本发明涉及基于化学动力学识别新型蛋白质聚集抑制剂的方法，尤其是抑制与人类错误折叠疾病相关的淀粉样蛋白(amyloidprotein)聚集的抑制剂。本发明还涉及设计和生成抗蛋白质聚集的药效团的方法。同样在本发明的范围内的是，用于治疗阿尔茨海默病和抑制其他蛋白质错误折叠疾病中的蛋白质聚集的组合物和方法。
背景技术：
：细胞内蛋白质的错误折叠或聚集是许多被称为蛋白质病(proteinopathies)的迟发性神经变性疾病的一个特征。这些疾病包括阿尔茨海默病、帕金森病、tau蛋白病变、多聚谷氨酰胺扩张疾病(例如huntington病)和各种脊髓小脑性共济失调(sca)(例如sca3)。目前，没有有效的策略减缓或预防这些疾病在人类中引起的神经变性。事实上，随着全球人口老龄化，阿尔茨海默病(ad)的发病率正在迅速增加。据估计，目前有4400万人患有ad，并且到2050年这一数字将超过1.35亿(1)。ad是40多种相关疾病之一(2)，其特征在于可溶性蛋白质的错误折叠及其随后转化为淀粉样纤维(3-9)。ad的一个关键分子途径是aβ42的聚集，aβ42是aβ肽的42残基形式，是由淀粉样前体蛋白(app)发生蛋白裂解产生的片段(3-5,8,9)。aβ42本质上是一种无序的肽(10)，其在ad患者的大脑中自组装成纤维状聚集体(5,9)。因此，抑制aβ42的自组装已成为对抗ad的主要潜在治疗策略(11-20)，尽管设计来实现该效果的小分子尚未显示临床疗效(21)。引起这种临床失败的部分原因是，不完全了解对有毒物质产生所依据的分子机制以及小分子能够干扰aβ42的聚集途径的过程。此外，越来越明显的是，前纤维寡聚体种类，而不是成熟的淀粉样纤维和斑块，代表ad和其他神经变性疾病中的主要致病因子(3,22-27)。因此，有效的治疗策略不可能包括aβ42纤维形成的非特异性抑制，而是涉及在aβ42的复杂聚集过程中以精确的微观步骤在受控干预中特定物种的靶向(28)。现在可以利用我们对淀粉样蛋白形成的分子过程的理解的最新主要进展，来提出这种类型的治疗策略。这些进展是将化学动力学创新应用于蛋白质聚集研究中的结果(29,30)。最近，基于硫黄素-t(tht)荧光的动力学测量获得的高度可重复数据的可用性(31)，使我们能够根据其潜在的分子事件定义aβ42的聚集机制(30)。因此观察到，一旦通过单体的初级成核产生小但临界浓度的aβ42聚集体，则表面催化的二次成核将成为主要过程，由此纤维的表面一旦形成，则其将充当产生有毒寡聚体的催化位点(30)。这些寡聚体随后可生长并转化为额外的纤维，从而在高效催化循环中进一步促进其他有毒物质的形成(30)。现在可以进一步采取这些结果，原因是它们提供了研究通过治疗性分子来抑制aβ42聚集过程的机制的可能性(28,29,32)。使用化学动力学的方法，不需要事先了解有毒物质难以捉摸的结构，并且不受小分子与易聚集蛋白质需要非常紧密结合的限制，从而提供了高度灵敏的方法用于定量检测潜在治疗分子对聚集过程的影响。通过采用这种策略，有可能证明贝沙罗汀(bexarotene，一种fda批准的抗癌药物)在aβ介导的毒性的线虫(c.elegans)模型中选择性地靶向aβ自组装中的初级成核步骤，延迟神经母细胞瘤细胞中毒性物质的形成，并完全抑制aβ聚集及其病理学作用。但是，不仅需要确定特定的微观步骤(即初级和次级成核、延长和断裂)，这些步骤会产生已知或预测的蛋白质聚集抑制剂起作用的整体聚集过程，但还需要识别新的蛋白质聚集抑制剂，以及可以合理地被识别或选择来特异性地靶向影响可溶性毒性寡聚体形成的关键微观阶段(即初级和/或次级成核)的新的抑制剂。本发明旨在提供满足这种需要的方法。基于动力学的药物发现方法，如本文所述方法，与基于靶蛋白(例如酶或受体)的原子结构的传统方法根本不同。对于“稳定的”(例如非瞬时)状态，这些基于结构的药物发现是合适的。例如，结晶学可用于在结构上确定配体如何与靶标相互作用，然后基于该相互作用得到新的结构。但是，这种基于结构的药物发现不适合仅短暂存在的靶标，例如在蛋白质聚集期间可能存在的靶标。因此，根据本发明，根据功能(即通过动力学)确定新的蛋白质聚集抑制剂。这些动力学方法对于靶向动力学现象(例如蛋白质聚集)是必不可少的。技术实现要素：在本发明的第一方面，提供了产生对抗易聚集蛋白质的聚集的药效团的方法，该方法包括：(a)提供蛋白质聚集的至少一种抑制剂；(b)从所述至少一种抑制剂中产生抑制剂骨架(scaffold)；(c)将至少一种化学取代引入所述抑制剂骨架的至少一个组分中，并分析所述至少一种化学取代对所述易聚集蛋白质的聚集动力学的影响，其中分析对聚集动力学的影响包括在不存在和存在具有至少一个化学取代的化合物的情况下产生所述蛋白质的动力学曲线，并且如果所述取代引起动力学曲线的改变则将该取代识别为阳性结果；以及(d)通过比对来自动力学测定的阳性结果，产生对抗易聚集蛋白质的聚集的药效团。本发明还提供识别蛋白质聚集的抑制剂的方法，其中所述蛋白质是易聚集蛋白质，该方法包括：-识别至少一种化合物，该化合物结合至与已知或预测的抑制剂相同的结合伴侣(partner)和/或高度相关的结合伴侣，其中所述至少一种化合物结合至与已知或预测的抑制剂相同的结合位点或口袋；-分析所述至少一种化合物对易聚集蛋白质的聚集动力学的影响；以及-如果所述化合物影响易聚集蛋白质的聚集动力学，则选择所述至少一种化合物作为抑制剂。在一个实施方案中，该方法还包括识别已知或预测的抑制剂并识别和表征所述抑制剂的结合伴侣。优选的是，蛋白质聚集可以分为多个(优选三个)微观阶段，即初级成核、次级成核和延长，并且其中所述抑制剂抑制这些阶段中的至少一个。更优选的是，所述抑制剂至少抑制初级和/或次级成核。在一个实施方案中，分析所述至少一种化合物对所述易聚集蛋白质的聚集动力学的影响，包括在存在和不存在一种或多种化合物的情况下产生所述蛋白质的动力学曲线，其中如果所述的一种或多种化合物引起动力学曲线的变化，则将其识别为抑制剂。优选的是，动力学曲线是s形(sigmoidal)曲线，其中所述曲线至少包括源自初级成核、次级成核和延长过程的迟滞期、生长期和稳定期，并且其中所述至少一种化合物改变这些过程中的至少一种。更优选的是，可通过使用以下等式拟合曲线来从动力学曲线中获得速率参数：其中动力学参数b±、c±、κ、κ∞和是两种微观速率常数组合k+k2和knk2的函数，其中kn、k+和k2分别是初级成核、延长和次级成核速率常数。在另一个实施方案中，通过分析抑制剂对易聚集蛋白质的聚集动力学的影响，来识别已知或预测的抑制剂本身，其中若所述抑制剂引起动力学曲线的变化则可得到识别。在本发明的另一方面，提供了由上述方法获得或可获得的蛋白质聚集抑制剂。在本发明的另一个方面，提供了一种产生对抗易聚集蛋白质的聚集的药效团的方法，该方法包括：-使用上述方法识别蛋白质聚集的至少一种抑制剂；以及-使用上述方法从所述至少一种抑制剂中产生抑制剂骨架并生成药效团。除了上述方法中描述的已知或预测的抑制剂之外，可由至少一种抑制剂中产生抑制剂骨架。在本发明的另一方面，提供了通过本文所述方法获得或可获得的药效团。在本发明的另一方面，提供了抑制aβ42的聚集的药效团，该药效团包含至少九个特征，其中所述特征是两个氢键受体和代表羧酸基团的位于末端处的一个带负电荷的特征，以及连接至五个疏水特征的一个芳香特征。药效团可具有从末端疏水基团到另一个极性末端的的水平距离。在本发明的另一方面，提供了治疗阿尔茨海默病的方法，该方法包括向有需要的患者施用类视黄醇(retinoid)受体调节剂，其中所述调节剂选自：类视黄醇a受体(rar)激动剂，其选自阿达帕林(adapalene)、cd1530、ttnpb和ch55；类视黄醇a受体(rar)拮抗剂，其选自bms195614、le135、mm11253和bms493；类视黄醇x受体激动剂ss11237；以及类视黄醇x受体拮抗剂uvi3003。在本发明的另一方面，提供了一种用于治疗阿尔茨海默病的类视黄醇受体调节剂，其中所述调节剂选自：类视黄醇a受体(rar)激动剂，其选自阿达帕林、cd1530、ttnpb和ch55；类视黄醇a受体(rar)拮抗剂，其选自bms195614、le135、mm11253和bms493；类视黄醇x受体激动剂ss11237和类视黄醇x受体拮抗剂uvi3003。在本发明的另一方面，提供了类视黄醇受体调节剂在制备用于治疗阿尔茨海默病的药物中的用途，其中所述调节剂选自：类视黄醇a受体(rar)激动剂，其选自阿达帕林、cd1530、ttnpb和ch55；类视黄醇a受体(rar)拮抗剂，其选自bms195614、le135、mm11253和bms493；类视黄醇x受体激动剂ss11237和类视黄醇x受体拮抗剂uvi3003。在本发明的又一方面，提供了抑制易聚集蛋白质的聚集的方法，其中所述易聚集蛋白质是aβ42，该方法包括优选地向有需要的患者施用蛋白质聚集抑制量的类视黄醇受体调节剂，其中所述调节剂选自：类视黄醇a受体(rar)激动剂，其选自他米巴罗汀(tamibarotene)、阿达帕林、cd1530、ttnpb和ch55；类视黄醇a受体(rar)拮抗剂，其选自bms195614、le135、mm11253和bms493；类视黄醇x受体激动剂，其选自ss11237和贝沙罗汀；以及类视黄醇x受体拮抗剂uvi3003。在本发明的最后一个方面，提供了类视黄醇受体调节剂用于抑制易聚集蛋白质的聚集的用途，其中所述易聚集蛋白质是aβ42，并且其中所述调节剂选自：类视黄醇a受体(rar)激动剂，其选自他米巴罗汀、阿达帕林、cd1530、ttnpb和ch55；类视黄醇a受体(rar)拮抗剂，其选自bms195614、le135、mm11253和bms493；类视黄醇x受体激动剂，其选自ss11237和贝沙罗汀；以及类视黄醇x受体拮抗剂uvi3003。在上述方法或用途的一个实施方案中，蛋白质聚集可分为多个微观阶段，优选至少三个微观阶段，即初级成核、次级成核和延长，并且其中所述类视黄醇受体调节剂抑制这些阶段中的至少一个。优选的是，所述类视黄醇受体调节剂抑制初级和/或次级成核。更优选的是，所述调节剂抑制所有微观阶段，且其中所述调节剂选自mm11253、bms493、阿达帕林、cd1530和le135。在上述所有方面的一个实施方案中，易聚集蛋白质是淀粉样蛋白质。优选的是，淀粉样蛋白选自aβ42、α-突触核蛋白、tau、亨廷顿(huntingtin)蛋白、atrophin-1、共济失调蛋白(ataxin)(1,2,3,6,7,8,12,17)、淀粉不溶素(amylin)、朊病毒蛋白、(pro)降钙素、心房利钠因子、载脂蛋白ai、载脂蛋白aii、载脂蛋白aiv、血清淀粉样蛋白、medin、(apo)血清aa、催乳素、转甲状腺素蛋白、溶菌酶、β-2微球蛋白、纤维蛋白原α链、凝溶胶蛋白、角蛋白、β-淀粉样蛋白、胱抑素(cystatin)、abripp免疫球蛋白轻链al、免疫球蛋白重链、s-ibm、胰岛淀粉样多肽、胰岛素、乳粘素、角质-上皮、乳铁蛋白、tbn、白细胞趋化因子-2、abripp、adanpp、肺表面活性蛋白、半乳糖凝集素7、角膜锁链蛋白(corneodesmosin)、乳粘素、角质-上皮、牙源性成釉细胞相关蛋白、精囊蛋白1(semenogelin1)和恩夫韦肽(enfurvitide)。