本发明涉及一种测定老化程度的方法，一种用于测定老化程度的装置，一种用于测定老化程度的系统，一种用于测定老化程度的试剂盒以及一种评估影响老化程度的物质的方法。
背景技术：
：人体血液代谢物已被充分研究以确定它们的丰度和生物学意义，以及它们作为诊断标记物的潜在用途。对于医学诊断，由于收集和检查它们的简单性，通常使用来自血浆或血清的非细胞代谢物。虽然成熟的人类红细胞(rbc)缺乏细胞核和细胞器(npl1)，但rbc利用糖酵解产生atp，维持氧化还原稳态和渗透调节(npl2)。它们的活跃代谢支持细胞稳态并确保约4个月的寿命(npl3)。它们的代谢物可与血浆的代谢物不同地反映健康状况或环境压力。由于红细胞占总血液体积的约一半(约5升)，它们的代谢物特征几乎未被调查，似乎值得研究。代谢组学是化学生物学的一个分支，使用如液相色谱(lc)-质谱(ms)等技术对细胞和生物体中的代谢物进行分析。代谢组学通常处理<1.5kda的分子，是结合其他综合分析如蛋白质组学和转录组学，研究代谢调控的重要工具。最近我们报道了在人类血液中确认的133种化合物中，101种也在裂殖酵母，粟酒裂殖酵母(schizosaccharomycespombe)中发现了(npl4)，这意味着许多代谢物可能在进化上是保守的。对个体中的一系列化合物进行定量测定，对健康或疾病状况以及营养、药物和压力的影响提供了深刻的见解。此外，有关代谢物个体差异的综合信息可能会影响医学科学的未来(npl5-11)。虽然血液由非细胞(血浆或血清)和细胞成分组成，但大多数人体血液代谢组学研究都集中在血浆或血清，为此现在可以获得大型生物库(血浆、尿液等样品的精选集合)(12-16)。这些研究有助于了解疾病机制并确定疾病的诊断标志物，如糖尿病(npl17)。一些全基因组研究也采用代谢组学(kastenmueller等2015综述(npl18))。相比之下，很少有关于红细胞(rbc)的综合代谢组学报告[例如nishino等2009(npl19)]，尽管红细胞占血液体积的近一半。这部分是因为在稳定化不稳定的细胞代谢物方面存在技术困难(npl20)。引用列表非专利文献npl1:rapoportsm,schewet,&thieleb-j(1990)maturationalbreakdownofmitochondriaandotherorganellesinreticulocytes.inerythroidcells,edharrisjr(springerus),pp151-194.npl2:vanwijkr&vansolingeww(2005)theenergy-lessredbloodcellislost:erythrocyteenzymeabnormalitiesofglycolysis.blood106(13):4034-4042.npl3:baxbe,bainmd,talbotpj,parker-williamsej,&chalmersra(1999)survivalofhumancarriererythrocytesinvivo.clinsci(lond)96(2):171-178.npl4:chaleckisr,etal.(2014)unexpectedsimilaritiesbetweentheschizosaccharomycesandhumanbloodmetabolomes,andnovelhumanmetabolites.molecularbiosystems10(10):2538.npl5:ferniear,tretheweyrn,krotzkyaj,&willmitzerl(2004)metaboliteprofiling:fromdiagnosticstosystemsbiology.natrevmolcellbiol5(9):763-769.npl6:goodacrer,vaidyanathans,dunnwb,harrigangg,&kelldb(2004)metabolomicsbynumbers:acquiringandunderstandingglobalmetabolitedata.trendsbiotechnol22(5):245-252.npl7:hiraimy,etal.(2004)integrationoftranscriptomicsandmetabolomicsforunderstandingofglobalresponsestonutritionalstressesinarabidopsisthaliana.procnatlacadsciusa101(27):10205-10210.npl8:kelldb(2004)metabolomicsandsystemsbiology:makingsenseofthesoup.curropinmicrobiol7(3):296-307.npl9:nicholsonjk&lindonjc(2008)systemsbiology:metabonomics.nature455(7216):1054-1056.npl10:pattigj,yaneso,&siuzdakg(2012)innovation:metabolomics:theapogeeoftheomicstrilogy.natrevmolcellbiol13(4):263-269.npl11:ramautarr,bergerr,vandergreefj,&hankemeiert(2013)humanmetabolomics:strategiestounderstandbiology.curropinchembiol17(5):841-846.npl12:dunnwb,etal.(2015)molecularphenotypingofaukpopulation:definingthehumanserummetabolome.metabolomics11:9-26.npl13:guertinka,etal.(2014)metabolomicsinnutritionalepidemiology:identifyingmetabolitesassociatedwithdietandquantifyingtheirpotentialtouncoverdiet-diseaserelationsinpopulations.amjclinnutr100(1):208-217.npl14:lawtonka,etal.(2008)analysisoftheadulthumanplasmametabolome.pharmacogenomics9(4):383-397.npl15:psychogiosn,etal.(2011)thehumanserummetabolome.plosone6(2):e16957.[npl16:yuz,etal.(2012)humanserummetabolicprofilesareagedependent.agingcell11(6):960-967.npl17:suhrek(2014)metabolicprofilingindiabetes.jendocrinol221(3):r75-85.npl18:kastenmullerg,rafflerj,giegerc,&suhrek(2015)geneticsofhumanmetabolism:anupdate.hummolgenet24(r1):r93-r101.npl19:nishinot,etal.(2009)insilicomodelingandmetabolomeanalysisoflong-storederythrocytestoimprovebloodstoragemethods.jbiotechnol144(3):212-223.npl20:gila,etal.(2015)stabilityofenergymetabolites-anoftenoverlookedissueinmetabolomicsstudies:areview.electrophoresis36(18):2156-2169.npl21:pluskalt,nakamurat,villar-brionesa,&yanagidam(2010)metabolicprofilingofthefissionyeasts.pombe:quantificationofcompoundsunderdifferenttemperaturesandgeneticperturbation.molbiosyst6(1):182-198.技术实现要素：技术问题本发明的一个目的是提供一种能够简单而准确地测定老化程度的新方法。问题的解决方案存在于人血液中的代谢物记录了受遗传、表观遗传和生活方式因素影响的个体生理状态。使用高分辨率液相色谱-质谱(lc-ms)，我们在15名年轻(29±4岁)和15名老年人(81±7岁)的血液中进行了非靶向定量代谢组学分析。