制剂的罗氟司特，能阻断炎症反应信号传递，减少炎症介质释放，进而抑制copd等呼吸道疾病对肺组织的损伤。
美国食品药品管理局(fda)和欧洲药品管理局(emea)分别于2011年3月1日和2011年2月28日批准forest公司的罗氟司特片用于降低严重慢性阻塞性肺病症状的发作或恶化的频率，以减轻患者的咳嗽及呼吸道黏液过多症状。
罗氟司特(roflumilast)，化学名为n-(3,5-二氯吡啶-4-基)-3-(环丙基甲氧基)-4-(二氟甲氧基)苯甲酰胺；分子式为c17h14cl2f2n2o3；化学结构式如下：
在合成该化合物的过程中引入的起始原料、中间体、副产物及存放过程中生成的降解产物等有关物质，若含量较大，可能会影响药物疗效、危害人体健康，需进行严格的质量控制。其包含杂质的具体信息见表1。
表1罗氟司特有关物质的名称和化学结构式
至今，欧洲药典、美国药典、英国药典、日本药典和中国药典等法定标准尚未收载罗氟司特；目前已发表的相关文献和专利中有关物质的检测方法仍有待改进。为保证罗氟司特及其制剂的安全、有效和质量可控，寻求一种简单快捷、专属性强、灵敏度高、准确性好的检测方法显得尤为重要。
技术实现要素：
鉴于此，本发明提供一种高效液相色谱法测定罗氟司特有关物质的方法，该方法可对罗氟司特中可能存在的杂质进行有效分离并定量测定，专属性强、灵敏度高、准确性好，从而有效控制罗氟司特及其制剂的产品质量，提高药品安全性，为罗氟司特及其制剂质量标准的制定提供依据。
为实现上述目的，本发明提供的技术方案如下。
一种高效液相色谱法测定罗氟司特有关物质的方法，以磷酸二氢铵溶液和有机溶剂的混合液为流动相，在十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱上进行等度洗脱，溶解样品所用的稀释液为流动相。
所述的罗氟司特有关物质包括：罗氟司特有关物质a、b、c、d、e、f、g中的一种或几种(见表1)。
所述的磷酸二氢铵溶液的浓度为0.004～0.02mol/l，ph值为3.0～3.6。
所述的有机溶剂为甲醇和乙腈。
优选的，所述流动相为0.005mol/l磷酸二氢铵溶液(用磷酸调节ph值至3.5)-甲醇-乙腈(41:31:28)。
所述高效液相色谱法的检测条件为：流动相的流速0.8～1.2ml/min，柱温25～35℃，检测波长210～215nm，进样量10μl。
本发明的方法用于罗氟司特及其制剂中潜在杂质的检测。
本发明的方法具体步骤：
取本品约25mg，精密称定，置50ml量瓶中，加乙腈5ml振摇使溶解，再用稀释液稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；精密量取1ml，置100ml量瓶中，用稀释液稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。
取杂质a、杂质b、杂质c、杂质d、杂质e、杂质f和杂质g对照品各适量，精密称定，分别用稀释液溶解并定量稀释制成每1ml含500μg的溶液，作为对照品贮备液；精密量取1ml，置50ml量瓶中，用稀释液稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。
取罗氟司特对照品约5mg，精密称定，置10ml量瓶中，加乙腈1ml振摇使溶解，再精密加入上述杂质对照品贮备液各0.2ml，用稀释液稀释至刻度，摇匀，制成每1ml含罗氟司特0.5mg、上述杂质各10μg的混合溶液，摇匀，作为系统适用性溶液。
照高效液相色谱法测定，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.005mol/l磷酸二氢铵溶液(用磷酸调节ph值至3.5)-甲醇-乙腈(41:31:28)为流动相，检测波长为213nm，流速1.0ml/min，柱温30℃。取系统适用性溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的3倍，罗氟司特峰与相邻杂质峰之间的分离度应大于1.5。精密量取供试品溶液、对照溶液和对照品溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的3倍。