优选的是，淀粉样蛋白选自aβ42、α-突触核蛋白、tau和亨廷顿蛋白。更优选的是，淀粉样蛋白是aβ42。本发明在以下非限制性附图中得到进一步描述。附图说明图1:本工作中描述的药物发现策略的示意图。该策略包括4个步骤：(1)基于片段的方法允许识别与易聚集系统相互作用的小分子，此处为aβ42，包括fda批准的用于药物再利用的分子；(2)体外动力学分析识别在aβ42聚集机制中负责产生有毒物质的特定分子步骤；(3)进一步的动力学分析确定与(1)中识别的分子相关的抑制的机制；以及(4)评估这些分子对体内有毒物质形成的影响。特别地，预测初级成核的抑制仅用于延迟聚集而不影响聚集过程中产生的寡聚体的总数，同时预测抑制延长或次级成核用于分别增加或减少有毒寡聚体的数量。图2:贝沙罗汀，但不是高牛磺酸，会延迟aβ42纤维形成的形成。(a)在不存在或存在4倍过量的高牛磺酸的情况下，在3μm(空心圆)和4μm(空心方块)浓度的静止条件下aβ42聚集的动力学曲线。(b)在不存在或存在4倍过量的贝沙罗汀的情况下，在3μm(空心圆)和4μm(空心方块)浓度的静止条件下aβ42聚集的动力学曲线。(c)在不存在或存在4倍过量的贝沙罗汀的情况下，聚集反应的平均半衰期作为初始单体浓度的函数。图3:贝沙罗汀在无标记环境中延迟aβ42纤维形成。(a)在不存在和存在4倍过量的贝沙罗汀的情况下，在静止条件下2μmaβ42聚集的动力学曲线；图表下方的表格显示了以小时计的不同时间点的等效时间(以图中黑色实线表示)，其中aβ42的等分试样从2μm肽进行聚集的溶液中移除。(b)在不存在和存在4倍过量的贝沙罗汀的情况下aβ42的afm图像。图像在空气中以轻敲模式在1.2和2.1小时时间点从聚集反应中移除的aβ42溶液的等分试样中获得。值得注意的是，仅在不存在贝沙罗汀的情况下2.1小时后才能观察到纤维状结构。(c)通过抗体结合来评估形成2μmaβ42纤维的时间过程。由序列特异性w0-2抗体(上图)检测的aβ42肽的量在反应的完整时间过程中在aβ42的总量上保持不变(在溶液中或作为聚集体)。但是，纤维特异性oc抗体(下图)仅探测在不存在贝沙罗汀的情况下可见早于其存在的情况下形成的纤维状结构。观察到的延迟程度(以红色突出表示)完全符合(a)中所示的聚集曲线。(d)校准aβ42纤维质量浓度与纤维特异性oc抗体的斑点印迹强度的相关性。(顶部)通过tht荧光获得的4μmaβ42的动力学曲线。典型成熟的aβ42纤维的afm图像在空气中以轻敲模式获得并在ph8下形成。(底部)通过将纤维特异性oc抗体与aβ42纤维的连续稀释液结合获得斑点印迹强度，所述的aβ42纤维在新鲜的4μmaβ42单体孵化3h后收集。纤维浓度在4μm至0.1μm的范围内。图4:贝沙罗汀选择性地靶向aβ42的初级成核。(a-c)在不存在或存在浓度比为1：1或5：1的贝沙罗汀比aβ42(由不同颜色表示)的情况下，得到的5μmaβ42的聚集反应的动力学曲线。实线表示当贝沙罗汀抑制次级成核(a)、纤维延长(b)或初级成核(c)时所得反应曲线的预测。只有仅抑制初级成核的预测与贝沙罗汀的实验数据非常吻合。(d)随着贝沙罗汀浓度比的增加，表观反应速率常数的变化(kn是初级成核速率，k+为延长速率，k2为次级成核速率，k在每种情况下表示knk+或k2k+)。注意随着贝沙罗汀的浓度增加，与次级途径k2k+相比，初级途径knk+显著减少。(e)在不存在或存在2、5、7和10倍过量的贝沙罗汀的情况下(用不同的符号表示)，不添加和添加10％预形成种子纤维的2μmaβ42的动力学曲线。注意，与没有添加预形成纤维的反应相比，添加了预形成种子纤维的聚集反应斜率快速增加。(f)模拟显示在5％预形成纤维种子的存在下2μmaβ42样品的聚集曲线有相同的曲线，其中初级成核事件或有帮助或可忽略不计。(g)在5％预形成纤维种子的存在下，0.5和5倍过量的贝沙罗汀对2μmaβ42样品的聚集动力学的影响。(h)0.5和5倍过量贝沙罗汀对从(g)中的聚集动力学中获得的表面催化次级成核速率(k2)的影响。图5:贝沙罗汀延迟神经母细胞瘤细胞中aβ42毒性物质的形成。在不存在和存在20倍过量贝沙罗汀的情况下0.5μmaβ42溶液的反应曲线(a)和成核速率(b)的数值模拟。实线对应不存在贝沙罗汀的情况下的对照聚集反应，其中反应速率常数k2＝1.1061/m/s,k+＝3.1061/m/s,kn＝1.1041/m/s。虚线表示在贝沙罗汀存在下的情况，其中成核速率常数kn降至1.1021/m/s。观察到总成核速率(即初级和次级成核)的变化延迟。(c-f)活化caspase-3的水平作为aβ42对人类神经母细胞瘤细胞系(sh-sy5y)的细胞毒性作用的指标；荧光值已被标准化(见“方法”部分)。在不存在和存在10μm贝沙罗汀的情况下，在0h(c)、0.3h(d)、4h(e)和7h(f)将0.5μmaβ42的等分试样从聚集反应中移除。在不存在或存在(圆圈)贝沙罗汀的情况下，aβ42荧光值之间的百分比差异。这些结果表明在存在贝沙罗汀的情况下，在37℃下仅孵化7h后形成可检测量的毒性aβ42物质，这与贝沙罗汀延迟aβ42毒性物质的形成一致。图6:贝沙罗汀通过阻止aβ聚集来恢复aβ介导的毒性的线虫模型的运动性。(a)用于测量贝沙罗汀对线虫gm101(即aβ-蠕虫)和cl2122(即对照-蠕虫)模型中的身体弯曲频率和聚集体数量影响的实验步骤。注意将贝沙罗汀给予幼虫期l1和l4的蠕虫。(b)在aβ蠕虫模型中测量增加贝沙罗汀浓度(5至10μm)对身体弯曲频率的影响。在此显示了相对于第0天的归一化值。显示了单个实验的实验数据，但在三个独立实验的每种情况下都具有代表性。可观察到在10μm贝沙罗汀处aβ蠕虫模型的运动性完全恢复；插图显示了贝沙罗汀对成年第3天的aβ-蠕虫作用的剂量依赖性。(c)在不存在和存在10μm贝沙罗汀的的情况下，使用淀粉样蛋白特异性染料niad-4染色的聚集体的体内成像；为清晰起见，仅显示了第6天和第9天的图像。(d)在不存在和存在1μm贝沙罗汀的情况下，淀粉样蛋白聚集体在aβ-蠕虫模型中形成的反应的时间过程。使用imagej软件进行荧光强度的定量(见“方法”部分)。在所有图中，误差条代表着sem。(e)在存在和不存在贝沙罗汀的情况下，从线虫中提取的具有aβ和α-微管蛋白免疫检测的蛋白质的不溶部分(见“方法”部分)。图7:在实施例ii中采用的药物发现策略的示意图。该策略包含2个主要步骤。(1)基于类似结构的药物发现策略(qsbdd)包括基于预先确定命中(即贝沙罗汀)的初始受体(即rxr)的结构识别潜在分子，其显示了优先抑制aβ42聚集的初级成核。该策略背后的基本原理是，aβ42寡聚体的不稳定性和瞬时性使得其表征以及相应地基于结构的药物开发极具挑战性。随后，基于结构相似性发生在rxr和aβ42寡聚体的结合口袋之间的假设，该研究已经考虑的rxr(即贝沙罗汀的初始受体)的所有激动剂和拮抗剂。在此显示了所有分子的结构。考虑到与rxr有高度结构相似性，该策略还扩展到包含rar的激动剂和拮抗剂。总共测试了13种分子，其中包括贝沙罗汀。在左上方的图中显示了在增加贝沙罗汀量(即1至5倍过量)的情况下，5μmaβ42聚集(黑色)的动力学。rar的结构(pdb:1xdk)显示为rxr受体的二聚体。rxr亚基在结合口袋中(pdb:4k6i)与贝沙罗汀叠加在rxr亚基上。此处还显示了进入结合口袋的空间。(2)第二步包括基于动力学的药物发现策略(kbdd)。该步骤评估了小分子在微观水平上的作用。实际上，分子可以结合至单体、初级核、次级核、纤维或许多物质的组合，并因此影响可使用聚集动力学的理论拟合来定量地表征的不同微观步骤。实线对应没有抑制剂的aβ42的聚集动力学。虚线对应有抑制剂存在下的aβ42的动力学，其中后者影响单个微观步骤。图8:rar和rxr配体在不同程度上影响aβ42的聚集。(a)在不存在和存在3倍过量的rar和rxr配体的情况下，2μmaβ42溶液聚集的动力学曲线由不同符号显示。注意aβ42在13个分子中的5个的存在下10h内不聚集，由平直线显示。(b)在不存在和存在由(a)中的平直线显示的5个分子的亚-化学计量的情况下2μmaβ42聚集的动力学曲线。(c)作为柱状图显示了来自(a)的aβ42聚集反应的半衰期，并且作为空心圆，显示了标准化的斑点印迹强度与在1％dsmo存在下1.6h和2h的聚集反应的相关性。根据它们在aβ42聚集中诱导的延迟程度评估的效力将分子分为2个集合。集合a(以浅蓝色突出表示)包含与1％dmso有类似效果的分子(在1％dsmo存在的情况下aβ42聚集的半衰期以黑色虚线突出表示)。集合b(以浅绿色突出表示)包含与贝沙罗汀有相似或更大效果的分子(在贝沙罗汀存在的情况下aβ42聚集的半衰期以红色虚线突出表示)。(d)作为柱状图显示了来自(b)的aβ42聚集反应的半衰期，并且作为空心圆，显示了标准化的斑点印迹强度与在1％dsmo存在下1.5h和2.5h的聚集反应的相关性。分子分类为集合c(以浅橙色突出表示)。(e)显示了集合b分子对aβ42的聚集反应的半衰期的剂量依赖性作用的图。(f)显示了集合c分子对聚集反应的半衰期的剂量依赖性作用的图。图9:集合b分子在静止条件下对aβ42聚集的影响。(a-e)在不存在和存在1％dmso(○)或0.2-(·)、1-(+)、2-(＞)、和5倍过量贝沙罗汀(a)、他米巴罗汀(b)、ttnpb(c)、bms195614(d)、ch55(e)、sr11237(f)和uvi3003(g)的情况下，2μmaβ42溶液聚集的动力学曲线。实线代表符合实验数据的aβ42聚集的综合速率定律。所有集合b分子的结构由空心圆表示，其诱导aβ42聚集的显著延迟与用斑点印迹获得的结果相似。图10:集合c分子在静止条件下对aβ42聚集的影响。(a-e)在不存在和存在1％dmso(黑色)或0.2-(红色)、0.5-(青色)、1-(蓝色)、2-(黄色)、3-(绿色)的mm11253(a)、adapalene(b)、bms493(c)、cd1530(d)和le135(e)的情况下，2μmaβ42溶液聚集的动力学曲线。实线代表符合实验数据的aβ42聚集的综合速率定律。所有集合c分子结构由空心圆表示，其诱导aβ42聚集的显著延迟在亚-化学计量上与用斑点印迹获得的结果相似。图11:表征集合b分子对aβ42聚集的影响。(a-g)随着分子浓度的增加，表观反应速率常数的变化如图10中拟合聚集反应所得(kn是初级成核速率，k+为延长速率，k2是次级成核速率，k在每种情况下代表knk+(初级途径)或k2k+(次级途径))。注意随着分子浓度的增加，与初级途径knk+减少相比，次级途径的k2k+略有下降。(h-j)在初级途径可忽略不计的接种条件下，集合b分子对aβ42聚集的影响。