获得了所有30个捐助者的126种血液代谢物的变异系数(cv＝标准偏差/平均值)。这里强调了55种rbc中富含的代谢物，其代谢组学研究很少。我们发现有43种血液化合物显示出与年龄相关的显著增加或减少。其中18种是红细胞中富含的，表明红细胞代谢组学对人体老化研究具有重要价值。年龄差异的部分原因是老年人抗氧化剂产生减少或尿素代谢效率低下。pearson的系数表明，一些与年龄相关的化合物是相关的，这表明老化会同时影响它们。虽然我们的cv值与之前发表的大致一致，但我们在此报告了51种血液化合物的新cv。具有中等至高cv值(0.4-2.5)的化合物经常被修饰。具有低cv值的化合物如atp和谷胱甘肽可能与各种疾病有关，因为它们的浓度受到严格控制，并且它们的变化会危害健康。因此，人类血液是关于个体代谢差异的丰富信息来源。在这项研究中，我们提出了一种用于测定老化程度的新方法，其中血液代谢物作为指标。本发明的方法简单而准确。本发明如下。[1]一种测定老化程度的方法，其中血液代谢物作为指标。[2]根据[1]所述的用于测定老化程度的方法，其中来自受试者的全血或红细胞作为样本，并且样本中的血液代谢物作为指标。[3]根据[2]所述的用于测定老化程度的方法，其中所述样本在出血后立即用冷有机溶剂处理。[4]根据[1]-[3]中任一项所述的用于测定老化程度的方法，其中所述血液代谢物包含选自由二硫化谷胱甘肽(gssg)、utp、酮(异)亮氨酸、n-乙酰精氨酸、1,5-脱水葡萄糖醇、乙酰肌肽、瓜氨酸、二甲基鸟苷、肌肽、udp-乙酰葡萄糖胺、亮氨酸、n2-乙酰赖氨酸、视晶酸、泛酸、n6-乙酰赖氨酸、nad+、cdp-胆碱、甘油磷酸胆碱、组氨酸、苯丙氨酸、磷酸肌酸、酪氨酸、异亮氨酸、nadp+、磷酸戊糖、s-腺苷高半胱氨酸、cdp-乙醇胺、肌酸、ctp、果糖-6-磷酸、甘油磷酸、丝氨酸、色氨酸、udp-葡萄糖、腺苷、天冬氨酸、二甲基精氨酸、二磷酸甘油酸、葡萄糖-6-磷酸、谷氨酸、戊二酸、n-乙酰-(异)亮氨酸和酮碱组成的组中的至少一种代谢物。[5]根据[1]-[3]中任一项所述的用于测定老化程度的方法，其中所述血液代谢物包含选自由二硫化谷胱甘肽(gssg)、utp、酮(异)亮氨酸、n-乙酰精氨酸、1,5-脱水葡萄糖醇、乙酰肌肽、瓜氨酸、二甲基鸟苷、肌肽、udp-乙酰葡萄糖胺、亮氨酸、n2-乙酰赖氨酸、视晶酸、泛酸、n6-乙酰赖氨酸、nad+、cdp-胆碱、甘油磷酸胆碱、组氨酸、苯丙氨酸、磷酸肌酸、酪氨酸、异亮氨酸、nadp+、磷酸戊糖和s-腺苷高半胱氨酸组成的组中的至少一种代谢物。[6]根据[1]-[3]中任一项所述的用于测定老化程度的方法，其中所述血液代谢物包含选自由二硫化谷胱甘肽(gssg)、utp、酮(异)亮氨酸、n-乙酰精氨酸、1,5-脱水葡萄糖醇、乙酰肌肽、瓜氨酸、二甲基鸟苷、肌肽、udp-乙酰葡萄糖胺和亮氨酸组成的组中的至少一种代谢物。[7]一种用于测定老化程度的装置，其中老化程度通过根据[1]-[6]中任一项所述的方法测定。[8]一种用于测定老化程度的装置，其包括用于输入的装置和用于测定的装置，其中将受试者的血液代谢物的数据输入到所述用于输入的装置，并且通过比较受试者的数据和人口数据来测定老化程度。[9]一种用于测定老化程度的系统，其中老化程度通过根据[1]-[6]中任一项所述的方法或根据[7]或[8]中所述的装置来测定。[10]一种评估影响老化程度的物质的方法，其包括测量血液代谢物的步骤，其中血液代谢物包含选自由二硫化谷胱甘肽(gssg)、utp、酮(异)亮氨酸、n-乙酰精氨酸、1,5-脱水葡萄糖醇、乙酰肌肽、瓜氨酸、二甲基鸟苷、肌肽、udp-乙酰葡萄糖胺、亮氨酸、n2-乙酰赖氨酸、视晶酸、泛酸、n6-乙酰赖氨酸、nad+、cdp-胆碱、甘油磷酸胆碱、组氨酸、苯丙氨酸、磷酸肌酸、酪氨酸、异亮氨酸、nadp+、磷酸戊糖、s-腺苷高半胱氨酸、cdp-乙醇胺、肌酸、ctp、果糖-6-磷酸、甘油磷酸、丝氨酸、色氨酸、udp-葡萄糖、腺苷、天冬氨酸、二甲基精氨酸、二磷酸甘油酸、葡萄糖-6-磷酸、谷氨酸、戊二酸、n-乙酰-(异)亮氨酸和酮碱组成的组中的至少一种代谢物。[11]一种用于通过使用根据[1]-[6]中任一项所述的方法测定老化程度的试剂盒，其包括血液采集管和作为检测标准的血液代谢物化合物。发明的有益效果人体血液提供了丰富的代谢物信息来源，反映了健康、疾病、饮食和生活方式的个体差异。经过精心准备后，对红细胞或血浆富含的人体血液代谢物的变异系数进行了量化。我们能够确认43种与年龄相关的代谢物。在老年人中显著下降的代谢物包括抗氧化剂和涉及高体力活动的代谢物。老年人显著增加的代谢物包括与肾功能和肝功能下降有关的代谢物。统计分析表明，老年人中某些与年龄相关的化合物增加或减少是相关的。血液代谢物的个体差异可能导致识别人类老化或相关疾病的标志物。基于这些发现的本发明提供了一种能够简单且准确地测定老化程度的新方法。附图说明[图1]126种人体血液代谢物的cv谱概述。a.126种具有六个不同范围变异系数(cv30)的血液化合物。上面板，<0.3，0.3～0.4；下面板，0.4～0.5，0.5～0.7，0.7～1.0，1.0～2.5)。最低cv30(<0.3)组包含28种化合物。rbc中富含的化合物以灰色突出显示。由峰面积表示的化合物丰度：红色，峰面积高的化合物(>108au)；绿色，中等峰面积(108～107au)；蓝色，低峰面积(<107au)。先前未在文献中报道过cv的化合物标有下划线。蓝色框中的数字表示在一个cv范围内列出的所有化合物，而红色框中的数字表示此处报道的cv为新的化合物。b.低变异组和高变异组中化合物数的概述。[图2]由结构或功能定义的人血液代谢物簇显示出类似的cv。来自所有30名志愿者的血液数据揭示，几组化合物的pearson相关系数>0.7。在这些簇中有与麦角硫因(a)、糖酵解途径代谢物(b)和甲基化合物(c)相关的化合物。成对化合物之间的pearson相关系数显示在面板的右上角。在左下角，绘制每对的实际化合物水平。[图3]必需代谢物几乎不变，而修饰代谢物(例如甲基化氨基酸)变化很大。atp(a)、谷胱甘肽二硫化物(gssg)(b)、二磷酸甘油酸(c)、葡萄糖-6-磷酸(d)、三甲基-组氨酸(e)、udp-乙酰葡萄糖胺(f)、4-胍基丁酸(g)、三甲基-色氨酸(h)在30个个体血液中的分布。黑色、橙色和天蓝色圆点分别代表所有人、老年人和年轻人。每组代谢物的峰面积分成10个区。误差线表示平均值±sd。[图4]鉴定年轻人(29±4岁)和老年人(81±7)之间丰度不同的一些血液代谢物。1,5-脱水葡萄糖醇(a)、视晶酸(b)、乙酰肌肽(c)和肌肽(d)在年轻受试者中较高，而瓜氨酸(e)、泛酸(f)、二甲基鸟苷(g)n-乙酰精氨酸(h)在老年人中较高。每组代谢物的峰面积分成10个区。误差线表示平均值±sd。年龄组之间的p值在0.022和0.00039之间。[图5]该图显示出许多人类血液代谢物表现出昼夜恒定性。对于绝大多数126种化合物，4名志愿者中昼夜丰度的波动可以忽略不计。a.与大多数化合物一样，atp和麦角硫因的峰值水平几乎没有变化。然而，麦角硫因的丰度因人而异。此外，约10种化合物，包括甘氨酸脱氧胆酸盐、十四酰肉碱、4-氨基苯甲酸盐和咖啡因，显示出异常的24小时变化。b.从30个单独的代谢组测定的两种示例化合物(丁基甜菜碱和甘油醛-3-磷酸(g-3-p))的原始丰度数据，均在rbc中富含，显示为点图(每个点代表一个单独的个体)。丁基甜菜碱和g-3-p的变异系数分别为0.35和0.99。最大丰度与最小丰度的比值分别为3.7和29。每组代谢物的峰面积分为10个区。误差线表示平均值±sd。[图6]该图显示出代谢物测量的实验可变性非常小。126种化合物的cv分布为(a)cvwi：3次注射相同的血液样本制剂；(b)cvss：来自相同血液的3个独立制备的样本。(c)来自所有30个血液样本的每种化合物的变异系数(cv30)。大多数化合物显示出可忽略不计的cvwi，而对于某些代谢物，cvss更多变，而且相当高。[图7]该图显示了cdp-胆碱、udp-葡糖醛酸、磷酸肌酸和4-氨基苯甲酸盐的变化。a和b.两种中等可变代谢物，cdp-胆碱和udp-葡糖醛酸，是两个年龄组之间可能不同的候选化合物。这些化合物用于生物合成，可能反映了年轻人更高的活动水平。每组代谢物的峰面积分为10个区。误差线表示平均值±sd。c.磷酸肌酸在个体中表现出中度变异，但年轻人和老年人之间没有显着差异。每组的峰面积分为10个区。误差线表示平均值±sd。d.4-氨基苯甲酸盐在个体中变化很大。每组的峰面积分为10个区。误差线表示平均值±sd。[图8]该图显示了其他代谢物显示出年轻组和老年组之间不同的丰度模式。nad+(a)、nadp+(b)、亮氨酸(c)、异亮氨酸(d)在年轻时期表现出较高水平。n6-乙酰赖氨酸在老年人中更高(e)。每组代谢物的峰面积分成10个区。误差线表示平均值±sd。