一种口含烟中微量生物碱和亚硝胺的测定方法与流程

本发明属于烟草制品化学成分的理化检验技术领域，具体涉及一种口含烟中微量生物碱和亚硝胺的测定方法。

背景技术：

口含烟是一类通过口腔使用的无烟气烟草制品，从配料来看，口含烟是由烟粉/烟草提取物及添加的无机盐、香料、水分、保润剂等成分组成。口含烟是一种湿或者半湿的粉末烟草制品。口含烟不经过燃烧过程，由口腔直接消费，不产生烟雾，对于公众和环境几乎无影响。但是口含烟中加入的烟粉/烟丝/烟草提取物中往往含有少量的微量生物碱(如假木贼碱、降烟碱、麦斯明、可替宁、尼可替林和n-甲酰基降烟碱)和烟草特有亚硝胺。烟草微量生物碱的含量对口含烟的内在品质和可用性具有重要影响，而n-亚硝基降烟碱(nnn)和4-(甲基亚硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(nnk)具有1级致癌活性，n-亚硝基新烟碱(nat)和n-亚硝基假木贼碱(nab)具有3级致癌活性。因此，准确测定口含烟中的烟草微量生物碱和烟草特有亚硝胺的含量，对于保证口含烟的品质具有十分重要的意义。

迄今为止，关于口含烟中微量生物碱的含量检测鲜有报道，而关于口含烟中烟草特有亚硝胺的含量测定方法主要借鉴传统卷烟的方法，采用hac溶剂提取和液相色谱-串联质谱检测，但是口含烟和传统卷烟存在明显的差异，如胶基型口含烟含有胶基，给提取带来一定的困难，且基质更加复杂，因此传统液相色谱-串联质谱法不一定很合适；另外，同时测定口含烟中微量生物碱和烟草特有亚硝胺的方法还未见报道。

技术实现要素：

为了解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种口含烟中微量生物碱和亚硝胺的测定方法，其具体技术方案如下：

一种口含烟中微量生物碱和亚硝胺的测定方法，包括以下步骤：

a)将口含烟切片，加入萃取溶剂和氘代同位素内标，采用加速溶剂萃取法进行萃取，收集萃取液；

b)将所述萃取液与quechers试剂漩涡混合1min～3min，以9000rpm～11000rpm的速度离心3～7min，得上清液；

c)采用uplc-hr-ms对所述上清液中的微量生物碱和烟草特有亚硝胺进行定量分析。

优选的，步骤a)所述萃取溶剂为甲醇和/或乙腈，其加入体积为15～25ml。

优选的，步骤a)所述氘代同位素内标为假木贼碱-d4、降烟碱-d4、麦斯明-d4、可替宁-d3和尼可替林-d9中的一种或多种。

优选的，步骤a)所述萃取的温度为40～120℃，时间为2min～60min。

优选的，所述uplc-hr-ms的流动相包括流动相a和流动相b，所述流动相a为乙酸铵水溶液，所述流动相b为甲醇或乙腈；

其梯度洗脱程序设置为：0～0.5min：2％b，0.5～4min：2％→98％b，4～7min：98％b，7～8min：98％→2％b，平衡2min。

优选的，所述uplc-hr-ms的色谱柱温度为25℃～60℃。

优选的，所述流动相的流速为0.1～0.5ml/min。

优选的，所述uplc-hr-ms的离子源为电加热喷雾离子源，喷雾电压为2.5～4.0kv，离子源温度为250℃～350℃，辅助气体加热温度为250℃～350℃，鞘气流速为25～40ml/min，辅助气流速为5～20ml/min。

优选的，步骤b)所述离心之后还包括：净化，所述净化为固相萃取净化或分散固相萃取净化。

优选的，所述乙酸铵水溶液的质量百分比浓度为0.01％～1％。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1)本发明方法适用于胶基型口含烟中微量生物碱和亚硝胺的测定，可在10min内同时测定卷烟主流烟气中6种微量生物碱(假木贼碱、降烟碱、麦斯明、可替宁、尼可替林和n-甲酰基降烟碱)和4种特有亚硝胺(nnn、nnk、nat和nab)，检出限在0.25～25ng/g之间，定量限在0.825～82.5ng/g之间，加标回收率介于79.0％～119％，rsd均小于18％，和气相色谱-串联质谱法比较，本发明方法的灵敏度高5～10倍，对于保证口含烟的吸食品质以及客观评价卷烟安全性具有十分重要的意义；

2)本发明方法将加速溶剂萃取法、quechers净化方法和超高效液相色谱-高分辨质谱法有机结合在一起，简化了样品前处理程序，降低了样品中的杂质干扰，减少了基质干扰，适用于批量口含烟中微量生物碱和亚硝胺的快速测定；

3)本发明选取氘代同位素内标对各化合物进行定量分析，有效地降低了样品前处理过程中引起的误差，准确性高，选择性强。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1为假木贼碱的提取离子流图；