(h)在不存在或存在5倍过量的贝沙罗汀、ttnpb和uvi3003以及存在10％的预形成种子的条件下，2μm的aβ42溶液聚集的动力学曲线。在这些条件下，纤维的延长是主要机制。(i)来自于(h)中在10％预形成种子纤维存在下的拟合曲线的归一化生长速率。这些结果表明集合b分子不影响延长率。(j)0.5倍至5倍过量的贝沙罗汀、ttnpb和uvi3003对表面催化的次级成核速率(k2)的影响。在1％、2％和5％的预形成种子的存在下，从2μmaβ42溶液的聚集动力学中获得速率(图13)，其中初级成核可忽略不计且表面催化的次级成核分别占形成的纤维总量的约35％、60％和80％。定量参数从图13中的拟合曲线获得。因为延长率不受影响，所以观察到的效果只能是由于降低了表面催化次级成核的速率。图12:表征集合c分子对aβ42聚集的影响。(a-e)随着分子浓度的增加，表观反应速率常数的变化如图10中拟合聚集反应所得(kn是初级成核速率，k+为延长速率，k2是次级成核速率，k在每种情况下代表knk+(初级途径)或k2k+(次级途径))。注意随着分子浓度的增加，与初级途径knk+减少相比，次级途径的k2k+略有下降。(f-j)在初级途径可忽略不计的接种条件下，集合c分子对aβ42聚集的影响。(f)在不存在或存在5倍过量的mm11253、阿达帕林和bms493以及存在10％的预形成种子的条件下，2μm的aβ42溶液聚集的动力学曲线。在这些条件下，纤维的延长是主要机制。(g)来自于(f)中在10％预形成种子纤维存在下的拟合曲线的归一化生长速率。这些结果表明5倍过量的集合c分子会影响aβ42的聚集延长率。(h)在不存在或存在0.5倍过量的mm11253、阿达帕林和bms493以及存在10％的预形成种子条件下，2μm的aβ42溶液聚集的动力学曲线。在这些条件下，纤维的延长是主要机制。(i)来自于(h)中在10％预形成种子纤维存在下的拟合曲线的归一化生长速率。这些结果表明0.5倍过量的c集合分子不影响aβ42聚集的延长率。(j)0.5倍过量的mm11253、阿达帕林和bms493对表面催化次级成核(k2)的影响。在1％、2％和5％的预形成种子的存在下，从2μmaβ42溶液的聚集动力学中获得速率(图15)，其中初级成核可忽略不计且表面催化的次级成核分别占形成的纤维总量的约35％、60％和80％。定量参数从图15中的拟合曲线获得。因为在0.5倍过量时延长率不受影响，所以观察到的效果只能是由于降低了表面催化次级成核的速率。图13:分析在1％、2％和5％的预形成种子纤维存在下，集合b分子对aβ42聚集动力学的影响。(a-c)在存在1％dmso或0.5倍和5倍过量的贝沙罗汀(a,d,g)、ttnpb(b,e,h)和uvi3003(c,f,i)以及存在预形成纤维种子的浓度增加的情况下，2μmaβ42溶液聚集的动力学曲线。注意集合b分子对聚集动力学的浓度依赖性影响。图14:分析在1％、2％和5％的预形成种子纤维存在下，集合c分子对aβ42聚集动力学的影响。(a-c)在存在1％dmso或0.5倍和5倍过量的mm11253(a,d,g)、阿达帕林(b,e,h)和bms493(c,f,i)以及存在预形成纤维种子的浓度增加的情况下，2μmaβ42溶液聚集的动力学曲线。注意集合c分子对聚集动力学的浓度依赖性影响。图15:分析在丛生蛋白的存在下，集合b分子对aβ42聚集动力学的影响。(a-c)在存在10％预形成种子纤维和10％丛生蛋白、0.5倍和5倍过量的贝沙罗汀(a)、ttnpb(b)和uvi3003(c)的条件下，2μmaβ42溶液聚集的动力学反应曲线。这些实验背后的基本原理是通过使用丛生蛋白阻断aβ42预形成的纤维末端来评估集合b分子对表面次级成核的影响。在不存在丛生蛋白的条件下，延长是在10％预形成纤维种子存在下的主要机制。10％丛生蛋白的存在会使延长速率降至60％，因此表面催化次级成核恢复至40％。注意当加入丛生蛋白时，集合b分子对聚集动力学的剂量依赖性影响与对表面催化次级成核的影响一致。(d)表观表面催化次级成核速率由(a-c)中的拟合曲线计算，并与存在5％预形成纤维种子的曲线进行比较。图16:分析在丛生蛋白的存在下，集合c分子对aβ42聚集动力学的影响。(a-c)在存在10％预形成种子纤维和10％丛生蛋白、0.5倍和5倍过量的mm11253(a)、阿达帕林(b)和bms493(c)条的件下，2μmaβ42溶液聚集的动力学反应曲线。这些实验背后的基本原理是通过使用丛生蛋白阻断aβ42预形成的纤维末端来评估集合c分子对表面次级成核的影响。在不存在丛生蛋白的条件下，延长是在10％预形成纤维种子存在下的主要机制。10％丛生蛋白的存在会使延长率降至60％，因此表面催化次级成核恢复至40％。注意当加入丛生蛋白时，集合c分子对聚集动力学的剂量依赖性影响与对表面催化次级成核的影响一致。(d)表观表面催化次级成核速率由(a-c)中的拟合曲线计算，并与存在5％预形成纤维种子的曲线进行比较。图17:通过小分子识别目标物质。(a)表格总结了所有分子对aβ42聚集和目标物质的微观步骤的影响。(b，顶部)在存在1％dmso或1倍过量的所有集合c分子和uvi(即集合b)的条件下，25μm单体15n-aβ42的1h-15hhsqc光谱的叠加。光谱在700mhz和278k的1h频率下获得。(b，底部)从光谱(b)中获得的5μm单体1h-15hhsqc的化学位移(条形图)和归一化强度(虚线)与在1％dmso存在下aβ42观察到的相似。图18:小分子的骨架的化学分析。(a)使用化学动力学通过结构-动力学活性关系(s-kar)分析贝沙罗汀结构的三个组分对其对aβ42聚集的影响的贡献。(顶部)为了研究亲水(左)、疏水(右)和接头(中)组分的作用，将单个取代引入贝沙罗汀的骨架中。(底部)在不存在和存在连有单个取代的分子时，2μmaβ42溶液的动力学聚集曲线。(b)从所有阳性分子的对齐中产生的药效团。药效团包含2个主要组分：一个疏水部分和一个亲水部分，其中大约相差(c)图显示了小分子的亲脂性、范德华体积和芳香性之间的相关性，以及它们对分子效力的影响。详细说明现在将进一步描述本发明。在以下段落中，对本发明的不同方面进行了更详细的定义。除非有明确的相反说明，否则每个如此定义的方面可以与其他任何方面结合。特别地，任何被指示为优选或有利的特征可以与任何其他被指示为优选或有利的特征结合。本发明涉及识别新化合物的方法，其中所述新化合物可起到抑制易聚集蛋白(例如淀粉样蛋白)的聚集的作用。特别地，本发明涉及识别能够抑制特定微观事件中的一种或多种(特别是初级和次级成核)的化合物的方法，其中所述微观事件是蛋白质聚集过程的基础。如arosio等人所述(2014)(28)并且通过引用并入本文的，蛋白质聚集可被认为是从成核步骤开始的多步骤过程，其中该成核步骤可从单体蛋白库中产生小的寡聚体。这种寡聚体具有很强的反应性和亚稳定性，因此通过单体加成会快速延长成原纤维(protofibril)，然后是纤维。但是在大多数情况下，聚集速率随后通过次级成核过程以指数方式加速，该次级成核过程例如是纤维断裂和表面催化成核，其形成新的反应性核并导致成核过程中高水平的表观协同性。这些微观过程以及目标抑制剂对这些过程的影响，可通过研究纤维形成的宏观动力学得到分析。正如arosio等人所解释(28)，纤维形成的微观动力学遵循特征性的s形曲线，其中滞后阶段在快速生长阶段之前，直到由于单体耗尽而达到停滞阶段。通过研究不存在和存在目标抑制剂的情况下的动力学曲线，可梳理抑制剂在聚集过程中的哪个点起作用，因为不同阶段的抑制会导致不同的宏观聚集曲线。例如，初级成核速率的降低通常会增加生长阶段之前的滞时间，如图7所示。该信息可用于确定抑制剂抑制蛋白质聚集的效力并最终确定其在疾病预防方面的潜在治疗效益。虽然通常认为毒性较大的物质是可溶性寡聚体，但不同的抑制剂可对这些寡聚体有不同的作用。例如，预测初级成核的抑制仅延迟有毒可溶性寡聚体的形成而不是降低或抑制总寡聚体的量，而预测次级成核的抑制会降低寡聚体的量。相反，预测延长的抑制会增加可溶性有毒寡聚体的总数。因此很明显能够至少靶向初级成核和/或次级成核的抑制剂可能是最有前景的候选药。虽然如上所述这些信息有用，或许可以评估已经识别的抑制剂的潜在治疗效力，或能够合理选择可靶向聚集的特定微观步骤的抑制剂，但仅此类信息不能识别新的抑制剂，尤其是特异性地影响初级和/或次级成核的抑制剂。由于初级和次级核不稳定、缺乏且仅在聚集过程中瞬时发生，因此识别靶向这些特性微观阶段的新抑制剂变得更具挑战性。这些特征排除了使用传统生物物理方法的结构表征。但是，发明人已经开发了一种策略，其允许(任选地)从现有的预识别命中开始，识别可抑制易聚集蛋白的聚集的新抑制剂。因此，一方面，提供了识别蛋白质聚集的抑制剂的方法，其中所述蛋白质是易聚集蛋白质，该方法包括：-识别与所述蛋白质聚集的已知或预测的抑制剂结合至相同的结合结合伴侣和/或高度相关的结合伴侣的化合物；其中所述至少一种化合物与已知或预测的抑制剂结合至相同的结合位点或口袋：-分析至少一种进一步的化合物对易聚集蛋白质的聚集动力学的影响；以及-如果所述化合物影响蛋白质的聚集动力学，则选择或识别所述至少一种化合物作为抑制剂。优选的是，该方法包括首先识别所述蛋白质聚集的已知或预测的抑制剂，并识别和表征所述抑制剂的结合伴侣。在一个实施方案中，抑制剂(已知或预测的抑制剂和至少一种进一步的化合物)充当配体，例如但不限于底物、酶抑制剂、活化剂和神经递质。在一个实施方案中，蛋白质聚集可分为多个微观步骤，优选至少三个微观步骤，即初级成核、次级成核和延长。优选的是，已知或预测的抑制剂抑制这些阶段中的至少一个。优选的是，待识别的抑制剂也抑制这些步骤中的至少一个。在另一个实施方案中，至少初级和/或次级成核被抑制。在另一个优选的实施方案中，作为初级成核、次级成核和延长的所有聚集步骤都被抑制。“初级成核”是指由单体亚单元产生寡聚体。“次级成核”是指纤维断裂和/或表面催化成核，其形成用于产生进一步的有毒寡聚体的催化位点。“延长(elongation)”是指向寡聚体中加入单体单元产生原纤维和纤维。“结合位点或口袋”是指蛋白质或其片段上的一个区域，其中配体可与该区域形成化学键(即通过非共价键合)。通常这样的位点是蛋白质中涉及侧链原子的疏水口袋，或者可以包括可与配体的极性部分相互作用的氢键受体/供体。用于识别结合位点的技术在本
技术领域：