p值的范围是0.0017-0.046。[图9]该图显示了所有14种与年龄相关的人类血液化合物的相关值。具体实施方式在详细描述本发明之前，应理解本发明不限于所描述的特定方法、装置和系统，因为这种方法、装置和系统当然可以变化。还应理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施方式的目的，并不意图限制本发明的范围。除非另有定义或上下文另有明确规定，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管与本文描述的那些类似或等同的任何方法和材料可用于本发明的实践或测试，但现在描述优选的方法和材料。本文提及的所有出版物在此引入作为参考，以便公开和描述引用该参考文献的特定材料和方法。此处讨论的出版物仅仅是为了它们在本申请的提交日之前的公开内容而提供的。本文中的任何内容均不应被解释为承认本发明无权凭借在先发明而提前披露。定义术语“老化程度”在本文中用于指老化程度或老化指数。它是指示受试者的衰老速度是早于还是晚于平均值的值。术语“血液代谢物”在本文中用于指血液成分中包含的参与生物代谢活性的低分子化合物。应理解，本文描述的本发明的方面和实施方式包括“由......组成”和/或“基本上由方面和实施方式组成”。从以下结合附图的说明，本发明的其他目的、优点和特征将变得显而易见。一种测定老化程度的方法根据本发明，通过使用受试者中的特定血液代谢物作为指标来评估老化程度。通过测量受试者的全血、红细胞或血浆中的特定血液代谢物的量，可以测定定受试者的衰老程度(老化程度)。这里，用于测定受试者的老化程度的样本可以是选自由全血、红细胞和血浆组成的组成中的至少一种。优选使用全血或红细胞。更优选使用全血、红细胞和血浆中的任何两种。最优选使用全血、红细胞和血浆作为样本。作为本发明中的血液代谢产物，优选该化合物在老年人和年轻人群之间具有较大的血液含量差异。血液代谢物包含选自由二硫化谷胱甘肽(gssg)、utp、酮(异)亮氨酸、n-乙酰精氨酸、1,5-脱水葡萄糖醇、乙酰肌肽、瓜氨酸、二甲基鸟苷、肌肽、udp-乙酰葡萄糖胺、亮氨酸、n2-乙酰赖氨酸、视晶酸、泛酸、n6-乙酰赖氨酸、nad+、cdp-胆碱、甘油磷酸胆碱、组氨酸、苯丙氨酸、磷酸肌酸、酪氨酸、异亮氨酸、nadp+、磷酸戊糖、s-腺苷高半胱氨酸、cdp-乙醇胺、肌酸、ctp、果糖-6-磷酸、甘油磷酸、丝氨酸、色氨酸、udp-葡萄糖、腺苷、天冬氨酸、二甲基精氨酸、二磷酸甘油酸、葡萄糖-6-磷酸、谷氨酸、戊二酸、n-乙酰-(异)亮氨酸和酮碱组成的组中的至少一种代谢物。二硫化谷胱甘肽(gssg)、utp、酮(异)亮氨酸、1,5-脱水葡萄糖醇、乙酰肌肽、肌肽、udp-乙酰基葡糖胺、亮氨酸、视晶酸、nad+、cdp-胆碱、甘油磷酸胆碱、组氨酸、磷酸肌酸、异亮氨酸、nadp+、磷酸戊糖、s-腺苷高半胱氨酸、cdp-乙醇胺、ctp、果糖-6-磷酸、丝氨酸、色氨酸、udp-葡萄糖、腺苷和酮碱在老年人中较低。因此，当这些化合物的含量低于标准时，判断受试者的老化程度较高。另一方面，n-乙酰精氨酸、瓜氨酸、二甲基鸟苷、n2-乙酰赖氨酸、泛酸、n6-乙酰赖氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、肌酸、甘油磷酸、天冬氨酸、二甲基精氨酸、二磷酸甘油酸、葡萄糖-6-磷酸、谷氨酸、戊二酸和n-乙酰-(异)亮氨酸在老年人中较高。因此，当这些化合物的含量高于标准时，判断受试者的老化程度较高。优选地，血液代谢物包含选自由二硫化谷胱甘肽(gssg)、utp、酮(异)亮氨酸、n-乙酰精氨酸、1,5-脱水葡萄糖醇、乙酰肌肽、瓜氨酸、二甲基鸟苷、肌肽、udp-乙酰葡萄糖胺、亮氨酸、n2-乙酰赖氨酸、视晶酸、泛酸、n6-乙酰赖氨酸、nad+、cdp-胆碱、甘油磷酸胆碱、组氨酸、苯丙氨酸、磷酸肌酸、酪氨酸、异亮氨酸、nadp+、磷酸戊糖和s-腺苷高半胱氨酸组成的组中的至少一种代谢物。更优选地，根据权利要求1-3中任一项所述的用于测定老化程度的方法，其中所述血液代谢物包含选自由二硫化谷胱甘肽(gssg)、utp、酮(异)亮氨酸、n-乙酰精氨酸、1,5-脱水葡萄糖醇、乙酰肌肽、瓜氨酸、二甲基鸟苷、肌肽、udp-乙酰葡萄糖胺和亮氨酸组成的组中的至少一种代谢物。为了获得更准确的老化程度的测定结果，优选分析多种血液代谢物。本发明用于测定老化程度的方法包括(i)制备样本的步骤，(ii)分析步骤和(iii)测定老化程度的步骤。(i)准备样本的步骤可以如先前报道的那样制备代谢组学样本(npl4)。所有血样均在医院实验室抽取，以确保快速准备样本。简言之，将用于代谢组学分析的静脉血液样本置于5ml肝素化管(terumo)中。在-20℃～-80℃(优选在-40℃～-50℃)下，立即将0.1～1.0ml血液(4～60×108rbc)在5～10倍血液体积的30～70％甲醇(优选50～60％)中淬火。采血后立即进行快速淬火步骤，确保了许多不稳定代谢物的准确测量。全血样本的使用也使我们能够观察细胞代谢物水平，否则可能会受到冗长的细胞分离程序的影响。在聚蔗糖(ficoll)分离或过滤白细胞减少期间，血细胞长时间暴露于非生理条件下(npl4)。将来自每个捐助者的剩余血液样本在室温下以120g离心15分钟以分离血浆和rbc。离心后，在-20～-80℃(优选-40℃～-50℃)下，将分离的血浆和rbc(7-100×108rbc)各0.1～1.0ml，在5～10倍血液体积的30～70％甲醇(优选50～60％)中淬火。每个样本中加入两种内标(10nmol的hepes和pipes)。在短暂的涡旋后，将样本转移至amiconultra10-kda截止过滤器(millipore，billerica，ma，usa)以除去蛋白质和细胞碎片。因此，从每个血液样本中，制备三种不同的子样本，全血、rbc和血浆。白细胞含量(wbc)小于我们制剂中细胞体积的1％(npl4)。使用ficoll梯度对wbc进行全代谢组学分析，证实wbc不应影响我们目前关于rbc的代谢组学结果。通过真空蒸发浓缩样本后，将每个样本重悬于40μl50％乙腈中，并且每次注入lc-ms系统使用1μl。(ii)分析步骤在该步骤中分析受试者样本中血液代谢物的含量。如前所述(npl21)，lc-ms数据优选使用与ltqorbitrap质谱仪(thermofisherscientific，waltham，ma，usa)偶联的paradigmms4hplc系统(michrombioresources，auburn，ca，usa)获得。简而言之，在zic-philic柱(mercksequant，umea，sweden；150mm×2.1mm，5μm粒径)上进行lc分离。hilic色谱柱对于分离许多亲水性血液代谢物非常有用，这些代谢物之前未经其他检测(npl4)。使用乙腈(a)和10mm碳酸铵缓冲液，ph9.3(b)，作为流动相，以100μlml-1的流速在30分钟内从80-20％a梯度洗脱。使用mzmine2软件测量感兴趣的代谢物的峰面积(87)。先前已经描述了详细的数据分析程序和参数(npl21)。代谢组学数据存储放在metabolights数据库中(参见数据可用性)。(iii)测定老化程度的步骤我们分析了126种通过标准或ms/ms分析确认的血液化合物(npl4)。对于每种代谢物，我们选择单电荷，[m+h]+或[m-h]-，峰(表1)。根据他们的峰面积，代谢物分为3组(h，m和l)。h表示具有高峰面积(>108au)的化合物，m具有中峰面积(108～107au)和l具有低峰面积(<107au)。如先前报道，相同摩尔浓度的一些标准品，例如amp和atp，以不同的效率电离，从而影响其峰面积的量化(npl21)。因此，在某些情况下，由于某些化合物在纯样本和代谢物样本混合物之间的不同电离效率，峰面积不能可靠地转换成实际摩尔量。然而，在该研究中，峰面积单独不同的相对比率与获得cv相关，因此不需要化合物的实际摩尔浓度。实验程序的验证如下进行。首先，我们评估样本处理对样本内变异的贡献。将相同的血液样本制备以80分钟的间隔注入lc-ms中3次(图6a)。因此，我们获得样本内的cv(指定为cvwi)，其在126种化合物中的107种(85％)中小于0.1。只有10种化合物显示cvwi为0.1-0.2，而9种cvwi>0.2(表1)。大多数可变化合物属于低峰区(l)组，这表明一些低丰度化合物在lc-ms过程中可能不稳定。然而，这些化合物的纯标准的lc-ms测量显示出更低的cv(数据未显示)，这意味着它们的不稳定性是由于在lc-ms测量之前与其他血液化合物或溶剂的反应。其次，我们还检查样本制备引起的样本间差异。从相同的血液样本(一个人)独立地制备三个样本，并且由此确定的cv被指定为cvss(图6b)。血液样本中hepes和pipes的cvss值非常小(hepes为0.06～0.08，pipes为0.04～0.08)。