本发明的方法与现有技术相比具有以下优点和积极效果：
1.本发明的方法可有效分离并定量测定罗氟司特中可能存在的有关物质，从而有效控制罗氟司特产品的质量，专属性强、灵敏度高、准确度好，可充分满足有关物质检查的要求。
2.本发明的方法简单快捷，能在同一个高效液相色谱条件下分离罗氟司特及其有关物质，监控反应进度，避免了在生产监控中频繁更换检测方法，可用于生产过程中间体的监控和成品中有关物质检查，提高工作效率，适合工业化大生产的要求。
综上所述，本发明的方法灵敏度高，可同时检测的潜在杂质种类多，能够全面控制罗氟司特及其制剂中的有关物质，提高药品安全性，为制定罗氟司特原料及其制剂的质量标准提供依据。
附图说明
图1罗氟司特有关物质检查空白溶液的高效液相色谱图。
图2罗氟司特有关物质检查系统适用性溶液的高效液相色谱图。
图3罗氟司特有关物质检查酸强制降解试验供试品溶液的高效液相色谱图。
图4罗氟司特有关物质检查碱强制降解试验供试品溶液的高效液相色图。
图5罗氟司特有关物质检查氧化强制降解试验供试品溶液的高效液相色谱图。
图6罗氟司特有关物质检查光照强制降解试验供试品溶液的高效液相色谱图。
图7罗氟司特有关物质检查高温强制降解试验供试品溶液的高效液相色谱图。
图中：1-杂质a；2-杂质b；3-杂质c；4-杂质d；5-杂质e；6-杂质f；7-杂质g；8-罗氟司特。
具体实施方式
下面通过实施例进一步解释和说明本发明。本发明的实施例仅用于更好地说明本发明的内容，而不是对本发明的限制，因此在本发明的方法的基础上对本发明的简单改进或替换均属本发明要求保护的范围。
本发明所述检测方法的色谱条件。
仪器：waterse2695型高效液相色谱仪(empower3色谱工作站、waterse2695分离模块、watersalliance系列柱温箱)，waters2998光电二极管阵列检测器。
色谱柱：watersxbridgec18(4.6mm×250mm，5μm)。
流动相：0.005mol/l磷酸二氢铵溶液(用磷酸调节ph值至3.5)-甲醇-乙腈(41:31:28)，等度洗脱。
检测波长：213nm。
流速：1.0ml/min。
柱温：30℃。
进样量：10μl。
实施例1本发明所述检测方法的系统适用性试验。
稀释液：0.005mol/l磷酸二氢铵溶液(用磷酸调节ph值至3.5)-甲醇-乙腈(41:31:28)。
空白溶液：稀释液。
杂质对照品贮备液的制备：取杂质a、杂质b、杂质c、杂质d、杂质e、杂质f和杂质g对照品各适量，精密称定，分别用稀释液溶解并定量稀释制成每1ml含500μg的溶液，摇匀，即得。
杂质定位溶液的制备：取上述杂质对照品贮备液适量，分别用稀释液定量稀释制成每1ml含10μg的溶液，摇匀，即得。
系统适用性溶液的制备：取罗氟司特对照品约5mg，精密称定，置10ml量瓶中，加乙腈1ml振摇使溶解，再精密加入上述杂质对照品贮备液各0.2ml，用稀释液稀释至刻度，摇匀，制成每1ml含罗氟司特0.5mg、上述杂质各10μg的混合溶液，即得。
精密量取上述空白溶液、各杂质定位溶液和系统适用性溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，按照实施例1色谱条件进行测定，记录色谱图。空白溶液色谱图见附图1，系统适用性溶液色谱图见附图2。本方法对罗氟司特与各杂质的分离情况见表2。
表2罗氟司特与各杂质的分离情况
结果表明，保留时间为14.6min的色谱峰为罗氟司特，罗氟司特与各杂质、各杂质之间均能达到有效分离，分离度均大于1.5，峰形较好，空白溶液不干扰罗氟司特有关物质的检测。
实施例2本发明所述检测方法的专属性试验。
强制降解试验是在模拟强酸、强碱、氧化、光照以及高温等的强降解条件，加速对罗氟司特进行破坏，目的是通过考察样品的降解产物和主峰以及已知杂质的分离情况，评估分析方法的有效性和适用性。