：是众多的，且被本领域的技术人员所熟知。这种情况下的黄金标准是使用x射线晶体学来确定靶蛋白和药物之间复合物的结构。在这种情况下，确定结合位点并不简单，同样是由于上述相同的原因，即结合结构的不稳定性和瞬时性妨碍了它们结构的表征以及随后确定精确的结合位点。这再次支持了这项技术的力量；如下所述，不需要这些知识来识别其他抑制剂。在上述方法的另一个实施方案中，初始抑制剂(已知或预测的抑制剂)可由以下方法识别。从文献中报导的结合易聚集蛋白质的约10-100种已知(或预测)的抑制剂的较小的库开始，产生靶片段的库。优选的是，这种片段的分子量(mw)低于300da。这些片段进一步得到筛选，以识别对易聚集蛋白有低结合亲和力的片段。优选的是，所选片段的kd为100微摩尔至10毫摩尔的范围。在一个实施方案中，在已知数据库中针对化学相关的化合物筛选所选片段。优选的是，数据库选自chembl(https://www.ebi.ac.uk/chembl/)、pubchem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)、zinc(http://zinc.docking.org/)和/或drugbank(http://www.drugbank.ca/)。替代地，数据库可由第三方提供，例如药物合作伙伴或合同研究组织。任选地，进一步筛选识别出的化合物得到fda批准的化合物，或者已经完成成功的i期试验的化合物。在任一情况下，产生fda批准的或其他的已知(或预测)的抑制剂库。下一步，分析来自抑制剂库的至少一种已知(或预测)的抑制剂的作用，以确定抑制剂靶向的聚集的微观阶段。因此，在另一个实验方案中，该方法包括分析已知(或预测)的抑制剂对易聚集蛋白的聚集动力学的影响，如下所述。在进一步的实施方案中，该方法包括选择抑制初级和/或次级成核的已知或预测的抑制剂。一旦识别出小分子，除了此处建议的上述方法(也称为基于类似结构的药物发现(qbsdd)-参见实施例ii)之外，数据库(如上所述的数据库)的虚拟筛选，可使用抑制剂的骨架进行。在一个实施方案中，高度相关的结合伴侣与结合伴侣具有相似的结构和/或相似或相同的生物学功能并/或与结合伴侣相同的配体进行相互作用。例如，类视黄醇受体rar和rxr都与类视黄醇结合。在一个实施方案中，相似的结构可指结合伴侣共享至少一个保守的结构域或基序。替代地，结合伴侣可与彼此共享高核苷酸或氨基酸序列同一性，优选至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性或相似性。如arosio等人所解释(28)，动力学分析首先应用于说明易聚集蛋白在不存在任何化合物的考虑下的聚集机制。随后在至少一种化合物的存在下重复分析，以识别化合物对动力学曲线的影响。因此，在优选的实施方案中，分析至少一种化合物对所述易聚集蛋白的聚集动力学的影响包括：在不存在和存在化合物的情况下产生所述蛋白质的动力学曲线。如果化合物引起动力学曲线中的相对速率的移动或变化，则该化合物被识别为抑制剂。如上所述，优选地，动力学曲线是s形曲线，其中所述曲线至少包括分别代表初级成核、次级成核和延长的滞后阶段、其后的生长阶段、以及其后的停滞阶段，其中至少一个化合物改变这些阶段中的至少一个。在一个实施方案中，抑制剂增加滞后阶段的长度、降低生长阶段的陡度和/或延迟停滞阶段的开始。在所述方法的一个实施方案中，使用以下等式产生动力学曲线：总纤维质量浓度的时间变化m(t)由以下综合速率定律描述其中动力学参数b±、c±、κ、κ∞和是两种微观速率常数组合k+k2和knk2的函数，其中kn、k+和k2分别是初级成核、延长和次级成核的速率常数。分子可通过抑制一个或多个单独的微观反应来干扰聚集过程。在进行高度可重复的实验后，我们可以通过采用上述等式来描述宏观聚集曲线来识别被化合物抑制的微观事件，并比较在不存在和存在小分子的情况下，描述纤维形成的时间变化所需的这一组微观速率常数k+k2和knk2。在上述方法中，“易聚集蛋白”可认为是任何淀粉样蛋白。“淀粉样蛋白”是指作为不溶性纤维沉积的蛋白质，主要存在于器官和组织的细胞外空间中，这是由于被称为淀粉样变性的病症引起的蛋白质折叠发生连续变化的结果。淀粉样纤维蛋白在组织沉积物中以刚性非分支纤维发生，直径约10nm，其结合刚果红并当通过偏振显微镜观察染色沉积物时显示绿色、黄色或橙色双折射。当从组织中分离并通过x射线衍射分析时，纤维显示出特征性β衍射图(54)。“淀粉样蛋白”也是标准术语，且分类为淀粉样蛋白的蛋白质可在isa淀粉样蛋白纤维蛋白术语列表中找到，其通过引用并入本文。在优选的实施方案中，淀粉样蛋白选自aβ42、α-突触核蛋白、tau、亨廷顿蛋白、atrophin-1、ataxin(1,2,3,6,7,8,12,17)、胰岛淀粉样多肽、朊病毒蛋白、(pro)降钙素、心房利钠因子、载脂蛋白ai、载脂蛋白aii、载脂蛋白aiv、血清淀粉样蛋白、medin、(apo)血清aa、催乳素、转甲状腺素蛋白、溶菌酶、β-2微球蛋白、纤维蛋白原α链、凝溶胶蛋白、角蛋白、β-淀粉样蛋白、胱抑素、abripp免疫球蛋白轻链al、免疫球蛋白重链、s-ibm、胰岛淀粉样多肽、胰岛素、乳粘素、角质上皮、乳铁蛋白、tbn、白细胞趋化因子-2、abripp、adanpp、肺表面活性蛋白、半乳糖凝集素7、角质素、乳粘素、角质上皮、牙源性成釉细胞相关蛋白、semenogelin1和enfurvitide。优选的是，淀粉样蛋白选自aβ42、α-突触核蛋白、tau和亨廷顿蛋白。更优选的是，淀粉样蛋白是aβ42。在本发明的另一个方面，提供了通过上述方法获得或可获得的蛋白质聚集抑制剂。在本发明的另一方面，提供了产生抵抗易聚集蛋白的聚集的药效团的方法，该方法包括：-提供蛋白质聚集的至少一种抑制剂；-从所述至少一种抑制剂中产生抑制剂骨架；-将至少一种化学取代引入抑制剂骨架(任选地抑制剂)中的至少一种组分，并分析所述至少一种化学取代对所述易聚集蛋白的聚集曲线的影响，其中分析对聚集曲线的影响包括在不存在和存在具有所述化学取代中的至少一个的抑制剂骨架或抑制剂的情况下产生所述蛋白质的动力学曲线(如本文所述)，并且如果所述化学取代在动力学曲线中引起变化(如本文所述的“变化(shift)”)，则识别该取代为阳性结果；以及-通过比对来自动力学分析的阳性结果，产生抵抗易聚集蛋白的聚集的药效团。该方法的第一步中的抑制剂可通过本文描述的方法进行识别。该方法的第二步可另外使用已知或预测的抑制剂(如上所述用于识别蛋白质聚集的抑制剂的方法)来产生抑制剂骨架。术语“药效团(pharmacophore)”定义为空间和电子特征的集合，是确保与特定生物靶标的最佳超分子相互作用以及触发(或阻断)其生物反应所必需的。在本文中，发明人开发了一种产生抗易聚集蛋白(即抑制易聚集蛋白的聚集)的药效团的方法。在一个实施方案中，易聚集蛋白质是淀粉样蛋白，优选aβ42。由上述方法获得的药效团一旦产生则有许多用途。例如，药效团可用于筛选化学上多样的化合物库，以识别具有与药效团相适应的类似生物化学特征并因此是潜在的蛋白质聚集抑制剂的化合物。因此，还提供了使用上述方法识别的药效团来筛选化合物库的方法，以识别蛋白质聚集的至少一种抑制进一步的抑制剂，其中蛋白质是易聚集蛋白质。药效团可通过使用各种药物化学计算软件代码来得到识别。在这种情况下，发明人首先使用corina(55)(通过引用并入本文)产生每种化合物(即抑制剂)的3d构象。corina(coordinates，坐标)是一种自动从2d到3d转换的软件，它可以纯粹根据分子的构成(如通过连接表或线性代码表示)生成分子原子的三维坐标。通过将单中心片段和标准的键长和键角、以及适当的二面角(由小分子晶体结构中构象偏好的统计分析确定)相结合，corina能获得稳健可靠的结果，即使是对具有大环的复合物或金属。因此，在一个实施方案中，抑制剂骨架可通过使用本领域已知的程序(如corina)产生抑制剂的3d构象来衍生得到。这些构象随后用于pharmagist软件(56)(通过引用并入本文)的输入。pharmagist从一组已知与靶受体结合的类药物分子中阐明3d药效团。它通过间接方法执行此操作，其中受体的结构是未知的，且唯一可用的信息是已经观察到与受体有相互作用的一组配体。这些间接方法最具挑战性的一个方面是获得配体的特定构象，尤其是当它与受体相互作用时。pharmagist通过配体的多个灵活比对来解决这个问题，其中灵活性在比对过程中以确定的方式明确地处理。这允许快速且可靠地检测药效团，并具有检测异常分子的能力，以及在分子子集中找到常见的药效团。pharmagist采用的算法涉及使用一个配体作为枢轴来比对其余配体。通过特征的叠加计算成对比对，并将所有比对组合成多个比对。尽可能多的成对比对匹配的枢轴特征的重要子集得到识别。在这种情况下，产生的药效团的特征与用作输入的所有配体相匹配。对于rar/rxr调节剂的特定骨架，可注意到，对接头组分的修饰允许化合物保持其抑制活性，尽管程度不同。例如，接头长度的轻微增加以及烯烃位置的改变(来自贝沙罗汀的ttnpb)会引起抑制活性的增加，而将烯烃取代基改为酰胺键不会引起显著的活性变化。最重要的是，观察到涉及向化合物的疏水区域增加更多疏水基团的延伸策略也可用于增强其抑制活性。他米巴罗汀的接头位置的交换，其具有极大延伸的疏水区域，导致化合物bms195614的初级成核抑制活性大幅增加。在具有更加延伸的疏水区域的ttnpb接头中较小的烷基取代基变化(这得到化合物bms493)之后也可观察到相同的效果。因此，化学取代可包含技术人员已知的任何取代，其中这种取代被引入抑制剂骨架的任何区域中。实际上，在任何给定的抑制剂骨架中的化学取代可以是保留化合物抑制活性的任何取代，且可由立体观察和电荷相互作用等获得。这种合适的取代可由技术人员容易地确定。易聚集蛋白质如上所定义。在进一步的实施方案中，提供了通过上述方法获得或可获得的药效团。在本发明的另一方面，提供了抑制aβ42的聚集的药效团，其中药效团包含九个特征：代表羧酸基团的在末端的两个氢键受体和一个带负电的特征，连接至五个疏水特征的一个芳香特征。估计从末端疏水基团到另一极性末端的水平距离为如图18b所示。在本发明的另一方面，提供了筛选化合物库以识别蛋白质聚集的抑制剂的方法，其中所述蛋白质是易聚集蛋白质，该方法包括筛选所述库并识别至少具有高亲脂性(ghose-crippen辛醇-水系数)和高膨松度(范德华体积)的化合物，其中所述亲脂性为4至8，更优选为4.6至7.4，甚至更优选为4.648至7.351，并且其中所述膨松度为30至41，更优选为31.7至40.81，在另一个实施方案中，该方法进一步包括另外筛选具有高芳香比的化合物，其中所述比例优选为0.3至0.7，更优选为0.35至0.61，甚至更优选为0.353至0.606。优选的是，抑制剂是aβ42聚集的抑制剂。甚至更优选的是，化合物是rar/rxr调节剂。在一个实施方案中，蛋白质聚集可分为至少三个微观阶段，即初级成核、次级成核和延长，其中所述抑制剂至少抑制初级和次级成核。在该实施方案中，这种抑制剂可用于抑制初级成核、次级成核和延长。在本发明的另一方面，提供了治疗阿尔茨海默病的方法，该方法包括向有需要的患者施用类视黄醇受体调节剂，其中所述调节剂选自：类视黄醇a受体(rar)激动剂，其选自阿达帕林、cd1530、ttnpb和ch55；类视黄醇a受体(rar)拮抗剂，其选自bms195614、le135、mm11253和bms493；类视黄醇x受体激动剂ss11237；以及类视黄醇x受体拮抗剂uvi3003。