绝大多数(116/126＝92％)的cvss<0.3(表1)。在cvss>0.3的10种化合物中，9种化合物属于低峰面积(l)组。具有m峰面积的维生素烟酰胺的cvss＝0.47。然而，三次注射烟酰胺标准的cv＝0.05。对于其他9种化合物，如ump和1-甲基鸟苷，观察到类似的情况，具有高cvss值。血液中这10种化合物的cv可能受样本制备的影响，或者它们可能在样本制备过程中与其他代谢物发生反应。第三，我们从所有30名志愿者(cv30)获得每种血液化合物的cv(表1，图6c)。cv30分为6个不同的值范围(图1a)。mzml格式的原始lc-ms数据可通过metabolights存储库(url：http：//www.ebi.ac.uk/metabolights)访问。来自相同样本的三次注射和来自相同捐献血液制备的3个样本的数据可以在登录号mtbls263下获得。在24小时内从四名志愿者抽取4次的血液样本可以在登录号mtbls264下获得。来自所有30名受试者的全血代谢组学数据可以在登录号mtbls265下获得。来自所有30名受试者的血浆和rbc数据可分别在mtbls266和mtbls267下找到。测定本发明的老化程度的方法没有特别限制，只要其使用上述代谢物作为指标即可。以下方法仅作为一个例子来示例。基于由老化标记物的定量值(峰面积)和日历年龄的曲线图得到的标准曲线，可以从受试者的老化标记物的数据测定年龄分数(计算值)。老化程度可以通过与日历年龄的差异来测定。例如，当将代谢物的年龄分数除以日历年龄并乘以100时，年轻倾向被判断低于100并且老年倾向被判断高于100。装置本发明提供了一种用于测定老化程度的装置。该装置使用上述本发明的方法。本发明的用于测定老化程度的装置包括用于输入的装置和用于测定的装置，其中将受试者的血液代谢物的数据输入到所述用于输入的装置，并且通过比较受试者的数据和人口数据来测定老化程度。可以参考所述方法部分以获得该装置使用的本发明方法的细节。系统本发明提供了一种用于测定老化程度的系统。老化程度通过上述本发明的方法或上述本发明的装置测定。可以参考所述方法部分和装置部分以获得本发明系统的细节。方法本发明提供评估影响老化程度的物质的方法，包括测量血液代谢物的步骤，其中血液代谢物包含选自由二硫化谷胱甘肽(gssg)、utp、酮(异)亮氨酸、n-乙酰精氨酸、1,5-脱水葡萄糖醇、乙酰肌肽、瓜氨酸、二甲基鸟苷、肌肽、udp-乙酰葡萄糖胺、亮氨酸、n2-乙酰赖氨酸、视晶酸、泛酸、n6-乙酰赖氨酸、nad+、cdp-胆碱、甘油磷酸胆碱、组氨酸、苯丙氨酸、磷酸肌酸、酪氨酸、异亮氨酸、nadp+、磷酸戊糖、s-腺苷高半胱氨酸、cdp-乙醇胺、肌酸、ctp、果糖-6-磷酸、甘油磷酸、丝氨酸、色氨酸、udp-葡萄糖、腺苷、天冬氨酸、二甲基精氨酸、二磷酸甘油酸、葡萄糖-6-磷酸、谷氨酸、戊二酸、n-乙酰-(异)亮氨酸和酮碱组成的组中的至少一种代谢物。通过该评估方法发现的物质可广泛用作抗老化食品、饮料、补充剂、药品和化妆品等。可以参考“用于测定老化程度的方法”的部分以获得测量血液代谢物的步骤的细节。试剂盒本发明提供了一种通过使用本发明的方法测定老化程度的试剂盒，其包含血液采集管和作为检测标准的血液代谢物化合物。除了血液采集管等之外，本发明的试剂盒可以包括任何组成元件。作为检测标准的血液代谢物化合物可选自由二硫化谷胱甘肽(gssg)、utp、酮(异)亮氨酸、n-乙酰精氨酸、1,5-脱水葡萄糖醇、乙酰肌肽、瓜氨酸、二甲基鸟苷、肌肽、udp-乙酰葡萄糖胺、亮氨酸、n2-乙酰赖氨酸、视晶酸、泛酸、n6-乙酰赖氨酸、nad+、cdp-胆碱、甘油磷酸胆碱、组氨酸、苯丙氨酸、磷酸肌酸、酪氨酸、异亮氨酸、nadp+、磷酸戊糖、s-腺苷高半胱氨酸、cdp-乙醇胺、肌酸、ctp、果糖-6-磷酸、甘油磷酸、丝氨酸、色氨酸、udp-葡萄糖、腺苷、天冬氨酸、二甲基精氨酸、二磷酸甘油酸、葡萄糖-6-磷酸、谷氨酸、戊二酸、n-乙酰-(异)亮氨酸和酮碱组成的组。红细胞代谢组学。使用lc-ms进行人类血液的非靶向代谢组学(npl4)，以使用变异系数(cv)评估健康受试者之间的个体差异。我们的技术包括快速淬火样本、不进行离心的全血分析和使用hilic色谱柱，部分解释了为什么我们成功地鉴定了许多代谢物的迄今未报道的cv。我们强调了红细胞代谢组学的重要性。这不仅仅是因为这种研究的稀缺性，而是因为rbc起着如此重要的作用。例如，血液中丰富的抗氧化剂，例如谷胱甘肽，仅在超过1000x的rbc中富集。此外，我们显示，与抗氧化剂相关的视晶酸和肌肽都在rbc中富含，且它们丰度似乎与年龄有关。因此，rbc似乎在血液中的抗氧化中起重要作用。用于能量产生的许多细胞化合物，例如糖磷酸盐、核苷酸和核苷酸-糖衍生物在rbc中富含。由于一半的血液体积被红细胞所占据，因此红细胞代谢组学可能与血浆一样重要，以了解人体血液的多种功能。具有高cv的血液代谢物作为个人标记物。我们鉴定了48种代谢物，显示出中等至极高的cv30(0.5～2.3)。据我们所知，22种这些化合物的cv以前没有报道过。在大多数情况下，这些化合物不会在等位基因基础上波动；因此，我们假设个体差异可能反映(epi)遗传差异或慢性状态。为了充分发掘它们作为个人标记物的潜力，需要进一步研究这些化合物的生理作用。具有低cv的化合物可以支持体内生理稳态。实际上，在许多疾病中报道了异常的谷胱甘肽水平，例如帕金森病、hiv、肝病和囊肿性纤维化以及老化。据报道，许多疾病与亮氨酸、缬氨酸和异亮氨酸的降解途径有关。因此，低cv化合物可能是健康标记物的良好候选者。老年人血液中某些与年龄相关的化合物的增加。我们对年轻受试者和老年受试者之间的人体血液(包括红细胞)的代谢组学比较，揭示了14种与年龄相关的化合物。它们中的6种在rbc中富含。我们对14种化合物中的3种(1,5-脱水葡萄糖醇、泛酸、瓜氨酸)的cv30结果证实了之前的研究：1,5-脱水葡萄糖醇在年轻人中更高(57)，而泛酸和瓜氨酸在健康的老年人中更丰富(14,79)。我们的方法设计可能有助于我们识别这些具有统计学意义的新方面，尽管这项研究的人口并不多(n＝30)。从研究中排除中年人(40～70岁)使我们两组之间的年龄差异更明显。还一次集中分析样品以进行精确测量。其余8种新型年龄相关的11种化合物在老年受试者中较低。我们的研究结果表明，老年受试者的血液中显示出与抗氧化剂(视晶酸、肌肽等)和氧化还原代谢物(nad+，nadp+)以及支持肌肉维持和强化的化合物(亮氨酸、异亮氨酸)相关的一些化合物水平降低。相反，老年人中3种在血浆中富含的化合物(n-乙酰精氨酸，二甲基鸟苷和n6-乙酰赖氨酸)增加。尿素循环的副产物n-乙酰精氨酸和瓜氨酸可能由于该循环的效率受损而增加。的确，已知尿素循环酶的缺乏会导致这些化合物的积累(78,80)。已知二甲基鸟苷在尿毒症患者的血浆中增加(56)。这些结果表明，肝脏或肾功能的逐渐、渐进性衰退在老年人中可能是典型的，导致这些血液代谢物逐渐升高。支持老年人剧烈活动的某些化合物减少。还值得注意的是，在rbc分析中鉴定了几种与年龄相关的化合物，包括肌肽。肌肽(β-丙氨酰-l-组氨酸)，一种可能的氧化剂清除剂，高度集中在肌肉和大脑中(81)。我们的数据表明肌肽是rbc中富含的高度可变代谢物。这些发现使我们能够重新考虑rbc在血液中的生理作用。rbc还可以用于将肌肽和其他代谢物运输到远处组织。一致地乙酰肌肽，能抗降解(82)，在血浆中富含。30名受试者中的rbc/血浆比率为10.8(肌肽)和0.13(乙酰肌肽)。肌肽明显在rbc中富含，而乙酰肌肽显然是血浆化合物。我们的研究表明，这两种化合物都在老年人中下降。进一步研究以阐明肌肽在红细胞中的作用是相当令人感兴趣的。抗氧化剂，以及与血液中的能量和细胞维持相关的化合物。在青年期间进行剧烈活动所需的化合物可能在老年人中下降。视晶酸与谷胱甘肽相关，并且两者都由相同的生物合成酶产生。因此认为视晶酸与抗氧化剂有关；它也在老年人中减少。udp-乙酰葡萄糖胺的水平在年轻人中比在老年人中高2倍。这种化合物在蛋白多糖和糖脂合成过程中细胞信号传导和核孔形成所必需的(83)。这些功能与抗氧化剂和细胞维持化合物的合成随年龄下降的假设是一致的。一致地，亮氨酸、异亮氨酸、nad+和nadp+，其在年轻时更丰富，可能表明当体力活动较高时，这些化合物在体内，特别是在肌肉中更剧烈地消耗(84,85)。尚不清楚这些化合物中的较低水平是否会导致肌肉减少和可能的大脑活动减少，或者它们是否反映出活动减少。可能需要氧化剂的清除剂来恢复rbc中与能量有关的生化反应(86)。人类代谢组学的未来前景。值得注意的是，这43种与年龄相关的化合物中的38种(除了1,5-脱水葡萄糖醇、肌肽、肌酸，磷酸肌酸和乙酰肌肽)也存在于裂殖酵母中。在不久的将来，这些化合物在裂殖酵母和其他生物体中的遗传，可能有助于剖析它们的生理和细胞学意义。如果是这样，目前对rbc、血浆和全血的分析将支持人体代谢组学的发展。