图2为降烟碱的提取离子流图；

图3为麦斯明的提取离子流图；

图4为可替宁的提取离子流图；

图5为尼可替林的提取离子流图；

图6为n-甲酰基降烟碱的提取离子流图；

图7为nnk的提取离子流图；

图8为nnn的提取离子流图；

图9为nab的提取离子流图；

图10为nat的提取离子流图；

图11为实施例1中测定口含烟中微量生物碱和亚硝胺的操作流程图。

具体实施方式

下面将结合本发明的具体实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

如图11所示，本实施例的口含烟中微量生物碱和亚硝胺的测定步骤包括：

1)将胶基型口含烟切成厚0.5～1.0mm的片状物体，用分析天平称取分析样本，标记为样本1和样本2，每个样本约1.0g。

将样本1和样本2分别放入10ml规格的萃取釜中，依次加入200μl的内标和20ml作为萃取溶剂的甲醇，然后采用加速溶剂萃取法重复萃取两次，每次萃取5min，萃取温度为50℃；接着，用5ml的甲醇进行淋洗，收集萃取液。其中，内标为麦斯明-d4、可替宁-d3、尼可替林-d9、nnk-d4、nnn-d4、nab-d4和nat-d4，内标浓度为10ug/ml。

静置一段时间后，取约1.5ml上清液加入2ml的含quechers试剂的离心管中，旋涡混合2min，10000rpm离心5min，收集上清液，采用分散固相萃取净化，净化材料可为氧化铝、c18、psa、florisil或carbon。

3)样品分析

取净化后的上清液进行uplc-hr-ms分析，分析上清液中微量生物碱和烟草特有亚硝胺的含量。

超高效液相色谱条件：色谱柱为watersbeh-c18(2.1×50mm,1.7μm)，色谱柱温度为35℃；流动相a为0.2％的乙酸铵水溶液，流动相b为甲醇，进样体积为1μl，流速设为0.25ml/min；梯度洗脱条件设为：0～0.5min：2％b，0.5～4min：2％→98％b，4～7min：98％b，7～8min：98％→2％b，然后平衡2min。

质谱条件：电喷雾离子源(esi)，喷雾电压3.5kv，离子源温度300℃，辅助气体加热温度300℃，鞘气流速35ml/min，辅助气流速为10ml/min，扫描模式为prm正离子模式，仪器分辨率：17500。

质谱中，假木贼碱、降烟碱、麦斯明、可替宁、尼可替林、n-甲酰基降烟碱、nnk、nnn、nab和nat的定量离子对分别为163.1230→118.0653、149.1073→132.0810、147.0917→105.0450、177.1022→80.0500、234.1026→207.0920、177.1022→132.0810、208.1080→122.0602、178.0975→120.0683、192.1131→162.1150和190.0975→106.0528。

本发明的6种微量生物碱(假木贼碱、降烟碱、麦斯明、可替宁、尼可替林和n-甲酰基降烟碱)和4种烟草特有亚硝胺(nnk、nnn、nab和nat)的提取离子流图如图1至图10所示，表1为口含烟中6种微量生物碱和4种烟草特有亚硝胺的测定结果。

表1

实施例2方法学考察

1)标准曲线

以乙腈为溶剂，分别配制不同浓度的微量生物碱和烟草特有亚硝胺的系列标准溶液，采用上述仪器条件分别进行uplc-hr-ms分析。然后采用内标法定量(内标为：麦斯明-d4、可替宁-d3、尼可替林-d9、nnk-d4、nnn-d4、nab-d4和nat-d4)，以各目标物与其内标的峰面积比为纵坐标(y)，各目标物浓度为横坐标(x，ng/ml)进行回归分析，得到6种微量生物碱(假木贼碱、降烟碱、麦斯明、可替宁、尼可替林和n-甲酰基降烟碱)、4种烟草特有亚硝胺(nnk、nnn、nab和nat)的回归方程及其相关系数，如表2所示。

由表2可知，6种微量生物碱和4种烟草特有亚硝胺标准曲线的线性关系良好，r²在0.9914～0.9999之间。将最低浓度的标准溶液稀释并进行uplc-hr-ms分析，以3倍信噪比为方法的检出限(lod)，10倍信噪比为定量限(loq)，6种微量生物碱和4种烟草特有亚硝胺的lod和loq分别为0.25～25ng/g和0.825～82.5ng/g。表明本发明方法具有较高的灵敏度，适合于口含烟中6种微量生物碱和4种烟草特有亚硝胺的快速定量分析。

表2

2)回收率和精密度

取空白口含烟，按低、中、高3种添加水平添加标准溶液，然后按实施例1的样品前处理方法对样品进行处理，每个添加水平平行测定6次，进行回收率和精密度的测定，实验结果见表3。

由表3可知，6种微量生物碱和4种烟草特有亚硝胺的平均加标回收率在79.0％～119％之间，相对标准偏差小于18％，可以满足定量需要。

表3