在本发明的另一方面，提供了一种用于治疗阿尔茨海默病的类视黄醇受体调节剂，其中所述调节剂选自：类视黄醇a受体(rar)激动剂，其选自选自阿达帕林、cd1530、ttnpb、和ch55；类视黄醇a受体(rar)拮抗剂，其选自选自bms195614、le135、mm11253和bms493；类视黄醇x受体激动剂ss11237；以及类视黄醇x受体拮抗剂uvi3003。在本发明的又一方面，提供了类视黄醇受体调节剂在制备用于治疗阿尔茨海默病的药物中的用途，其中所述调节剂选自：类视黄醇a受体(rar)激动剂，其选自阿达帕林、cd1530、ttnpb和ch55；类视黄醇a受体(rar)拮抗剂，其选自bms195614、le135、mm11253和bms493；类视黄醇x受体激动剂ss11237；以及类视黄醇x受体拮抗剂uvi3003。在一个实施方案中，类视黄醇受体调节剂的结构如下：阿达帕林cd1530ttnpbch55bms195614le135mm11253bms493sr11237uvi3003“治疗”是指通过医疗或手术方式管理患者。该治疗改善或减轻阿尔茨海默病的至少一种症状，并不需要提供治愈。该治疗可进一步包括任何已知的阿尔茨海默病的治疗，包括多奈哌齐(donepezil)、卡巴拉汀(rivastigmine)、加兰他敏(galantamine)和美金刚(memantine)。另一方面，本发明涉及药物组合物，其包括治疗活性量的类视黄醇受体调节剂和药学上可接受的载体。在一个实施方案中，调节剂选自：类视黄醇a受体(rar)激动剂，其选自阿达帕林、cd1530、ttnpb和ch55；类视黄醇a受体(rar)拮抗剂，其选自bms195614、le135、mm11253和bms493；类视黄醇x受体激动剂ss11237；以及类视黄醇x受体拮抗剂uvi3003。在另一方面，调节剂抑制蛋白质聚集的至少一个阶段，优选初级和次级成核(如上所定义)，更优选初级成核、次级成核和延长。药学上可接受的载体和/或稀释剂还可包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和/或抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。这些介质和试剂用于药物活性物质的用途是本领域所熟知的。除非任何常规介质或试剂与活性成分不相容，否则考虑将其用于治疗组合物中。在本发明的另一方面，提供了抑制易聚集蛋白的聚集的方法，其中易聚集蛋白是aβ42，该方法包括优选向有需要的患者施用蛋白质聚集抑制量的类视黄醇受体调节剂，其中所述调节剂选自：类视黄醇a受体(rar)激动剂，其选自他米巴罗汀、阿达帕林、cd1530、ttnpb和ch55；类视黄醇a受体(rar)拮抗剂，其选自bms195614、le135、mm11253和bms493；类视黄醇x受体激动剂，其选自ss11237和贝沙罗汀；以及类视黄醇x受体拮抗剂uvi3003。在替代的实施方案中，将调节剂加入到例如含有易聚集蛋白质的细胞培养物中，以抑制体外蛋白质聚集。在另一方面，提供了类视黄醇受体调节剂抑制易聚集蛋白的聚集的用途，其中所述易聚集蛋白是aβ42，且其中所述调节剂选自：类视黄醇a受体(rar)激动剂，其选自他米巴罗汀、阿达帕林、cd1530、ttnpb和ch55；类视黄醇a受体(rar)拮抗剂，其选自bms195614、le135、mm11253和bms493；类视黄醇x受体激动剂，其选自ss11237和贝沙罗汀；以及类视黄醇x受体拮抗剂uvi3003。为了完整性，他米巴罗汀和贝沙罗汀的结构如下：他米巴罗汀贝沙罗汀在上述方法或用途的一个实施方案中，蛋白质聚集可分为至少三个微观步骤，即初级成核、次级成核和延长，且类视黄醇受体调节剂抑制这些步骤中的至少一个。在优选的实施方案中，类视黄醇受体调节剂抑制初级和/或次级成核。在进一步优选的实施方案中，调节剂抑制所有微观阶段，其中调节剂选自mm11253、bms493、阿达帕林、cd1530和le135。尽管前述公开内容提供了在本发明范围内的主题的一般描述，包括制备和使用本发明的方法及其最佳模式，但提供以下实施例以进一步使本领域技术人员能够实践这项发明并提供完整的书面描述。但是，本领域技术人员将了解，这些实施例的细节不应理解为对本发明的限制，本发明的范围应从本公开附属的权利要求及其等效物来理解。根据本发明公开，本发明的各种其他方面和实施方案对于本领域的技术人员而言是显而易见的。“和/或”在此使用时，将被视为具体公开了与或不与另一个一起的两个指定特征或组分中的每一个。例如，“a和/或b”被视为具体公开了(i)a、(ii)b和(iii)a和b中的每一个，就像每个都在本文中单独列出一样。除非上下文另有指示，否则上述特征的描述和定义不局限于本发明的任何特定方面或实施方案，并且同样适用于所描述的所有方面和实施方案。上述申请，以及其中引用或在其起诉期间引用的所有文献和序列登记号(“引用文献”)和引用文献中引用或参考的所有文献，以及本文引用或参考的所有文献(“本文引用文献”)，以及本文引用文献中引用或参考的所有文献，以及本文或通过引用并入本文的任何文献中提及的任何产品的任何制造说明书、描述、产品规格和产品说明书，均通过引用并入本文，并用于本发明的实践中。更具体地，所有参考文献通过引用并入，其程度如同每个单独文件被具体和单独地指出通过引用并入。本发明在以下非限制性实例中得到进一步描述。实施例实施例i在此实施例中，我们描述了识别靶定aβ42的聚集的新型药物的药物发现策略。该策略由四个主要的步骤组成(图1)。首先，应用了基于片段的方法，从而识别可以干扰aβ的聚集的小分子(图1，步骤1)。基于片段的药物设计方法是基于有限数量的小分子的筛选，以识别具有低结合亲和力的片段，其kd值通常在高微摩尔至毫摩尔范围内(33,34)。当被组合在一起时，这些片段中的一些产生了含有多种有利的相互作用的分子，该分子与初始片段相比更紧密地结合至目的靶标。为了实施此策略，我们生成了来源于在文献中被报道与aβ42相互作用的88个化合物的164片段的集合。然后在四个小分子数据库(chembl、pubchem、zinc和drugbank)中筛选这些片段的化学上相关的化合物，导致了识别出16,850个分子。该基于片段的文库含有386个fda批准的药物，其具有成为用于临床前的先导开发的有效候选的潜力。事实上，这样的方法提供了令人兴奋的机遇，以改换现有被许可的治疗化合物用途用于ad中，具有与通过新型药物的发现方法相比提供到临床更快速的途径的益处(35,36)。为了测试此种策略，我们从此文库中选取了具有不同化学骨架的两个化合物，贝沙罗汀(bexarotene)和高牛磺酸(tramiprosate)(图1，步骤1)。已经在3期ad临床试验(编号：nct0088673)中失败的高硫磺酸，在临床前开发中被报道结合可溶的aβ种类，以将其维持在非纤维化形式，以在小鼠中降低aβ诱导的神经毒性并且降低淀粉样蛋白斑块以及大脑的aβ水平(37)。相反，贝沙罗汀仍处于2期临床试验中(编号：nct01782742)。该小分子是由fda批准的用于治疗皮肤t-细胞淋巴瘤的类视黄醇x受体(rxr)激动剂，并且已经示出在ad中在某种程度上修复认知功能的能力(38-44)。尽管这种活性已经被报道与载脂蛋白e水平的增加相关，并且因此与aβ42的清除增加相关，但冲突的报道已经被发表并且详细的作用机制仍然不确定(38-44)。事实上，此分子也已经被报道与胆固醇竞争结合至aβ42，因此抑制了它的胆固醇诱导的寡聚化(45)。在我们总体策略中的下一步骤是应用化学动力学，从而阐明目的蛋白质的聚集机制(图1，步骤2)。在aβ42的具体情况中，如在引言中所述，我们最近已经给出了该机制的综合说明(32)。然后在存在被选择的化合物时重复动力学分析，以识别被特异性地抑制的微观事件，并且因此界定该化合物与其相互作用的种类(图1，步骤3)。事实上，潜在的候选药物可以结合至单体、寡聚体或纤维表面或末端，并且因此可以影响不同的微观步骤。虽然单体的隔离可导致在所有微观事件的速率(即，初级成核kn、次级成核k2以及延长k+)中的降低，但预期将寡聚体隔离会影响kn和k2。在另一方面，根据抑制剂是否结合至纤维末端或表面，将纤维靶定可以分别降低k+或k2(28)。最后，我们评估了该分子对体内的有毒种类的形成的观测到的影响(图1，步骤4)。在aβ42的聚集中的特定的微观步骤的抑制，被预期对有毒的寡聚体的生成具有不同的效果(28)。更具体地，抑制初级成核将强烈地延迟聚集反应，并且不应影响在反应期间生成的有毒的寡聚物的总荷载。然而，有毒的寡聚体的数量的增加或减少，分别被预计为延长或次级成核的抑制的结果(28)。后面的两种过程代表了可交替的通路，因为预期抑制延长将聚集反应重新转向至次级成核，这从而将增加有毒的寡聚体的数量，反之亦然。贝沙罗汀延迟了aβ42纤维形成，但高硫磺酸没有为了研究被选择用于此研究的两种小分子对aβ42的聚集过程背后的个体的微观步骤的影响，我们依次实施了聚集曲线的全局分析(图2)，该曲线在不同浓度的aβ42及两种化合物中的每一种处获得。我们使用了如前文所述的重复性高的基于tht的方案，在不存在和存在贝沙罗汀和高硫磺酸时监测在体外的aβ42纤维的形成(31)。不同于较早的报道(37)，我们观测到即使在过量20倍存在时高硫磺酸对aβ42的聚集仍没有影响(图2a)。相反，我们观测到随着贝沙罗汀的浓度增加在aβ42的聚集中的进行性延迟(图2b,c)。作为总蛋白浓度的函数的在这样的反应曲线中的半衰期的标度遵循幂次定律，其指数含有关于宏观聚集行为背后的微观事件重要的信息(32)。在存在贝沙罗汀时，尽管聚集反应的滞后时间随着浓度增加而增加，但是标度指数仍然不受影响。该结果表明，在这些条件下，贝沙罗汀通过抑制初级成核延迟了聚集反应，但并不影响初级成核和次级成核对整体聚集反应的相对贡献。这些实验示出了贝沙罗汀对aβ42的聚集的影响是可观的。向2μmaβ42的样品中加入过量4倍的贝沙罗汀，使得与单独的aβ42相比，聚集反应的半数完成的时间增加了两倍(即，对于单独的aβ42为2.30±0.02h，而在存在贝沙罗汀时为4.50±0.06h)(a)。为了进一步探测这种影响，并且为了排除贝沙罗汀对tht结合至aβ42纤维的任何可能的干扰以及因此对产生的荧光的任何可能的干扰，我们在不存在tht的条件下，通过在一系列不同时间点将等份的溶液移除，并且使用原子力显微镜(afm)和免疫荧光测量纤维形成的程度，从而监测纤维的形成(图3b-d)。在整个反应收集级分，从而尽可能完全地监测在aβ42聚集的三个阶段(即，滞后、生长和饱和)期间的事件。afm图像显示，在2.1h之后，纤维化的结构在不存在贝沙罗汀时是可见的，而非在存在其时；因此为贝沙罗汀诱导的纤维形成的滞后提供了独立证据(图3b)。通过在聚集期间的九个不同时间点使用序列敏感的w0-2或纤维敏感的oc的第一抗体来探测aβ42的数量(参见“方法”部分)，扩充了这些结果(图3c)。w0-2抗体识别遍及序列的残基4-10(即，n端)，其不可能涉及任何聚集种类的疏水核心，并且因此结合至所有类型的aβ种类。