可以认为本发明中发现的43种血液代谢物与老化相关疾病相关。基于这些代谢物的血液水平作为指标，可以确定疾病的风险，疾病的状态，对疾病的易感性等。以下疾病可以作为所述疾病的示例。与生活方式相关的疾病(如动脉粥样硬化、高血压、2型糖尿病、米利都(miletus)、更年期、骨质疏松症、癌症)；神经障碍(如脑梗塞、阿尔茨海默病、痴呆、帕金森综合症)，眼病(如白内障、青光眼、年龄相关性黄斑变性、老花眼、干眼症)，耳鼻喉科疾病(如听力障碍、慢性甲状腺炎、口腔干燥症)，血液病(如恶性淋巴瘤、白血病、贫血症)，心脏病(如缺血性心脏病、心肌梗塞、心力衰竭、心绞痛、急性冠状动脉综合征)；肺病(如copd(慢性阻塞性肺病)、肺纤维化)，消化系统疾病(如萎缩性胃炎、肝硬化、脂肪肝、肝功能不全)，肾脏和泌尿系统疾病(如尿失禁、迟发性性腺功能减退症、慢性肾功能衰竭、前列腺肥大)，肌肉骨骼疾病(如关节炎、机车综合症、肌肉减少症、腰痛、关节疼痛、虚弱)，营养不良，早衰，沃纳综合征等等。实施例实施例的总结如下。我们在一项有三个不同方面的研究中报告了30个人的血液代谢物。我们分析了126种血液代谢物，这些代谢物通过标准或ms/ms分析确认(npl4)。对于每种代谢物，我们选择单电荷，[m+h]+或[m-h]-，峰(表1)。我们从rbc、血浆和全血中收集样本进行代谢组学分析。将目前的定量数据与先前从rbcs中仔细分离的rbcs和白细胞(wbc)的分析(npl4)相结合，我们现在对在rbc中富含的代谢物有了充分的了解。在rbc中富含的代谢物可能与血浆代谢物不同地反映健康状况或环境压力。其次，为了量化个体差异，我们采用了一个简单的参数，指定为每种血液化合物的变异系数(cv)。cv是代谢物丰度(来自lc-ms的峰面积)的标准偏差(sd)除以平均值的比率。对于稳定且相对不变的代谢物，sd和cv很低或可忽略不计，而可变代谢物的cv可用于评估个体间的代谢物变异。使用lc-ms分析来自30名志愿者的rbc和血浆代谢物(npl4,21)。hepes和pipes作为内标加入所有血液样本中。任何显着大于hepes和pipes的化合物的cv都可以是分析个体代谢物变异的候选者。第三，对年轻志愿者和老年志愿者之间的血液代谢组进行了比较，重点是rbc代谢物，其很少被视为年龄分析的目标。我们能够确定总共43种与老化相关的统计学代谢物。其中有四个是先前报道的，但我们相信其他迄今为止没有被报道。我们讨论了有关人类老化的我们的发现。表1-1表1.126种确认的血液代谢物a的列表表1-2表1-3表1-4表1-5显示了通过lc-ms检测的126a种化合物和2个标准。具有单个星号的化合物显示样本内变异(cvwi)＝0.1-0.2，而没有星号表示cvwi小于0.1。那些有两个星号的cvwi＞0.2。与血浆相反，特别在rbc中富含的化合物用(x)表示。先前在文献(x)中报道的化合物浓度显示(数据集s1中的参考文献)。化合物丰度(峰面积)表示为(h-m-高-中，l-低)。来自相同血液样本的三种制剂之间的变异系数被命名(cvss)。10种化合物的cvss值＞0.3，23种化合物的cvss值＞0.2(以粗体突出显示)。在图1中总结了30名受试者(cv30)中每种化合物的变异系数，并且大致与文献中的其他值相对应。先前已经报道了cv的化合物用(x)示出。cv30值＞0.4以粗体突出显示。年轻受试者和老年受试者之间的化合物水平被认为显着不同，p＜0.05。原始数据存储在metabolights数据库中(参见数据可用性)。道德声明根据赫尔辛基宣言，所有捐助者均获得书面知情同意书。所有实验均符合日本相关法律和机构指南。所有方案均经京都大学医院人类研究伦理委员会和冲绳科学技术研究生院(oist)人体研究评审委员会批准。人类受试者特征和血液代谢组学分析30名健康的男性和女性志愿者参加了这项研究(表2)。如先前报道的那样制备代谢组学样本(npl4)。在si中可以找到lc-ms测量和每种代谢物的cv测定的详细程序。早晨采集用于代谢组学分析和临床血液参数的血液样本，并且要求受试者不吃早餐以确保禁食至少12小时。表2表2.人类受试者特征年轻人(n＝15)老年人(n＝15)所有人(n＝30)年龄(中位数，iqr)28.2(26.1，31.2)80.6(76.0，84.3)53.5(28.2，80.6)性别(男性：女性)10；54；1114；16hb，g/dl15.3(14.2，16.0)13.5(12.8，14.1)14.1(13.3，15.6)血红蛋白a1c(中位数，iqr)，％4.7(4.5，4.9)5.2(4.9，5.4)4.9(4.7，5.2)wbc(中位数，iqr)，×109/l5.8(5.1，6.3)4.9(4.2，6.4)5.5(4.5，6.4)rbc(中位数，iqr)，×1012/l5.1(4.8，5.2)4.2(4.0，4.6)4.7(4.2，5.2)mcv(中位数，iqr)，fl92.0(89.5，94.5)97.8(92.1，102.4)94.3(90.5，97.3)血小板(中位数，iqr)，×1011/l20.8(20.0，27.0)18.3(15.1，23.5)20.6(16.4，26.2)ht血细胞比容(中位数，iqr)，％45.9(44.0，47.4)41.9(41.1，44.5)44.0(41.7，46.7)葡萄糖(中位数，iqr)，mg/dl88.5(86.3，92.8)96.0(91.5，100.3)92.5(87.0，95.5)肌酐(中位数，iqr)，mg/dl0.8(0.7，0.8)0.7(0.5，0.8)0.7(0.6，0.8)用于代谢组学分析的血液样本的制备如先前报道的那样制备代谢组学样本(npl4)。所有血液样本均在医院实验室中抽取，以确保快速准备样本。简言之，将用于代谢组学分析的静脉血样本置于5ml肝素化管(terumo)中。在-40℃下，立即将0.2ml血液(8-12×108rbc)在1.8ml55％甲醇中淬火。血液采样后立即进行快速淬火步骤，可确保精确测量许多不稳定代谢物。全血样本的使用也使我们能够观察细胞代谢物水平，否则细胞代谢物水平可能受到冗长的细胞分离程序的影响。在ficoll分离或过滤白细胞减少期间，血细胞长时间暴露于非生理条件下(npl4)。将来自每个捐助者的剩余血液样本在室温下以120g离心15分钟以分离血浆和rbc。离心后，在-40℃下，将分离的血浆和rbc(14-20×108rbc)各0.2ml，在1.8ml55％甲醇中猝火。每个样本中加入两种内标(10nmol的hepes和pipes)。在短暂涡旋后，将样本转移至amiconultra10-kda截止过滤器(millipore，billerica，ma，usa)以除去蛋白质和细胞碎片。因此，从每个血液样本中，制备三种不同的子样本，全血、rbc和血浆。白细胞含量(wbc)小于我们制剂中细胞体积的1％(npl4)。使用ficoll梯度对wbc进行全代谢组学分析，证实wbc不应影响我们目前关于rbc的代谢组学结果。通过真空蒸发浓缩样本后，将每个样本重悬于40μl50％乙腈中，并且每次注入lc-ms系统使用1μl。lc-ms分析如前所述(npl21)，lc-ms数据使用与ltqorbitrap质谱仪(thermofisherscientific，waltham，ma，usa)偶联的paradigmms4hplc系统(michrombioresources，auburn，ca，usa)获得。简而言之，在zic-philic柱(mercksequant，umea，sweden；150mm×2.1mm，5μm粒径)上进行lc分离。hilic色谱柱对于分离许多亲水性血液代谢物非常有用，这些代谢物之前未经其他人检测过(npl4)。使用乙腈(a)和10mm碳酸铵缓冲液，ph9.3(b)，作为流动相，以100μlml-1的流速在30分钟内从80-20％a梯度洗脱。使用mzmine2软件测量感兴趣的代谢物的峰面积(87)。先前已经描述了详细的数据分析程序和参数(npl21)。代谢组学数据存储放在metabolights数据库中(参见数据可用性)。通过lc-ms分析血液代谢物的cv我们分析了126种通过标准或ms/ms分析确认的血液化合物(npl4)。对于每种代谢物，我们选择单电荷，[m+h]+或[m-h]-，峰(表1)。根据他们的峰面积，代谢物分为3组(h，m和l)。h表示具有高峰面积(>108au)的化合物，m具有中峰面积(108～107au)和l具有低峰面积(<107au)。如先前报道，相同摩尔浓度的一些标准品，例如amp和atp，以不同的效率电离，从而影响其峰面积的定量(npl21)。因此，在某些情况下，由于某些化合物在纯样本和代谢物样本混合物之间的不同电离效率，峰面积不能可靠地转换成实际摩尔量。然而，在该研究中，峰面积单独不同的相对比率与获得cv相关，因此不需要化合物的实际摩尔浓度。