一种卷烟滤嘴中微量生物碱和亚硝胺的测定方法与流程

本发明属于烟草制品化学成分的理化检验技术领域，具体涉及一种卷烟滤嘴中微量生物碱和亚硝胺的测定方法。

背景技术：

烟草微量生物碱是烟草和卷烟烟气中最重要的化学成分之一，微量生物碱的含量能影响卷烟香气量、浓度和刺激性，同时烟草微量生物碱还是烟草特有亚硝胺(tsnas)的前体物质。美国fda已将如n-亚硝基降烟碱(nnn)、4-(甲基亚硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(nnk)、n-亚硝基新烟碱(nat)和n-亚硝基假木贼碱(nab))等4种tsnas列入有害成分名单。卷烟抽吸过程中，卷烟滤嘴会截留部分烟草微量生物碱和tsnas，准确测定抽吸过的卷烟滤嘴中烟草微量生物碱和tsnas的含量水平可用于指导滤嘴的研发，对于保证卷烟的抽吸品质和降低抽烟危害性具有较为重要的意义。

目前，关于卷烟滤嘴中微量生物碱的测试方法还鲜有报道，关于卷烟滤嘴中tsnas的测定方法主要有气相色谱-质谱法和液相色谱-串联质谱法。气相色谱-质谱法的分离效果及色谱重现性好，但是，gc/ms法的前处理较为复杂费时；液相色谱-串联质谱法由于其高的灵敏度和强的选择性，比较适合复杂体系中痕量化合物(tsnas)的分离分析。然而，目前利用液相色谱-串联质谱法或液相色谱-高分辨质谱法同时测定卷烟滤嘴中微量生物碱和烟草特有亚硝胺的方法还未见报道。

技术实现要素：

为了解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种卷烟滤嘴中微量生物碱和亚硝胺的测定方法，其具体技术方案如下：

一种卷烟滤嘴中微量生物碱和亚硝胺的测定方法，包括以下步骤：

a)取使用完毕的卷烟滤嘴，纵向剪切，然后加入萃取溶剂和氘代同位素内标，采用加速溶剂萃取法进行萃取，收集萃取液；

b)将所述萃取液加入quechers试剂盒并漩涡混合1min～3min，以9000rpm～11000rpm的速度离心3～7min，得上清液；

c)采用uplc-hr-ms对所述上清液中的微量生物碱和烟草特有亚硝胺进行定量分析。

优选地，步骤a)所述萃取溶剂为甲醇和/或水，其加入体积为15～25ml。

优选地，步骤a)所述氘代同位素内标为二烯烟碱-d3、假木贼碱-d4、降烟碱-d4、麦斯明-d4、可替宁-d3和尼可替林-d9中的一种或多种。

优选地，步骤a)所述加速溶剂萃取的温度为40～120℃，时间为2min～60min。

优选地，所述uplc-hr-ms的流动相包括流动相a和流动相b，所述流动相a为乙酸铵水溶液，所述流动相b为甲醇或乙腈；

其梯度洗脱程序设置为：0～0.5min：2％b，0.5～4min：2％→98％b，4～7min：98％b，7～8min：98％→2％b，平衡2min。

优选地，所述uplc-hr-ms的色谱柱温度为25℃～60℃。

优选地，所述流动相的流速为0.1～0.5ml/min。

优选地，所述uplc-hr-ms的离子源为电加热喷雾离子源，喷雾电压为2.5～4.0kv，离子源温度为250℃～350℃，辅助气体加热温度为250℃～350℃，鞘气流速为25～40ml/min，辅助气流速为5～20ml/min。

优选地，步骤b)所述离心之后还包括：净化，所述净化为固相萃取净化或分散固相萃取净化。

优选地，所述卷烟滤嘴的数目为2～8支。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1)本发明方法可同时测定卷烟滤嘴中7种微量生物碱(二烯烟碱、假木贼碱、降烟碱、麦斯明、可替宁、尼可替林和n-甲酰基降烟碱)和4种特有亚硝胺(nnn、nnk、nat和nab)，检出限在0.05～5ng/ml之间，定量限在0.165～16.5ng/ml之间，加标回收率介于85.1％～117％，rsd均小于10％，灵敏度和准确度高；

2)本发明方法将加速溶剂萃取法、quechers净化方法和超高效液相色谱-高分辨质谱法有机结合在一起，简化了样品前处理程序，降低了样品中的杂质干扰，并减少了基质干扰，适用于批量卷烟滤嘴中微量生物碱和亚硝胺的快速测定；

3)本发明选取氘代同位素内标对各化合物进行定量分析，有效地降低了样品前处理过程中引起的误差，选择性强，准确性高。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1为二烯烟碱的提取离子流图；