w0-2抗体表明了在aβ42聚集反应期间的不同时间点存在相似数量的aβ42(图3，上图)，然而只识别纤维种类的纤维特异性的oc抗体(图3，下图)，与动力学分析和afm图像一致地，示出了在所需用于聚集过程的半数完成的时间中的2h的延迟。我们通过比较点印迹试验的点的强度，进一步探测了被转换成纤维的aβ42的数量，该试验使用了oc-纤维抗体在浓度范围在4和0.1μm之间的aβ42纤维上被执行(图3d)。在新鲜制备的4μm单体的aβ42的溶液孵育3h之后收集纤维(图3d，下图)，然后将该溶液稀释以生成浓度范围为从4μm至0.1μm的12个样品(图3d，下图)。点印迹数据的分析表明，在不存在和存在贝沙罗汀时，在2μmaβ42样品的反应半衰期时形成的纤维的数量(图3c，下图，时间点6和7)，事实上与1μm浓度的aβ42样品的聚集反应期间形成的纤维是非常相似的，与没有来自tht对聚集反应的干扰一致(图3d，下图)。贝沙罗汀特异性地抑制aβ42的聚集的初级成核然后，我们通过基于从主方程导出的速率定律匹配聚集曲线，实施了贝沙罗汀的影响的定量分析，该主方程使纤维的数量的宏观时间演化与不同的微观事件的速率常数相关(28,29)。在此方法中，通过将对在不存在抑制剂时评估的每个微观速率常数的适当的微扰引入速率定律，描述了在存在抑制剂时的聚集曲线。然后，在存在不同浓度的抑制剂时所需来描述聚集曲线的速率常数的修正，表明由该化合物的存在影响的特定过程。在存在浓度范围为5-25μm的贝沙罗汀时，5μmaβ42的聚集曲线示出了当初级成核速率常数kn被特异性地降低时极其好说明实验数据。相反，实验数据与通过分别改变次级成核或延长的速率常数(k2和k+,)作出的预测不一致(图4a-c)。该数据因此揭示了，在这些条件下，贝沙罗汀特异性地修饰初级成核通路(即，knk+)，而对在聚集反应中的次级通路(即，k2k+)没有(或非常少)可检测的影响(图4d)。为了进一步巩固这些结论，在通过引入预先形成的纤维(即，种子)至反应混合物绕过初级成核步骤的条件下，我们实施了额外的一系列的aβ42的聚集动力学的测量。在这样的情况中，初级成核对反应动力学的贡献是可忽略的，因为通过由该种子促进的次级成核及延长反应极大加速了可溶性肽的向成熟的纤维的转换(22)。在存在10％纤维种子时，其中预先形成的纤维种子的延长是主要的机制，即使在过量10倍的贝沙罗汀时仍没有观测到对2μmaβ42的聚集动力学的影响(图4e)，而在未接种的条件下相应的聚集过程被完全抑制了15h。进一步，我们还测量了2μmaβ42样品在存在5％的预先形成的纤维种子时的聚集动力学。在这些条件下，初级成核被完全绕过，然而表面催化的次级成核以及延长都显著地有助于整体动力学(图4f)。这些实验示出了浓度依赖的贝沙罗汀诱导延迟，该延迟与在表面催化的次级成核的速率中的降低相当(图4g、h)。这些发现示出了，尽管纤维的延长实质上不受贝沙罗汀影响，但是该化合物对aβ42的成核具有很大并且高度选择性的影响，该影响对初级成核更显著而不是次级成核。贝沙罗汀通过特异性地扰乱初级成核和次级成核来抑制aβ42的聚集的观测结果，可基本上由贝沙罗汀与aβ42单体的相互作用、或与初级寡聚体和次级寡聚体的相互作用或事实上与单体和寡聚体两者相互作用造成(图4f)。然而，在此所研究的条件下(28)，与单体的结合将在整个反应中影响所有的微观步骤的速率(28)；使我们能够作出贝沙罗汀特异性地主要与aβ42寡聚体相互作用的结论。nmr光谱测量进一步支持了此结论，其中在25μm15n-标记的单体的aβ42的hsqc光谱中，在加入过量5倍的贝沙罗汀之前或之后没有观测到明显的化学位移的扰动，表明了与单体形式aβ42结合很可能是可忽略的。此外，这些发现提供了对于aβ42的初级寡聚体和次级寡聚体的结构特征的新见解，表明初级核和次级核可能具有相似的结构特征，并且因此可以以相似的方式与贝沙罗汀相互作用；以及表明aβ42的相同残基可以涉及初级成核和次级成核事件。将初级成核靶定延迟了aβ42的有毒种类的形成我们接着探索了由通过贝沙罗汀抑制初级成核造成的在aβ42的纤维形成中的延迟是否与在神经毒性种类的形成中的延迟相关，因为在aβ42的聚集中的不同微观步骤的扰动对有毒寡聚体的生成速率有不同影响(28)。因此，例如，降低初级成核速率被预期来延迟整个聚集反应过程但不影响在反应期间生成的有毒寡聚物的总数量(28)。然而有毒寡聚物的数量的增加或降低很可能分别由延长或次级成核的抑制造成(28)。为了检查该问题，在不存在和存在过量20倍的贝沙罗汀时，我们从在0.5μm的aβ42溶液的聚集反应中初级过程和次级过程中执行了寡聚体的形成总速率的数值模拟(参见方法)。因为贝沙罗汀优先地靶定初级成核，可以预期是延迟了整个聚集过程，即将有毒种类的生成延迟而不一定将有毒种类的数量降低。基于我们之前的发现，初级成核是一个非常快速的过程，其一旦已经形成少量临界浓度的种子，就被次级成核直接地绕过(22)。我们因此已经使用了aβ42的最低浓度，在该浓度可以观测到聚集(31)，并且在存在高浓度的贝沙罗汀时监测它的聚集，从而尽可能强烈地抑制初级成核步骤。这样的模拟示出了，在存在贝沙罗汀时通过延迟aβ42的初级成核，在aβ42寡聚体的形成中出现延迟，但不降低随着聚集过程的时间进程形成的寡聚体的总数量(图5a,b)。事实上，寡聚体的形成遵循抛物线的演化，因为在单独的aβ42的聚集期间形成的寡聚体数量在某点处开始下降，在该点处在存在贝沙罗汀时的该数量开始增加。为了验证这些预测，在不存在和存在过量20倍的贝沙罗汀(即，10μm)时，通过评估凋亡早期标记半胱天冬酶-3的水平，我们测试了在人成神经细胞瘤细胞(sh-sy5y)中的细胞毒性，该细胞毒性由0.5μmaβ42的聚集造成(参见“方法”部分)。事实上，半胱天冬酶-9是引发酶，其通过裂解效应半胱天冬酶的非活性形式并且引发凋亡的级联，在线粒体损伤之后调节凋亡通路并且激活效应半胱天冬酶(例如半胱天冬酶-3)。星孢菌素(staurosporine)，其是已知来激活凋亡通路的广谱激酶抑制剂，被用作阳性对照(参见“方法”部分)。在不存在和存在贝沙罗汀时，在聚集反应的停滞阶段期间在不同时间点移除等份的aβ42溶液，并且与sh-sy5y成神经细胞瘤细胞孵育。在它的单体形式中(在孵育之前，图5c)，aβ42没有示出可检测的毒性，不管贝沙罗汀是否存在。在不存在贝沙罗汀时，在孵育0.3h(图5d)和4h(图5e)之后形成的该种类展现了比在存在贝沙罗汀时高65±5％的毒性水平。然而对于孵育7h的样品，尽管单独的aβ的毒性下降，但在存在贝沙罗汀时生成的毒性水平增加至与在不存在其时观测的值相似的值。这进一步支持了细胞中的有毒种类aβ42的形成的贝沙罗汀诱导的延迟(图5f)。贝沙罗汀挽救了秀丽隐杆线虫(c.elegans)模型中的aβ42调节的功能失调我们进一步评估了在aβ42调节的功能失调的秀丽隐杆线虫模型(表示为gmc101(被称为aβ-蠕虫模型))中贝沙罗汀对有毒种类aβ42的形成的影响(46)，并且比较了贝沙罗汀的添加产生的效果与在对照的蠕虫模型cl2122中观测的效果，该cl2122不含aβ42(参见“方法”部分)。在gmc101模型中，aβ42被表达在体壁肌细胞中，其中它形成了聚合物并且导致了严重的年龄进行性瘫痪(46)。我们将蠕虫暴露至增加浓度的贝沙罗汀(5至10μm范围)，并且测量了表明肌细胞的状态的身体弯曲的频率以及在蠕虫体内的aβ42的聚集物的数量(图6)(参见“方法”部分)。在不存在贝沙罗汀时，与在对照蠕虫模型中的情况相比，在仅2天之后aβ-蠕虫模型的身体弯曲的频率显著地降低，在对照模型中仅9天之后才观测到运动性上相似的降低(图6b)。与这样区别一致的是，使用淀粉样特异性染料niad-4的荧光强度监测的聚集物的水平在两种模型之间显著地不同，在存在贝沙罗汀时aβ-蠕虫模型中蠕虫成年期的同一天基本上没有检测到聚集物(图6c,d)。我们然后探究了在秀丽隐杆线虫生命周期的幼虫阶段添加增加浓度的贝沙罗汀的效果(图6a)，并且观测了aβ-蠕虫模型的浓度依赖的运动性的维持。事实上，在l1和l4幼虫阶段以两次突然加入10μm的贝沙罗汀之后，aβ-蠕虫的运动性完全地被维持，即达到在对照蠕虫中观测到的水平(图4a,b)。此外，影像学研究(参见“方法”部分)表明，10μm的贝沙罗汀加入至aβ-蠕虫将aβ42纤维的形成抑制了成年期的9天(图6d)。在aβ-蠕虫中的aβ42表达的水平在不存在和存在贝沙罗汀时被发现是十分相似的(图6e)。这些结果表明，可以由通过贝沙罗汀阻止aβ42的聚集实现将在aβ-蠕虫中的运动性的水平维持。与此结论一致的是，贝沙罗汀的添加在对照蠕虫模型中没有显示任何影响。aβ-蠕虫在存在贝沙罗汀时观察到的正常的运动性可以与两种不同方案一致。一种可能性可以是在初级成核中的强力延迟，其可以大幅地延迟aβ42的聚集并且因此维持aβ-蠕虫模型的运动性至与对照蠕虫的运动性相似的值。或者，这些结果可以由对初级成核和次级成核的影响的组合引起。后者的可能性是尤其相关的，因为尽管贝沙罗汀优先地抑制初级成核，但是当在过量时也可以影响次级成核。事实上，我们在5％的种子以下的实验示出了，贝沙罗汀也能够作用在表面催化的次级成核上(图4f-h)。此外，我们还观测到仅在第2天加入贝沙罗汀没有示出对aβ-蠕虫的运动性的任何可检测的影响，表明了从体外研究中的发现在体内也是如此，即贝沙罗汀特异性地影响在aβ42聚集中的成核事件。讨论我们已经描述了旨在用小分子靶定aβ42的聚集的药物发现策略。该策略涉及从基于aβ-特异片段文库中识别化合物；以及涉及随后应用化学动力学来获得抑制的分子机制的基本了解(图1)。我们已经发现尽管高硫磺酸对aβ42的聚集没有影响，但是贝沙罗汀通过降低初级成核的速率选择性地干扰了aβ42的聚集的最早阶段。我们也观察到，该影响不仅在体外而且在细胞和体内都显著地抑制了整体聚集反应的速率，因为贝沙罗汀被发现抑制在细胞和秀丽隐杆线虫中的毒性种类的形成。此外，我们已经示出在秀丽隐杆线虫生命周期的最早阶段给予足够浓度的贝沙罗汀，能够维持表达aβ42的蠕虫的运动性在能够与不表达aβ42的蠕虫相当的水平，因此进一步支持该分子的预防效果(48-50)。我们预期我们在本文中所述的策略将能够识别另外的能够抑制aβ42的聚集的化合物，以及界定受每一个化合物影响的特异性的微观步骤(即，初级成核或次级成核或延长)。这些结果应该使一定范围的化合物能够被识别，来首先在体外然后在体内控制和调节聚集的开端以及它的进程的速率。此外，在本文中所述的结果表明了，贝沙罗汀和其他的初级成核抑制剂具有潜力成为降低聚集水平(即形成初级核并且扩增的可能性)的有效手段，从而我们的天然保护机制可以对更多高龄老人仍然有效。事实上，我们将在本文所呈现的策略和使用降低了胆固醇的水平并且因此降低心脏病症的风险的他汀类药物的策略之间进行类比，并且表明了这样的分子可以有效地作为“神经他汀类”。除了例如用于预防目的的贝沙罗汀的分子的用途之外，可能推测是，靶定对于毒性种类的生成负主要责任的次级成核(30)，将形成开发降低ad进程的速率的治疗的基础。