确定每种代谢物的cv实验程序的验证如下进行。首先，我们评估了样本处理对样本内变异的贡献。将相同的血液样本制备以80分钟的间隔注入lc-ms中3次(图6a)。因此，我们获得了样本内的cv(指定为cvwi)，其在126种化合物中的107种(85％)中小于0.1。只有10种化合物显示cvwi为0.1-0.2，而9种cvwi>0.2(表1)。大多数可变化合物属于低峰区(l)组，这表明一些低丰度化合物在lc-ms过程中可能不稳定。然而，这些化合物的纯标准品的lc-ms测量显示出更低的cv(数据未显示)，这意味着它们的不稳定性是由于在lc-ms测量之前与其他血液化合物或溶剂的反应。其次，我们还检查了样本制备引起的样本间差异。从相同的血液样本(一个人)独立地制备三个样本，并且由此确定的cv被指定为cvss(图6b)。血样中hepes和pipes的cvss值非常小(hepes为0.06～0.08，pipes为0.04～0.08)。绝大多数(116/126＝92％)的cvss<0.3(表1)。在cvs>0.3的10种化合物中，9种化合物属于低峰面积(l)组。具有m峰面积的维生素烟酰胺的cvss＝0.47。然而，三次注射烟酰胺标准的cv＝0.05。对于其他9种化合物，如ump和1-甲基鸟苷，观察到类似情况，具有高cvss值。血液中这10种化合物的cv可能受样本制备的影响，或者它们可能在样本制备过程中与其他代谢物发生反应。第三，我们从所有30名志愿者(cv30)获得每种血液化合物的cv(表1，图6c)。cv30分为6个不同的值范围(图1a)。数据可用性mzml格式的原始lc-ms数据可通过metabolights存储库(url：http：//www.ebi.ac.uk/metabolights)访问。来自相同样本的三次注射和来自相同捐献血液制备的3个样本的数据可以在登录号mtbls263下获得。在24小时内从四名志愿者抽取4次的血液样本可以在登记号mtbls264下获得。来自所有30名受试者的全血代谢组学数据可以在登录号mtbls265下获得。来自所有30名受试者的血浆和rbc数据可分别在mtbls266和mtbls267下找到。血液代谢物的昼夜变异，许多代谢物水平每天都是恒定的。我们首先调查了4名志愿者的血液代谢物的昼夜变异。第一天，样本在禁食过夜后不吃早餐于9:00、10:00、13:00和午餐前取出。志愿者那天像往常一样吃午餐和晚餐。在禁食过夜后的第二天，在9:00再次对血液取样。在这些短期内，绝大多数代谢物几乎没有波动(在4名志愿者中，来自126个代谢物的117个平均变化小于2.5倍，图5a)。虽然个别的麦角硫因水平不同，但atp和麦角硫因几乎没有变化。相反，四种可变化合物在24小时内波动很大。代谢产物如甘氨基脱氧胆酸盐、十四酰肉碱、4-氨基苯甲酸盐和咖啡因的变化很大，取决于每日食用的食物、饮料、补充剂和药物(22-24)。我们的结果与之前报道的结果一致。这些每日可变化合物在血浆和rbc中均被发现(npl4)。确定每种代谢物的个体cv我们对30名志愿者捐献的血液样本进行了代谢组学分析。红细胞中化合物富集的数据与我们之前的报告一致(npl4)。通过ficoll梯度离心分离rbc与wbc，证实rbc和wbc中的代谢物及其水平相似(npl4)。由于wbc仅占健康个体血液体积的一小部分(<1％)，因此我们目前的结果不应受wbc污染的影响。上文详述了lc-ms分析以及获得和验证cv的程序。下面简要描述用于确定cv的方法。首先，我们测试了样本处理对样本内变异的影响。为此，将相同的血液样本注射到lc-ms中3次。在大多数情况下，样本内cv(指定为cvwi，图6a)小于0.1。在lc-ms期间，这些异常似乎是不稳定的。其次，我们检查了样本制备引起的样本间差异。为此目的，从相同的血液样本独立地制备三个样本，并测定化合物的cv(cvss)(图6b)。血液样本中hepes和pipes(内标)的cvss非常小(0.04～0.08)，因为它们是惰性的、非反应性化合物。绝大多数血液化合物cvss小于0.3(表1)。10种化合物的cvss异常，超过0.3。它们可能受样本制备技术的影响，或者可能在样本制备过程中与其他血液代谢物发生反应。测定每种血液化合物的30个人的整个实验群体的cv(cv30)(图6c和表1)。来自所有30名健康志愿者的血液代谢物的cv30(表2)被分为6个不同的值范围，其中亚类为在rbc中富含或存在于全血中的化合物(图1a)。许多在rbc中富含的化合物如atp、谷胱甘肽和磷酸糖在血浆中几乎不存在，但许多血浆化合物也存在于rbc中(npl4)。cv30小于0.30的28种化合物中包含126种血液代谢物中变化最小的亚组(图1b)。另外28种化合物的cv30值为0.3至0.4，属于第二个变化最小的组。丁基甜菜碱是肉毒碱的前体，在红细胞中富含，属于该组(图5b)。其余70种化合物的cv30值为0.4至2.5。我们认为这些化合物是可变的。具有0.4至0.5的cv30的22种化合物是适度可变的。葡萄糖、1,5-脱水葡萄糖醇、cdp-胆碱和葡糖胺属于该组。用于肾脏测试的肌酐，属于第二组(cv30＝0.3-0.4)。cv30>0.5的48种化合物被认为是高度可变的。它们通常被甲基化或乙酰化，或用庞大的基团如核苷酸或脂肪酸修饰。先前未报道的51种人类代谢物的cv在许多情况下，上面分类的化合物的cv30值得到文献证据的充分支持。通过lc-ms、gc-ms和nmr分析的46种化合物(主要是标准氨基酸及其衍生物)的cv先前已有报道(12、15、25)。在这46种化合物中，36种的cv在我们的结果的±0.3范围内(cv30)。在文献中，我们还发现了126种化合物中的71种的cv(22,26-69)。在这些报道中，72％的cv(51/71)与我们的相似(±0.3)。总体而言，我们用于75/126化合物的cv30(60％)(表1)与文献相当一致。据我们所知，其余51种化合物的cv是新的。这些51种化合物中的许多(在图1a中加下划线并且也在表3中列出)是在rbc中富含的，如下所述。我们根据分子结构和功能将126种化合物分为14类(表1)。先前已报道了17种可检测的标准氨基酸和所有10种肉毒碱的cv。在12种核苷、核酸碱基及其衍生物中，只有二甲基黄嘌呤的cv是新的。相反，所有4种核苷酸糖衍生物和大多数(8/9)糖磷酸衍生物同样是新的。它们的新颖性反映了这些化合物在红细胞中富含的事实。对于其他类别，一些cv是新的：甲基化氨基酸(8/13)、核苷酸(7/11)、维生素和辅酶(2/5)、糖和衍生物(3/6)、有机酸(6/10)、乙酰化氨基酸(5/7)、其他氨基酸衍生物(4/16)、胆碱衍生物(2/3)、抗氧化剂(1/3)。其中许多也是在rbc中富含的。奇怪的是，甲基化氨基酸在rbc中积累。表3-1表3.未报道的51种确认的代谢物cv的列表表3-2麦角硫因相关的、糖酵解的和甲基的化化合物是相关的有趣的是，一些功能相关的血液代谢物的水平是相关的。我们首先检查了三甲基-组氨酸、麦角硫因和s-甲基麦角硫因之间是否存在相关性，因为它们在结构上相关，并且前两种化合物在生化途径中相关连。这些化合物的丰度非常强烈地、肯定地相关(r2＝0.81～0.92，图2a)。其次，检测了在rbc中富含的葡萄糖-6-磷酸(g-6-p)、果糖-6-磷酸(f-6-p)、二磷酸甘油酸酯(dg)和磷酸甘油酸(pg)之间潜在的相关性(图2b)。在g-6-p和f-6-p之间、dg和pg之间、f-6-p和dg之间以及g-6-p和dg之间发现了非常强的相关性。这些rbc化合物是糖酵解途径的组分。第三，还评估了甲基化化合物二甲基精氨酸(da)、二甲基鸟苷(dgu)、1-甲基鸟苷(1mg)和甲基组氨酸(mh)之间的相关性。da丰度与dgu、1mg和mh强烈地且肯定地相关(图2c)。此外，1mg也与dgu和mh正相关。这些结果表明，一些甲基化化合物的水平与相同的合成代谢或分解代谢途径有关。一致地，所有这些化合物在rbc和血浆中都是富含的。因此，个体之间的代谢物变化在如麦角硫因、糖酵解和甲基化的途径方面是协调的。具有低cv的代谢物可具有重要功能在51种新cv化合物中，19种显示低cv30<0.4；其中16种在rbc中富含(图1a，表1)。它们包括糖磷酸、糖-核苷酸衍生物、糖和衍生物以及参与atp生产的有机酸。具有低cv的化合物可能支持基本的rbc功能。atp(cv30＝0.17)和二硫化谷胱甘肽(cv30＝0.18)的cv低，并且在老年受试者和年轻受试者之间未发现显着差异(图3a-b)。atp和谷胱甘肽分别作为能量来源和抗氧化剂是至关重要的，因此它们在红细胞中的浓度可能受到严格调节，年龄特异性变化很小。对于两种糖磷酸，二磷酸甘油酸酯(cv30＝0.24)和葡萄糖-6-磷酸酯(cv30＝0.29，图3c-d)也观察到类似的情况。这些具有小cv的关键代谢化合物(atp、nad+、标准氨基酸和核苷酸)的水平可能受到严格调节，因为它们对于生理稳态是必需的。