本发明涉及纳米孔分子分析技术与生物传感器技术领域，特别是涉及一种肿瘤标志物分子检测的方法。
背景技术：
现有的癌症筛查技术可以分为无创影像方法和有创诊断方法，其中无创影像方法包括内诊镜检查、ct扫描、x光谱、超声影像、核磁共振影像等。影像学只能发现直径1~50px（像素）的肿块，这需要肿瘤至少已有５年以上的时间。有创诊断方法，如活检、腹腔镜和针吸细胞检查等。这种方法对病患有直接的伤害，若取出时机不当，还有可能对病患造成二次伤害。目前的诊断方法不适于癌症早期诊断。肿瘤标志物是肿瘤细胞直接产生或由非肿瘤细胞经肿瘤细胞诱导产生的物质。当肿瘤发生、发展时，标志物浓度明显异常，标示着肿瘤的存在。肿瘤标志物检测研究为无创的癌症早期诊断提供新的思路。
1996年，kasianowicz等人（kasianowiczjj,brandine,brantond,etal.characterizationofindividualpolynucleotidemoleculesusingamembranechannel[j].proceedingsofthenationalacademyofsciences,1996,93(24):13770-13773.）提出纳米孔dna测序的思想促使了纳米孔dna测序领域的诞生。纳米孔dna测序的原理是用电场驱动dna在纳米孔内的位置移动，dna物理占位和移动会改变纳米孔内的离子电流，产生阻塞电流信号。再通过测量阻塞电流的幅值与时间特性来辨别不同碱基，从而达到测序的目的。受到纳米孔测序原理的启发，以及纳米孔传感器具有快速检测、单分子级超高灵敏度等独特优势，基于纳米孔的肿瘤标志物检测技术也随之得到发展。纳米孔肿瘤标志物检测的原理与纳米孔测序相似，由阻塞电流反应标志物的特征信息。基于纳米孔传感器的肿瘤标物检测技术已经成为癌症早期诊断的一项重要研究方法。但是，通过纳米孔阻塞电流信号进行肿瘤标志物检测还存在以下两个障碍：
第一，阻塞电流信号种类多，成分复杂。单个生物分子通过空间受限的纳米孔时形态种
类较多，产生与之对应的电流阻塞信号也有多种。以λdna为例，其通过氧化铝纳米孔的形态就有7种（choiye,kwakjw,parkjw.nanotechnologyforearlycancerdetection[j].sensors,2010,10(1):428-455）。
第二，采用计数方法实现待测样本中的癌症标志物分子检测周期长。以肺癌肿瘤标志物microrna-155与其杂化探针p155过孔为例，统计显示过孔时间在毫秒级（ms）。即使在理想情况下，fmol级的microrna-155与其杂化探针p155过孔事件的全部检测最小时间也需要160小时（6.02×108×10-3s）。这严重影响检测的效率与成本。
因此，如何实现基于纳米孔的肿瘤标志物分子检测，是癌症早期检测面临的严峻的挑战。因此，研究纳米孔的肿瘤标志物分子检测方法具有十分重要的意义。
技术实现要素：
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种肿瘤标志物分子检测的方法，用于解决现有纳米孔检测技术的弊端，能有效降低检测方法的复杂程度问题。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种肿瘤标志物分子检测的方法，所述检测方法至少包括步骤：
s1：提供一基板，所述基板为多层纳米孔阵列芯片；
s2：提供一液池，并将所述基板与液池相互组装成纳米孔传感器；
s3：在基板的中间层纳米孔内表面锚定抗体分子；
s4：利用电泳驱动肿瘤标志物分子进入纳米孔阵列，当肿瘤标志物分子被多层纳米孔阵列芯片中的抗体分子所捕获，并产生阻塞电流，根据阻塞电流下降的幅值实现肿瘤标志分子浓度的判定。
可选地，所述s1步骤中将多层纳米孔阵列芯片作为基板，多层纳米孔的中间层为硅纳米孔阵列，硅纳米孔阵列两侧为保护层纳米孔阵列，保护层纳米孔阵列可以全部是氧化硅、氮化硅的其中一种，也可以是两者组合而成的组合物。其中硅纳米孔阵列的孔长度区间为10~500nm，保护层纳米孔阵列的孔长度区间为20~1000nm。
可选地，所述s2步骤中基板与液池组装成纳米孔传感器。所述纳米孔阵列芯片设置于液池的中央位置并将所述液池分间成左右两个区域，所述液池左右两个区域的溶液通过所述纳米孔阵列相互贯穿。