结论我们在此研究中描述了用于识别潜在的抗-ad药物的综合策略的开发和应用。该策略基于理解抑制过程的分子细节，以合理的方式建立了识别有效的治疗制剂的机会，该方式能够最终导致防治ad的成功药物。最后，考虑到蛋白质的聚集的普遍现象，本策略提供用于合理设计和新型治疗剂的评估的框架，以靶向其他形式的神经退行性疾病。实施例i的材料和方法aβ肽的制备重组的aβ(m1-42)肽(mdaefrhdsgyevhhqklvffaedvgsnkgaiiglmvggvvia(seqidno:1))，本文称为aβ42，在bl21gold(de3)大肠杆菌菌株(stratagene,ca,u.s.a.)中被表达并且纯化(如前文所述，略有修改)(51)。简而言之，纯化的步骤涉及大肠杆菌细胞的超声处理，包含体在8m尿素中的溶解以及在二乙氨乙基树脂上以成批的方式进行的离子交换和冻干。使用superdex75hr26/60柱(gehealthcare,buckinghamshire,u.k.)进一步纯化冻干的级分，使用sds-page分析洗脱液中的所期望的蛋白产物的存在。将含有重组蛋白的级分合并、使用液氮冰冻、并且再次冻干。通过在37℃含有500mlm9分批基础培养基的1l培养瓶中培养被转化的bl21gold(de3)大肠杆菌菌株(stratagene,ca,u.s.a.)，制备同位素标记的15n-aβ42。简而言之，将在含有100μg/l氨苄青霉素的lb培养基中生长过夜至饱和的20ml预培养物1/25稀释在补充有100μg/l的氨苄青霉素的2yt培养基中，并且在37℃下生长。当在600nm处od值达到0.5时，将细胞收获、在基础培养基中洗涤、并且孵育在1/4的起始培养体积的含有100μg/l氨苄青霉素并补充了15nh4cl(2g/l)(cambridgeisotopeslaboratories)的m9基础培养基中。在诱导之前，细胞在37℃生长2小时。然后将iptg加入至1mm的终浓度，并且细胞在37℃下生长过夜。如上文所述执行15n-aβ42的纯化。从sigma-aldrich处获得化学制品(包括贝沙罗汀和高硫磺酸)并且是可获得最高纯度。用于动力学实验的样品的制备通过将冻干的aβ42肽溶解在6mguhcl中来制备单体的肽溶液。使用superdex7510/300gl柱(gehealthcare)以0.5ml/min的流速从可能的寡聚体种类和盐中纯化单体形式，并且在补充有200μmedta和0.02％nan3的20mm磷酸钠缓冲液(ph8)中洗脱。收集峰的中心，并且使用ε280＝1400lmol-1cm-1从积分峰面积的吸光度中测定肽的浓度。用缓冲液稀释获得的单体至所需浓度并从1mm原液中补充了20μm硫磺素(tht)。将所有样品制备在冰上的低结合的eppendorf管中，小心使用移液以避免引入气泡。然后将每个样品吸取进入96孔半区、低结合、透明底部及peg包被的板(corning3881)的多个孔中，每孔80μl。对于接种的实验，仅在该实验之前制备预制成的纤维。正如上文所述建立用于在含有200μmedta、0,02％nan3和20μmtht的20mm磷酸钠缓冲液(ph8)中的4μmaβ42样品的动力学实验。监测tht荧光3小时以验证纤维的形成。然后从孔中收集样品进入低结合的管中，并且在室温超声浴中超声处理2min。在所考虑的条件(即，4μmaβ42)下，在平衡时单体的浓度是可忽略的(31)。纤维(以单体的等同物)的最终浓度被认为等于单体的初始浓度。然后加入纤维至新鲜制备的单体，从而达到5％或10％的纤维最终浓度。在所有的情况中，首先使贝沙罗汀溶解在100％dmso中至5mm的浓度，然后在肽溶液中稀释以达到最大1％的最终dmso浓度。我们验证了1％dmso的加入在反应混合物中对aβ42的聚集没有影响。动力学试验通过将96-孔板放置在37℃处于静止条件下的酶标仪(fluostaromega,fluostaroptima或fluostargalaxy,bmglabtech,offenburg,germany)中开始试验。用440nm激发滤光片以及480nm吸收滤光片通过板底部来测量tht荧光。然后每个样品重复三次测量tht荧光。理论分析通过下述综合速率定率示出了总的纤维质量浓度m(t)的演化(30,32)其中，动力学参数b±、c±、κ、κ∞和是两种微观速率常数的组合k+k2和knk2的函数，其中kn、k+和k2分别是初级成核、延长以及次级成核速率常数。贝沙罗汀可以通过抑制一种或多种个体的微观反应来干扰聚集过程。通过应用上述等式以描述在图4中示出的宏观聚集曲线，以及通过比较微观速率常数k+k2和knk2的集合，我们可以识别通过化学化合物抑制的微观事件，该集合被需要来在不存在和存在贝沙罗汀时描述纤维形成的时间演化。如图4所示，在未接种的聚集反应中化学化合物的存在主要地扰乱了初级成核速率。在图5a,b中报道的数值模拟示出了，根据等式1模拟的在存在和不存在贝沙罗汀时的反应曲线。根据该等式已经模拟了成核速率的时间演化r(t)r(t)＝k2m(t)m(t)2+knm(t)2通过固定用于接种了5％预先形成的纤维种子的2μmaβ42溶液的k+和k2参数，进行了在图4f中的模型模拟。然后kn参数被降低至几乎可忽略的值(～0)。当初级成核过程没有发生时，这表明了对反应曲线的不显著的干扰。afm成像从聚集反应中移除aβ42样品，并且将其直接地沉积在新鲜切割的云母片表面上并且使其可以干燥30分钟。然后用超纯水(milli-qwater)将样品洗涤，并且用氮气干燥。使用veecodimension3100原子力显微镜(brucker)和jpknanowizard软件(cambridge,uk)获得afm图像。以敲击模式(tappingmode)在空气中使用共振频率在65和130khz之间的n-型硅悬臂梁运行该仪器。点印迹试验使用aβ42纤维特异性抗体(oc,millipore)或aβ42序列特异性抗体(w0-2,millipore)执行印迹法。在不存在和存在过量4倍的贝沙罗汀时的2μmaβ42的聚集的时间进程的期间(图3)，在不同时间点从混合物中移除等份的4μl和2μlaβ42用于分别与oc或w0-2印迹反应。在硝化纤维膜(0.2μm,whatman)上点样等份aβ42，然后将该膜干燥，然后在免疫检测前用blockingone(nacalaitesque)封闭。根据制造商的说明书使用oc和w0-2。随后加入alexa488-缀合的第二抗体(lifetechnologies)，并且使用typhoontrioimager(gehealthcare)进行荧光检测。将dmso-溶解的贝沙罗汀加入至aβ42，终浓度为1％dmso。对于校准曲线(图3d)，在新鲜制备的aβ42纤维上执行一系列在4μm和0.1μm之间的稀释，并且将4μl等份沉积在同一的硝化纤维膜(0.2μm,whatman)上，作为用于oc纤维特性抗体的。注意，在不存在和存在贝沙罗汀时还使用了寡聚体特异性a11抗体来检测aβ42寡聚体的形成的评估。然而，由于它们在aβ42的聚集期间浓度非常低，即使当沉积在膜上的体积高达20μl时，在这些条件下我们仍不能检测到寡聚体。nmr实验对于nmr分析，如上文所述纯化15n-aβ42，不同之处在于凝胶过滤的缓冲液为50mm乙酸铵(ph8.5)。将15n-aβ42的冻干粉末以约1mm的浓度溶解在0.2％(v/v)铵溶液中，然后收集并等份储存在-80℃直至使用。通过存在和不存在2.5％dmso中的过量5倍的贝沙罗汀时，将冻干粉末以25μm的浓度溶解在含有10％(v/v)2h2o的磷酸钾缓冲液(ph7.4)中，制备nmr样品。检查该混合物的ph是否出现由于贝沙罗汀的加入而可能引起的ph变化，然后发现其无变化。在装配有低温探针的brukeravance-500分光仪上做出nmr光谱测量。该探针的温度被设定至278k。在500mhz的1h观测频率下记录1h-15n异核单量子关系(hsqc)光谱，其中具有128(t1)×1,024(t2)个复合点，每t1增量32个扫描。15n维度的光谱宽度为1,216hz，以及1h维度的光谱宽度为6,010hz。使用1h-15nhsqc光谱在贝沙罗汀与单体的aβ42的摩尔比例增加的情况下监测化学位移扰动(csp)和强度变化。将不含化合物的dmso的参比样品也滴定到aβ42样品中。因此从在用化合物滴定期间观测到的csp和强度比例中减去由于dmso的加入而导致的。根据δδ＝((δδn/5)2+(δδh)2)1/2计算csp。通过topspin2.1(bruker)处理nmr光谱。通过sparky程序(https://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/)执行谱线归属和强度的计算。选择样品制备方案和低的nmr探针温度(5℃)，以确保在整个数据获取期间aβ42肽保持单体。hsqc光谱是具有极低色散的共振频率的固有无序化肽的典型光谱。半胱天冬酶-3细胞毒性试验已知aβ42寡聚体对细胞有毒性，导致凋亡以及细胞死亡。在不存在和存在贝沙罗汀时，在用aβ42孵育时的神经母细胞瘤细胞系中，通过测量半胱天冬酶-3(凋亡的早期标记物)的活性，执行细胞毒性试验(52)。在标准条件下，在37℃、在含5％co2的潮湿培养箱中，培养sh-sy5y人神经母细胞瘤细胞。以每孔25,000个的密度将细胞接种在白壁、透明底部的96孔板中，并且在mem/f12(1:1)/10％胎牛血清(fbs)(gibco)中培养24h。然后将该培养基用预热的不含fbs的无酚红dmem替换，其中肽样品或napo4缓冲液以1:1稀释。在不同时间点(0、0.3、4和7小时)，从正在进行的聚集反应中，移除大约0.5μm的aβ样品(单独的或者在存在1％dmso终浓度中的过量20倍的贝沙罗汀时)，并且随后并行进行tht荧光。如上文所述建立聚集反应，不同之处在于由于其毒性而从中除去nan3的缓冲液。注意，在10μm，dmso-溶解的贝沙罗汀未示出任何毒性，并且因此与对照值相当。所有指定的时间点对应于在停滞阶段中的aβ42，从而监测在聚集早期的抑制。我们将一块单独的板用于每一个时间点，其具有单独的或在存在贝沙罗汀时的aβ的25个复制品。在测量细胞毒性影响之前，在存在该肽、缓冲液和培养基时进一步培养细胞24h。用在这些实验中使用的相同的缓冲液稀释的细胞培养基被包括在一些孔中，从而评估培养基和贝沙罗汀的固有荧光。作为阴性对照，我们向细胞加入了用于制备贝沙罗汀的缓冲液(含1％dmso的磷酸盐缓冲液)稀释的细胞培养基。对于阳性对照，将星孢菌素(1μm)加入至细胞2小时。使用apo-one均质半胱天冬酶-3/7试验(promega)测量半胱天冬酶-3/7的活性。在所提供的裂解缓冲液中1:100稀释荧光半胱天冬酶-3/7底物(罗丹明(rhodamine)110，双-(n-cbz-l-天冬氨酰-l-谷氨酰基-l-缬氨酰-天冬氨酸酰胺))，并且以1:1比例将其加入至细胞培养基。在optimafluostar酶标仪中在480nm激发波长/520nm发射波长下测量荧光。