换句话说，如果测量结果准确，小cv化合物可能是健康检查指数的良好候选者。甘油醛-3-磷酸(g-3-p)，一种必需的糖酵解代谢物可能是一个例外。它具有高cv30(图5b)。这种化合物的含量因个体而异。然而，它是一种不稳定的化合物(cvss，0.49)，因此必须小心谨慎地使用高cv30(0.99)。这种酶，甘油醛-3-磷酸脱氢酶在癌细胞的能量代谢中是重要的(70)。具有高cv的未报道化合物经常被修饰，暗示生活方式差异和饮食习惯10种血液代谢物，如cdp-胆碱和磷酸肌酸，其先前未报道，显示出中等的0.4～0.5cv30变化(图1a，图s3a和s3c)。13种化合物显示更高的0.5～0.7cv30(三甲基-组氨酸cv30＝0.57；图3e)。其中9种在rbc中富含，含有核苷酸-糖和三甲基化衍生物。以前没有在健康个体的血液中报道他们的cv。在rbc中富含的udp-葡糖醛酸(cv30＝0.64，图s3b)是葡糖苷酸和udp-葡萄糖之间的中间体(71)。udp-乙酰葡萄糖胺(cv30＝0.64，图3f)，n-乙酰葡萄糖胺转移酶的底物，是蛋白多糖和糖脂合成的前体(72,73)。udp-乙酰葡萄糖胺和udp-葡萄糖醛酸的丰度在年轻受试者和老年受试者之间显示出一些差异(p值，分别为0.0073和0.12；见下文)。显示较高cv30(0.7-2.5)的化合物包含最可变的组(例如，4-胍基-丁酸酯cv302.05；三甲基-色氨酸cv301.67)(图3g-h)。其中有9种以前没有报道过。4种是甲基化氨基酸，其中三种是三甲基化的。甲基化氨基酸在rbc中富含，而乙酰化氨基酸存在于血浆和rbc中。这种区别的原因尚不清楚。发现的许多变化最大的化合物是修饰的氨基酸，可能适合作为与生活方式相关的标记化合物，尤其是饮食习惯。4-氨基苯甲酸盐(也称为paba)的数据很奇怪。它的cv30非常高(2.18)。5人有高水平的paba，而在所有其他人中，水平很低或几乎检测不到(图s3d)。paba是动物体内维生素b9的前体，在植物(74)和细菌(75)是叶酸的前体，但paba对人类不是必需的。这种非常大的可变丰度可能反映了饮食或其他未知的个体差异。通过cv测量揭示的与年龄相关的化合物在分析的126种化合物中，绝大多数在年轻人和老年人中显示出相似的cv水平。我们发现43种化合物在两个年龄组之间存在显着差异。例如，1,5-脱水葡萄糖醇(图4a)，称为血糖标记物(76)，与健康年轻人相比，在健康老年人中显示出显着较低的水平(p＝0.00039)。请注意，30名志愿者中没有一名是糖尿病患者(参见表2中血液检测中hba1c和葡萄糖的值)。1,5-脱水葡萄糖醇是一种单糖，通常通过肾脏重新吸收回血液，但这种化合物与葡萄糖竞争再吸收，因此在血液中含有高葡萄糖的糖尿病患者中，1,5-脱水葡萄糖醇的丰度较低。一种可能的解释是，健康的老年人可能逐渐失去再吸收1,5-脱水葡萄糖醇的能力，将其释放到尿液中，伴随着在血液的减少。视晶酸是谷胱甘肽的三肽类似物，在年轻人和老年人之间显示出令人印象深刻的差异(老年人血液中的差异更小；p值为0.0087；图4b)。类似地，与两种氧化剂清除剂，乙酰肌肽(p＝0.0014，图4c)和肌肽(p＝0.0027，图4d)相关的含有β-丙氨酸和组氨酸的二肽的水平在老年人中明显较少。对于在rbc中富含的两种氧化还原辅酶，nad+(p＝0.046)和nadp+(p＝0.022)也是如此(图8a-b)，这表明老年rbc中的氧化还原代谢可能有所下降。然而，亮氨酸和异亮氨酸可能在支持老年人骨骼肌活动方面发挥独特作用(77)，因此老年人血液代谢物中它们的减少(分别为p＝0.0017和0.012；图8c-d)可能表明在血液中它们的减少是由于老化。可能与抗氧化剂无关的udp-乙酰葡萄糖胺水平在老年人血液中也降低(p＝0.0073，图3f)。由于这种化合物对生长和增殖很重要，它的下降也可能加速老化。总之，老年人的血液可能减少了剧烈的身体活动所需的抗氧化剂、氧化还原剂和营养盐。另一方面，瓜氨酸(p＝0.00089，图4e)、泛酸(p＝0.022，图4f)、二甲基鸟苷(p＝0.0081，图4g)、n-乙酰精氨酸(p＝0.0004，图4h)和n6-乙酰赖氨酸(p＝0.012，图8e)的水平在老年受试者的血液中明显更丰富。泛酸是coa的前体，coa是参与tca循环和β-氧化的重要辅酶。瓜氨酸是尿素循环的初始代谢产物。二甲基鸟苷是一种尿核苷，在尿毒症患者的血浆中呈现高水平(56)。在缺乏精氨酸酶(尿素循环的最后一种酶)的患者中，n-乙酰精氨酸浓度比正常浓度高4倍(78)。因此，增加的瓜氨酸和n-乙酰精氨酸表明尿素循环受损。对这些结果的可能解释是尿素循环代谢物排泄到尿液中可能在老年人中有所受损。血液中1,5-脱水葡萄糖醇的减少也可能与肾功能减弱有关。老年受试者中丰富的泛酸表明coa生物合成可能略微受损。我们获得的数据表明，作为亮氨酸和异亮氨酸的降解代谢物的酮碱和酮异亮氨酸在老年人中显着降低。众所周知，作为支链氨基酸的亮氨酸和异亮氨酸在骨骼肌和脑中代谢。特别是atp在肌肉运动期间通过adp和amp转化为imp。在该过程中产生有毒的氨。氨和谷氨酸与谷氨酰胺合成酶结合并转化为无毒的谷氨酰胺。在运动过程中，支链氨基酸在氨基转移酶存在下与2-酮谷氨酸反应生成谷氨酸，谷氨酸是处理氨所必需的。通过该酶促反应产生酮碱和酮异亮氨酸。最后，将其转化为乙酰coa或琥珀酰coa并用于柠檬酸循环。因此，酮碱和酮异亮氨酸在老年人中较低是合理的，这反映了肌肉质量和动量的减少。酮碱和酮异亮氨酸可用作老化标记物。除上述血液代谢物外，还发现27种化合物在老年人和年轻人之间显示出显着差异。老年人和年轻人之间不同的血液代谢物的总结如下表。表4表5表6表7年龄相关化合物之间的相关性首先，我们发现了12对14种与年龄相关的化合物(1，5-脱水葡萄糖醇、n-乙酰精氨酸、瓜氨酸、乙酰肌肽、亮氨酸、视晶酸、n6-乙酰赖氨酸、肌肽、udp-乙酰葡萄糖胺、nad+、nadp+、异亮氨酸、泛酸和二甲基鸟嘌呤)显示出相对较强的相关系数(pearson′sr)(0.60-0.84；表8，图9)。有趣的是，这种组合发生在老年人中增加或减少的化合物组中。瓜氨酸含量与n-乙酰赖氨酸强烈相关(0.84)，而n-乙酰精氨酸(0.68)和二甲基鸟苷(0.64)则较少(表8)。n-乙酰精氨酸和n-乙酰赖氨酸之间(0.63)以及n-乙酰精氨酸和二甲基鸟苷之间(0.61)也存在相关性。在老年人中，这四种化合物显示出升高的血液水平。然后我们发现七种化合物中的相关性(0.6-0.83)在老年人中减少。亮氨酸和异亮氨酸之间(0.83)以及肌肽和乙酰肌肽之间(0.73)的相关性很强，表明这些化合物因其紧密的功能关系而相关。其他密切相关的组合包括肌肽和nadp+、亮氨酸和乙酰肌肽(表8；图9)。这些结果与年龄相关化合物(老年人减少或增加)在两个不同组的丰度在内部相关，但两组之间不存在相关性的概念是一致的。例如，具有丰富亮氨酸的老年志愿者也很可能具有高异亮氨酸，而具有丰富瓜氨酸的老年人也具有高概率的高n6-乙酰赖氨酸。然而，个体间亮氨酸和瓜氨酸丰度没有相关性。表8表8显示相对较高相关值的年龄相关化合物对年龄相关年龄相关相关性瓜氨酸n-乙酰精氨酸0.68瓜氨酸n-乙酰赖氨酸0.84瓜氨酸二甲基鸟苷0.64n-乙酰精氨酸n-乙酰赖氨酸0.63n-乙酰赖氨酸二甲基鸟苷0.61亮氨酸异亮氨酸0.83亮氨酸乙酰肌肽0.67异亮氨酸乙酰肌肽0.60肌肽乙酰肌肽0.73乙酰肌肽nad+0.63肌肽udp-乙酰葡萄糖胺0.70肌肽nadp+0.70前5对化合物在老年人中表现较高水平，而另外7对化合物在年轻人中更为丰富，见补充图9我们调查了43种年龄相关化合物之间的相关性。我们在全血中发现了27对43种与年龄相关的化合物，这些化合物显示出相对较强的相关系数(pearson′sr)(0.60-0.91；表9)。此外，我们在血浆中发现了45对43种与年龄相关的化合物，这些化合物显示出相对较强的相关系数(pearson'sr)(0.61-0.85；表10)。我们还在红细胞中发现了35对43种与年龄相关的化合物，它们显示出相对较强的相关系数(pearson'sr)(0.64-0.94；表11)。