图2为假木贼碱的提取离子流图；

图3为降烟碱的提取离子流图；

图4为麦斯明的提取离子流图；

图5为可替宁的提取离子流图；

图6为尼可替林的提取离子流图；

图7为n-甲酰基降烟碱的提取离子流图；

图8为nnk的提取离子流图；

图9为nnn的提取离子流图；

图10为nab的提取离子流图；

图11为nat的提取离子流图；

图12为实施例1中测定卷烟滤嘴中微量生物碱和亚硝胺的操作流程图。

具体实施方式

下面将结合本发明的具体实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

如图12所示，本实施例的卷烟滤嘴中微量生物碱和亚硝胺的测定步骤为：

1)收集检测样品：取抽2支吸完毕的卷烟滤嘴作为检测样品，标记为滤嘴1、滤嘴2。

2)样品前处理

去除未燃烧的烟丝部分，纵向剪切成四瓣，放入10ml规格的萃取釜中，依次加入200μl的内标和20ml作为萃取溶剂的40％甲醇溶液，然后采用加速溶剂萃取法重复萃取两次，每次萃取5min，萃取温度为50℃；接着，用5ml的甲醇进行淋洗，收集萃取液。其中，内标为二烯烟碱-d3、假木贼碱-d4、可替宁-d3和尼可替林-d9，内标浓度为10ug/ml。

静置一段时间后，取约1.5ml上清液加入2ml的quechers试剂管中，旋涡混合2min，10000rpm离心5min，收集上清液，采用分散固相萃取净化，净化材料可为氧化铝、c18、psa、florisil或carbon。

3)样品分析

取净化后的上清液进行uhplc-hr-ms分析，分析上清液中微量生物碱和烟草特有亚硝胺的含量。

超高效液相色谱条件：色谱柱为watersbeh-c18(2.1×50mm,1.7μm)，色谱柱温度为35℃；流动相a为0.2％的乙酸铵水溶液，流动相b为甲醇，进样体积为1μl，流速设为0.25ml/min；梯度洗脱条件设为：0～0.5min：2％b，0.5～4min：2％→98％b，4～7min：98％b，7～8min：98％→2％b，然后平衡2min。

质谱条件：电喷雾离子源(esi)，喷雾电压3.5kv，离子源温度300℃，辅助气体加热温度300℃，鞘气流速35ml/min，辅助气流速为10ml/min，扫描模式为prm正离子模式，仪器分辨率：17500。

质谱中，二烯烟碱、假木贼碱、降烟碱、麦斯明、可替宁、尼可替林、n-甲酰基降烟碱、nnk、nnn、nab和nat的定量离子对分别为159.0917→117.0580、163.1230→118.0653、149.1073→132.0810、147.0917→105.0450、177.1022→80.0500、234.1026→207.0920、177.1022→132.0810、208.1080→122.0602、178.0975→120.0683、192.1131→162.1150和190.0975→106.0528。

本发明的7种微量生物碱(二烯烟碱、假木贼碱、降烟碱、麦斯明、可替宁、尼可替林和n-甲酰基降烟碱)和4种烟草特有亚硝胺(nnk、nnn、nab和nat)的提取离子流图如图1至图11所示，表1为卷烟滤嘴中7种微量生物碱和4种烟草特有亚硝胺的测定结果。

表1

实施例2方法学考察

1)标准曲线

以乙腈为溶剂，分别配制不同浓度的微量生物碱和烟草特有亚硝胺的系列标准溶液，采用上述仪器条件分别进行uplc-hr-ms分析。然后采用内标法定量(内标为：二烯烟碱-d3、麦斯明-d4、可替宁-d3和尼可替林-d9)，以各目标物与其内标的峰面积比为纵坐标(y)，各目标物浓度为横坐标(x，ng/ml)进行回归分析，得到7种微量生物碱(二烯烟碱、假木贼碱、降烟碱、麦斯明、可替宁、尼可替林和n-甲酰基降烟碱)、4种烟草特有亚硝胺(nnk、nnn、nab和nat)的回归方程及其相关系数，如表2所示。

由表2可知，7种微量生物碱和4种烟草特有亚硝胺标准曲线的线性关系良好，r²在0.9974～0.9996之间。将最低浓度的标准溶液稀释并进行uplc-hr-ms分析，以3倍信噪比为方法的检出限(lod)，10倍信噪比为定量限(loq)，7种微量生物碱和4种烟草特有亚硝胺的lod和loq分别为0.05～5.0ng/滤嘴和0.165～16.5ng/滤嘴。表明本发明方法具有较高的灵敏度，适合于卷烟滤嘴中7种微量生物碱和4种烟草特有亚硝胺的快速定量分析。

表2

2)回收率和精密度

取空白卷烟滤嘴样品，在收集的滤嘴上按低、中、高3种添加水平添加标准溶液，然后按实施例1的样品前处理方法对样品进行处理，每个添加水平平行测定6次，进行回收率和精密度的测定，实验结果见表3。

由表3可知，7种微量生物碱和4种烟草特有亚硝胺的平均加标回收率在85.1％～117％之间，相对标准偏差小于10％，可以满足定量需要。

表3