如上所述，本发明提供一种肿瘤标志物分子检测方法。包括：首先提供一多层纳米孔阵列芯片作为基板。然后将基板与液池组装成纳米孔传感器。纳米孔阵列芯片位于液池中央，液池两侧的溶液只能通过纳米孔阵列实现贯穿。接着，在基板中间层硅纳米孔内表面锚定抗体分子。随后，在液池的一侧添加肿瘤标志物分子。最后，利用电泳驱动肿瘤标志物分子进入纳米孔阵列。当肿瘤标志物分子被多层纳米孔阵列芯片中的抗体分子所捕获，并产生阻塞电流。根据阻塞电流下降的幅值实现肿瘤标志分子浓度的判定。
本发明具有以下有益效果：
1.检测方法简单，快速。通过检测纳米孔阵列阻塞电流下降的幅值，判断肿瘤标志物的浓度。此外，检测时间短，提高了检测效率。
2.检测精度高。纳米孔传感器检测精度达到单分子级别。因此，本发明的肿瘤标志物分子检测水平高，适用于癌症早期检测。
附图说明
图1为本发明肿瘤标志物分子检测方法的流程示意图。
图2为本发明中硅纳米孔阵列芯片的结构示意图。
图3为本发明中保护层纳米孔阵列芯片的结构示意图。
图4为本发明中基板的结构示意图。
图5为本发明中纳米孔传感器的结构示意图。
图6为本发明中在基板上设置抗体分子的结构示意图。
图7为本发明液池上设置有电流检测系统的结构示意图。
图8为本发明肿瘤标志物分子检测的方法s4步骤中呈现的检测结果示意图。
图中附图标记说明：
1、纳米孔传感器；2、抗体分子；3、肿瘤标志物分子；4、电流检测系统；10、基板；101、硅纳米孔阵列；102、保护层纳米孔阵列；11、液池。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
需要说明的是，本实施例中所提供的图示仅以示意方式说明本发明的基本构想，遂图式中仅显示与本发明中有关的组件而非按照实际实施时的组件数目、形状及尺寸绘制，其实际实施时各组件的型态、数量及比例可为一种随意的改变，且其组件布局型态也可能更为复杂。
如图1-8所示，本发明提供一种肿瘤标志物分子检测的方法，所述检测方法至少包括步骤：
s1：提供一基板，所述基板为多层纳米孔阵列芯片；
s2：提供一液池，并将所述基板与液池相互组装成纳米孔传感器；
s3：在基板的中间层纳米孔内表面锚定抗体分子；
s4：利用电泳驱动肿瘤标志物分子进入纳米孔阵列，当肿瘤标志物分子被多层纳米孔阵列芯片中的抗体分子所捕获，并产生阻塞电流，根据阻塞电流下降的幅值实现肿瘤标志分子浓度的判定。
一种实施例中，所述s1步骤中将多层纳米孔阵列芯片作为基板，多层纳米孔的中间层为硅纳米孔阵列，硅纳米孔阵列两侧为保护层纳米孔阵列，保护层纳米孔阵列可以全部是氧化硅、氮化硅的其中一种，也可以是两者组合而成的组合物。其中硅纳米孔阵列的孔长度区间为10nm~500nm，保护层纳米孔阵列的孔长度区间为20nm~1000nm。
一种实施例中，所述s2步骤中基板与液池组装成纳米孔传感器。所述纳米孔阵列芯片设置于液池的中央位置并将所述液池分间成左右两个区域，所述液池左右两个区域的溶液通过所述纳米孔阵列相互贯穿。
本发明一种肿瘤标志物分子检测的方法在具体实施时，首先执行步骤s1，提供一基板。如图2-4所示，基板10是由中间层硅纳米孔阵列101以及所述硅纳米孔阵列101两侧为保护层纳米孔阵列102构成的多层结构。所述保护层纳米孔阵列102可以全部是氧化硅或者全部是氮化硅，也可以是氧化硅和氮化硅两者的组合物。其中，所述硅纳米孔阵列101的孔长度为10nm~500nm，所述保护层纳米孔阵列102的孔长度区间为20nm~1000nm。
本实施例中，所述硅纳米孔阵列101的长度选择100nm。所述保护层纳米孔阵列102为氮化硅纳米孔阵列，其长度为200nm。所述所述硅纳米孔阵列101与所述保护层纳米孔阵列102也可以选择要求范围内的其他长度。
然后执行步骤s2，如图5所示，将所述基板10与液池11装成纳米孔传感器1。所述基板10位于所述液池11的中央，所述液池11两侧的溶液只能通过纳米孔阵列实现贯穿。
接着执行步骤s3，如图6所示，在所述基板10的硅纳米孔阵列101表面锚定抗体分子2。
最后执行步骤s4，如图7-8所示，利用电泳驱动肿瘤标志物分子1进入位于所述基板10的硅纳米孔阵列101中，肿瘤标志物分子3被多层纳米孔阵列芯片中的抗体分子2捕获，并产生阻塞电流。根据阻塞电流下降的幅值实现肿瘤标志分子3浓度的判定。阻塞电流下降的幅值i1即为肿瘤标志物分子浓度特征的反映，从而实现肿瘤标志物的检测。
综上所述，本发明提供的一种肿瘤标志物分子检测的方法，解决了前人使用纳米孔检测肿瘤标志物遇到的阻塞电流信号种类多，成分复杂，检测周期长等难题。且本发明提出的肿瘤标志物分子检测的方法易于集成，实现多通道并行检测，提高检测效率。此外，本发明操作简单，具有较好的扩展性和较广的使用范围。所以，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。