表9表9全血中显示相对较高相关值的年龄相关化合物对年龄相关年龄相关相关性1，5-脱水葡萄糖醇酮(异)亮氨酸0.67乙酰肌肽肌肽0.73乙酰肌肽nad+0.63肌肽nadp+0.70cdp-胆碱cdp-乙醇胺0.87瓜氨酸二甲基精氨酸0.67瓜氨酸二甲基鸟苷0.64瓜氨酸二甲基精氨酸0.68瓜氨酸n6-乙酰赖氨酸0.84二甲基精氨酸二甲基鸟苷0.79二甲基精氨酸二甲基精氨酸0.61二甲基精氨酸n6-乙酰赖氨酸0.76二甲基鸟苷n6-乙酰赖氨酸0.61二磷酸甘油酸果糖-6-磷酸0.73二磷酸甘油酸葡萄糖-6-磷酸0.83二磷酸甘油酸谷氨酸0.65二磷酸甘油酸甘油磷酸0.61果糖-6-磷酸葡萄糖-6-磷酸0.91果糖-6-磷酸甘油磷酸0.65葡萄糖-6-磷酸甘油磷酸0.65谷氨酸甘油磷酸0.60异亮氨酸亮氨酸0.83n-乙酰-(异)亮氨酸n6-乙酰赖氨酸0.63n-乙酰精氨酸n2-乙酰赖氨酸0.77n-乙酰精氨酸n6-乙酰赖氨酸0.63n6-乙酰赖氨酸酪氨酸0.74苯丙氨酸酪氨酸0.74表10表10血浆中显示相对较高相关值的年龄相关化合物对年龄相关年龄相关相关性1，5-脱水葡萄糖醇肌肽0.611，5-脱水葡萄糖醇酮(异)亮氨酸0.67乙酰肌肽肌肽0.63乙酰肌肽亮氨酸0.62乙酰肌肽酮(异)亮氨酸0.64肌肽磷酸肌酸0.63肌肽udp-乙酰葡萄糖胺0.66cdp-胆碱cdp-乙醇胺0.76cdp-胆碱ctp0.67cdp-胆碱甘油磷酸胆碱0.70cdp-胆碱nad+0.74cdp-乙醇胺ctp0.82cdp-乙醇胺果糖-6-磷酸0.69cdp-乙醇胺二硫化谷胱甘肽(gssg)0.62cdp-乙醇胺甘油磷酸胆碱0.79cdp-乙醇胺nad+0.74cdp-乙醇胺utp0.70瓜氨酸n6-乙酰赖氨酸0.63ctp果糖-6-磷酸0.71ctp甘油磷酸胆碱0.70ctpnad+0.66ctputp0.76二甲基精氨酸二甲基鸟苷0.81二甲基精氨酸n-乙酰精氨酸0.64二甲基精氨酸n6-乙酰赖氨酸0.84二甲基鸟苷n6-乙酰赖氨酸0.77果糖-6-磷酸葡萄糖-6-磷酸0.64果糖-6-磷酸甘油磷酸胆碱0.63果糖-6-磷酸udp-乙酰葡萄糖胺0.68果糖-6-磷酸udp-葡萄糖0.60果糖-6-磷酸utp0.85葡萄糖-6-磷酸甘油磷酸0.68葡萄糖-6-磷酸utp0.67二硫化谷胱甘肽(gssg)nad+0.65甘油磷酸胆碱nad+0.74甘油磷酸胆碱utp0.76异亮氨酸亮氨酸0.78n-乙酰精氨酸n2-乙酰赖氨酸0.79n-乙酰精氨酸n6-乙酰赖氨酸0.66n-乙酰精氨酸酪氨酸0.62n6-乙酰赖氨酸酪氨酸0.66nad+udp-葡萄糖0.69苯丙氨酸酪氨酸0.73udp-乙酰葡萄糖胺utp0.78酮(异)亮氨酸酮碱0.63表11表11rbc中显示相对较高相关值的年龄相关化合物对年龄相关年龄相关相关性1，5-脱水葡萄糖醇异亮氨酸0.611，5-脱水葡萄糖醇酮(异)亮氨酸0.711，5-脱水葡萄糖醇酮碱0.67乙酰肌肽酮(异)亮氨酸0.80天冬氨酸二甲基鸟苷0.62cdp-胆碱cdp-乙醇胺0.80瓜氨酸二磷酸甘油酸0.76瓜氨酸葡萄糖-6-磷酸0.64瓜氨酸谷氨酸0.64瓜氨酸甘油磷酸0.74瓜氨酸n-乙酰精氨酸0.62瓜氨酸n6-乙酰赖氨酸0.75瓜氨酸s-腺苷高半胱氨酸-0.64瓜氨酸酪氨酸0.69肌酸n-乙酰精氨酸0.61ctputp0.64二甲基精氨酸二甲基鸟苷0.68二甲基精氨酸n-乙酰精氨酸0.63二磷酸甘油酸果糖-6-磷酸0.73二磷酸甘油酸葡萄糖-6-磷酸0.85二磷酸甘油酸谷氨酸0.73二磷酸甘油酸甘油磷酸0.82果糖-6-磷酸葡萄糖-6-磷酸0.94葡萄糖-6-磷酸甘油磷酸0.69谷氨酸甘油磷酸0.71甘油磷酸n-乙酰精氨酸0.65甘油磷酸s-腺苷高半胱氨酸-0.61异亮氨酸亮氨酸0.84异亮氨酸丝氨酸0.63亮氨酸丝氨酸0.65n-乙酰精氨酸n2-乙酰赖氨酸0.77n6-乙酰赖氨酸酪氨酸0.72磷酸戊糖udp-葡萄糖0.78苯丙氨酸酪氨酸0.62酮(异)亮氨酸酮碱0.72参考文献1.rapoportsm,schewet,&thieleb-j(1990)maturationalbreakdownofmitochondriaandotherorganellesinreticulocytes.inerythroidcells,edharrisjr(springerus),pp151-194.2.vanwijkr&vansolingeww(2005)theenergy-lessredbloodcellislost:erythrocyteenzymeabnormalitiesofglycolysis.blood106(13):4034-4042.3.baxbe,bainmd,talbotpj,parker-williamsej,&chalmersra(1999)survivalofhumancarriererythrocytesinvivo.clinsci(lond)96(2):171-178.4.chaleckisr,etal.(2014)unexpectedsimilaritiesbetweentheschizosaccharomycesandhumanbloodmetabolomes,andnovelhumanmetabolites.molecularbiosystems10(10):2538.5.ferniear,tretheweyrn,krotzkyaj,&willmitzerl(2004)metaboliteprofiling:fromdiagnosticstosystemsbiology.natrevmolcellbiol5(9):763-769.6.goodacrer,vaidyanathans,dunnwb,harrigangg,&kelldb(2004)metabolomicsbynumbers:acquiringandunderstandingglobalmetabolitedata.trendsbiotechnol22(5):245-252.7.hiraimy,etal.(2004)integrationoftranscriptomicsandmetabolomicsforunderstandingofglobalresponsestonutritionalstressesinarabidopsisthaliana.procnatlacadsciusa101(27):10205-10210.8.kelldb(2004)metabolomicsandsystemsbiology:makingsenseofthesoup.curropinmicrobiol7(3):296-307.9.nicholsonjk&lindonjc(2008)systemsbiology:metabonomics.nature455(7216):1054-1056.10.pattigj,yaneso,&siuzdakg(2012)innovation:metabolomics:theapogeeoftheomicstrilogy.natrevmolcellbiol13(4):263-269.11.ramautarr,bergerr,vandergreefj,&hankemeiert(2013)humanmetabolomics:strategiestounderstandbiology.curropinchembiol17(5):841-846.12.dunnwb,etal.(2015)molecularphenotypingofaukpopulation:definingthehumanserummetabolome.metabolomics11:9-26.13.guertinka,etal.(2014)metabolomicsinnutritionalepidemiology:identifyingmetabolitesassociatedwithdietandquantifyingtheirpotentialtouncoverdiet-diseaserelationsinpopulations.amjclinnutr100(1):208-217.14.lawtonka,etal.(2008)analysisoftheadulthumanplasmametabolome.pharmacogenomics9(4):383-397.15.psychogiosn,etal.(2011)thehumanserummetabolome.plosone6(2):e16957.16.yuz,etal.(2012)humanserummetabolicprofilesareagedependent.agingcell11(6):960-967.17.suhrek(2014)metabolicprofilingindiabetes.jendocrinol221(3):r75-85.18.kastenmullerg,rafflerj,giegerc,&suhrek(2015)geneticsofhumanmetabolism:anupdate.hummolgenet24(r1):r93-r101.19.nishinot,etal.(2009)insilicomodelingandmetabolomeanalysisoflong-storederythrocytestoimprovebloodstoragemethods.jbiotec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