为了更好的考察本方法的专属性和稳定性，设计了酸、碱、氧化、光照和高温的强制降解试验。
酸强制降解试验：取罗氟司特约25mg，精密称定，置50ml量瓶中，加乙腈5ml振摇使溶解，加1mol/l盐酸溶液2ml，摇匀，置80℃水浴中加热破坏3.5h，放冷，加1mol/l氢氧化钠溶液中和，用稀释液稀释至刻度，摇匀，过滤，取10μl注入液相色谱仪，记录色谱图，详见附图3。
碱强制降解试验：取罗氟司特约25mg，精密称定，置50ml量瓶中，加乙腈5ml振摇使溶解，加0.1mol/l氢氧化钠溶液4ml，摇匀，置80℃水浴中加热破坏20min，放冷，加0.1mol/l盐酸溶液中和，用稀释液稀释至刻度，摇匀，过滤，取10μl注入液相色谱仪，记录色谱图，详见附图4。
氧化强制降解试验：取罗氟司特约25mg，精密称定，置50ml量瓶中，加乙腈5ml振摇使溶解，加30％双氧水溶液4ml，摇匀，置80℃水浴中加热破坏6h，放冷，用稀释液稀释至刻度，摇匀，过滤，取10μl注入液相色谱仪，记录色谱图，详见附图5。
光照强制降解试验：取罗氟司特约25mg，精密称定，置50ml量瓶中，加乙腈5ml振摇使溶解，加稀释液稀释至刻度，摇匀，置照度为4500lx±500lx的条件下破坏12h，摇匀，过滤，取10μl注入液相色谱仪，记录色谱图，详见附图6。
高温强制降解试验：取罗氟司特适量，置130℃烘箱加热破坏8h，放冷，密封，备用。取经高温强制降解试验后的罗氟司特约25mg，精密称定，置50ml量瓶中，加乙腈5ml振摇使溶解，用稀释液稀释至刻度，摇匀，过滤，取10μl注入液相色谱仪，记录色谱图，详见附图7。
结果表明，罗氟司特在高温条件下稳定；在酸、碱、氧化和光照条件下的降解产物能与罗氟司特有效分离，表明该色谱系统的灵敏度、专属性好。
实施例3本发明所述检测方法的检测限和定量限。
对于有关物质，检测限和定量限是根据信噪比法来确定的。将实施例2已知浓度的杂质对照品贮备液稀释到低浓度的样品，测出的信号与基线噪声进行比较，计算能被可靠检出的量，以信噪比约为3:1、10:1分别计算罗氟司特和各杂质的检测限和定量限，结果见表3。
表3检测限和定量限结果
由表3可见，本发明所述方法的灵敏度较高。
实施例4本发明所述检测方法的线性及范围。
对于罗氟司特及其有关物质，在定量限至不低于200％指标浓度的范围内取6个浓度点进行研究。线性关系以测得的峰面积对被分析物浓度的函数作图，进行线性回归，分别得回归方程，结果见表4。
表4各成分浓度与峰面积线性关系结果汇总表
由表4可见，本发明所述方法线性关系良好。
实施例5本发明所述检测方法的重复性试验。
配制6份含各杂质限度浓度供试品，在相同条件下测定，计算6份供试品中各杂质含量的相对标准偏差。
取罗氟司特约25mg，精密称定，置50ml量瓶中，加乙腈5ml使溶解，分别加入实施例2中配制的各杂质对照品贮备液各1ml，并用稀释剂稀释至刻度，摇匀，按照实施例1中的色谱条件，重复6次检测供试品中各杂质的含量，结果见表5。
表5重复性试验结果
由表5可见，各杂质6次检测的相对标准偏差均小于3.0％，表明该方法的精密度良好。
实施例6本发明所述检测方法的准确度试验。
于供试品中加入标准限度的80％，100％和120％不同浓度各杂质测得的回收率所得。采用加样回收法测定，测定加样样品中各杂质的实际测得量与理论量之间的比值，以百分率表达，结果见表6。
表6杂质回收率试验结果
由表6可见，各杂质的平均回收率均在98.6％～101.1％之间，符合验证方案要求，表明该方法具有良好的准确度。
实施例7本发明所述检测方法的溶液稳定性试验。
取罗氟司特样品，按照实施例1检测方法分别于室温下放置0，1，2，4，6，8，10，12h，按实施例1所述色谱条件测定，记录峰面积，考察各杂质及总杂质峰面积的变化情况并计算相对标准偏差，结果见表7。
表7供试品溶液稳定性试验结果
由表7可见，单个杂质的数量和含量均未增加，杂质总量也未增加，表明罗氟司特供试品溶液在12h内稳定。
上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。