在每一个所使用的板中，根据阴性对照和阳性对照评估毒性。为了在不同板之间的比较，我们使用抛物线方程(y＝axb)将荧光值归一化，该方程与作为时间的函数的寡聚物的演化对应。分别将阴性对照和阳性对照设置至1和10。根据这些计算，在不存在和存在贝沙罗汀时aβ42的毒性具有在1和10之间的归一化值，并且因此可以在不同板之间进行比较。使用graphpadprism6.0执行统计分析。结果表示为平均值±sem。通过studentt检验或单因素方差分析执行统计分析，随后进行图基检验(tuckey’sposthoctest)。秀丽隐杆线虫实验在20℃对秀丽隐杆线虫繁殖使用标准条件(53)。简而言之，通过次氯酸盐漂白使动物同步化，在m9缓冲液中孵育过夜，并且随后在接种有大肠杆菌菌株op50的线虫生长培养基(ngm,uspagar)板上培养。通过灌输50ml的含op50的lb培养基并且在37℃使培养物孵育16h，使op50的饱和培养物生长。通过将350μl的饱和op50加入至每个板并且将板留在室温2-3天，将细菌接种在ngm板。在同步化之后第3天，将动物放置在含有5-氟-2'脱氧尿苷(fudr)(75mm,除非另有说明)的ngm板上，以抑制子代的生长。使用了以下的菌株：dvis100[unc-54p::a-beta-1-42::unc-543'-utr+mtl-2p::gfp](gmc101)。mtl-2p::gfp在肠细胞中产生gfp的组成型表达。unc-54p::a-beta-1-42在体壁肌肉细胞中表达在体内聚集的全长的人aβ42肽。将l4期或年轻成年动物从20℃转移至25℃，引起了用于gmc101的对照菌株dvis15[ppd30.38(unc-54载体)+mtl-2::gfp(pcl26)](cl2122)麻痹(57)。表型显然是wt.c.elegansvarbristol(n2)。世代时间为约3天。育雏数为约350。从英格兰布里斯托尔附近的蘑菇堆肥中分离。将贝沙罗汀原液(5mm，在100％dmso中)以适当浓度使用来接种9cmngm板。在室温(22℃)下将板放置在层流柜中1h，以进行干燥。在20℃下将作为l1期幼虫的秀丽隐杆线虫培养物转移到含化合物的培养基上64-72h。然后将作为年轻成虫的培养物转移至刚接种的9cm板，并且在整个实验中在23℃或25℃下孵育。以不同浓度的贝沙罗汀(浓度范围为在1％dmso中从5至10μm)实施实验。作为对照，使用仅用1％dmso接种的板。秀丽隐杆线虫的运动性试验所有的种群在20℃培养，并且从4h产卵期进行发育同步化。在产卵(时间为零)后64-72h将个体转移至23℃或25℃，并且在如所示的时间评估身体的运动。在不同年龄，用m9将动物洗涤出板，并且铺在未接种的6cm板上，在此之后使用自制的显微镜设置以30fps、0.75x放大率记录它们的运动30s或1min。除非另有说明，否则每个实验计数200只动物。所有实验被重复实施三次，并且示出了来自一个代表性实验的数据。使用graphpadprism软件(graphpadsoftware,sandiego,ca,usa)执行统计分析。使用imagej(nationalinstitutesofhealth,bethesda,maryland,usa)制作了视频，并且使用了由jesperpedersen开发的wrmtrck插件(http://www.phage.dk/plugins/wrmtrck.html)定量了身体弯曲频率。在活的秀丽隐杆线虫中的染色和显微镜检查将活的转基因动物与niad-4在一定浓度和时间范围内孵育，并且根据经验确定，用1μmniad-4(在m9缓冲液中含0.1％dmso)在室温下孵育活的动物4小时，给出了强的且可重复的染色。在染色之后，使动物在ngm板上恢复约24小时，以允许通过正常代谢的脱色。将被染色的动物固定在含有40mmnan3作为麻醉剂的2％琼脂糖垫上，在显微镜载波片上进行成像。用具有20x物镜和49004et-cy3/tritc过滤器(chromatechnologycorp,bellowsfalls,vermont,usa)的zeissaxioobserver.d1荧光显微镜(carlzeissmicroscopygmbh,jena,germany)捕获图像。使用imagej软件(nationalinstitutesofhealth,bethesda,maryland,usa)计算荧光强度，然后归一化为被校正的总细胞荧光(ctcf)。由于在肠道中的背景信号高，所以仅考虑头部区域。所有实验被重复实施三次，并且示出了来自一个代表性实验的数据。使用t检验确定统计显著性。免疫印迹分析为了比较在存在和不存在贝沙罗汀时的aβ的表达水平，在s-基底(10)中收集～3000个成虫，重复三次，然后在液氮中冷冻。然后在ripa缓冲液(50mmtrisph8,150mmnacl,5mmedta,0.5％sds,0.5％sdo,1％np-40,1mmpmsf,roche完全抑制剂1x(rocheholdingag,basel,switzerland))中提取样品，通过超声破碎，然后在4℃以16,000rpm离心10min。然后将团块和上清液分离。使用尿素/sds缓冲液(8m尿素,2％sds,50mmtris)溶解团块。将适当浓度的样品加入至lds样品缓冲液(1x)和样品还原剂(lifetechnologies,carlsbad,ca,usa)，并且在70℃加热10min。通过4-12％bis-tris蛋白凝胶(lifetechnologiescarlsbad,ca,usa)分解材料，然后使用印迹干燥系统(lifetechnologies,carlsbad,ca,usa)转移至硝酸纤维素膜，并且在4℃下5％牛血清白蛋白(bca)中封闭过夜。然后用被1:500稀释的mabn10抗aβ抗体(克隆w0-2(millipore,billerica,ma,usa))探测膜。用被1:5000稀释的抗α-微管蛋白(克隆b-5-1-2(sigma-aldrich,st.louis,mo,usa))重新探测印迹，以标准化总蛋白上样量。将alexa488缀合的第二抗体用于检测。实施例ii在前面的实施例中，我们识别了fda-批准的抗癌药物贝沙罗汀，其被发现通过优先地抑制初级成核步骤而基本上延迟了aβ42的聚集。可以获得该结果是得益于在药物发现中新的化学动力学方法的应用，在该方法中定量地分析了小分子对在aβ42的聚集中的特定微观步骤的速率的影响。事实上，在静止状态下，贝沙罗汀以浓度依赖的方式延迟了aβ42的聚集，该延迟与对初级成核步骤非常有选择性的影响一致(图7,左上)。有趣的是，在温和接种量条件下(即，5％的预先形成的纤维种子)，贝沙罗汀以浓度依赖的方式显著地降低了次级通路的速率。在这些条件下，初级成核步骤被完全地绕过，然而表面催化的次级成核以及延长仍然发生。然而，观测到的降低与在表面催化的次级成核的速率中的特定的降低一致，而不是在延长的速率中，因为在接种量高的条件(即，在存在10％预先形成的纤维种子时，其中延长是主要机制)下，可以观测到贝沙罗汀对aβ42的聚集没有影响。因此，发现贝沙罗汀是在抑制在aβ42的聚集的初级成核步骤和次级成核步骤中的有效分子，这种影响可能通过结合至初级核和次级核而出现。事实上，通过nmr光谱可以观测到贝沙罗汀对aβ42的单体种类没有影响。重要的是，贝沙罗汀对aβ42的聚集的在体外影响被发现与在细胞中以及在aβ-调节的毒性秀丽隐杆线虫模型中相似。事实上，我们已经示出了，由通过贝沙罗汀抑制成核步骤造成的在aβ42的纤维形成中的延迟，与在成神经细胞瘤细胞的神经毒性种类的形成中的延迟以及在aβ-蠕虫中的aβ42沉积的完全抑制和其影响相关。这些结果表明，通过例如贝沙罗汀的化合物预防aβ42的成核可以潜在地降低阿尔兹海默症的发病的风险，并且更普遍地表明，我们的基于动力学的药物发现策略提供了用于合理识别抵抗神经退行性疾病的一系列候选药物的总体架构。ii-通过基于类似结构的药物发现(qsbdd)策略的抗aβ42的小分子识别为了进一步识别抗aβ42聚集的小分子，我们开发了基于类似结构的药物发现策略(qsbdd)。在该方法背后的基本原理是，与贝沙罗汀相互作用的初级核和次级核在aβ42的聚集通路期间是不稳定的、十分缺乏并且瞬时出现。因此，它们的动力学和瞬态性排除了使用常规的生物物理学方法来表征它们的结构，其随后使基于结构的药物发现策略的应用非常受到挑战。为了克服此限制，我们应用了称为qsbdd的新策略，其基于以下假设：初级核和次级核共享共同的结构特征，该特征使它们可以与贝沙罗汀相互作用；并且该相同的结构特征很有可能与贝沙罗汀初始结合至的结构口袋共享。贝沙罗汀是由fda批准的用于治疗皮肤t-细胞淋巴瘤的类视黄醇x受体(rxr)激动剂。结合至rxr以及其配偶体类视黄醇a受体(rar)的配体，调节受体与其细胞内环境的通信，这本质上需要受体-蛋白以及受体-dna或受体-染色质的相互作用。受体是被编码在它们的配体的化学结构中的信息的介质，其因此用作双重的输入-输出信息处理器。rar–rxr异质二聚体(图7顶部，中间)被认为调节了天然配体的生理功能，并且因此是用于药物发现的有吸引力的靶标。过去几年的主要突破是，通过简单地修饰配体结构可以共同地或单独地解决大量各种通信过程的识别。此外，在不存在和存在贝沙罗汀的情况下，已经解决类视黄醇a和x受体两者的3-d结构(图7顶部，中间和右边)，并且配体至rar和rxr结合结构域(lbd)的结合机制是易于理解的并且在药学上被利用。利用关于i)lbd的原子结构以及ii)可用的rar和rxr的激动剂和拮抗剂的化学的可用数据，考虑到这些分子应该与贝沙罗汀相似地抑制aβ42的聚集，我们应用了qsbdd并且收集了十二个可用的激动剂和拮抗剂。事实上，在我们的基于tht的化学动力学试验中，已经测试了5个rar激动剂(即，他米巴罗汀(tamibarotene)、bms753、阿达帕林(adapalene)、cd1530、ttnpb、ch55)、4个rar拮抗剂(即，bms195614、le135、mm11253、bms493)、2个rxr激动剂(包括贝沙罗汀和ss1123)、以及1个rxr拮抗剂(即，uvi3003)。其后，我们已经将它们对于在aβ42聚集中的不同微观步骤的影响与贝沙罗汀的影响进行比较(图7，底部)。先前没有数据将rxr/rar受体的结构与aβ42的结构相联系。事实上，在qbsdd的基本原理中，小分子结合至结构瞬态且不稳定的aβ42，从结构的观点看其非常难以表征。这是促使搜寻新技术(例如本文所述的qbsdd)来识别新的抑制剂的主要原因之一。相应地，该方法可以被延伸来识别作用在对不同的错误折叠疾病负责的其他蛋白系统上的抑制剂。iii-rxr和rar配体不同程度地延迟aβ42的聚集为了研究所选择的rxr和rar配体对aβ42的聚集过程背后的个体微观步骤的影响，我们监测了在不存在和存在小分子时在体外的aβ42的纤维形成。由于小分子的疏水性质，以1％dmso终浓度制备后者。相应地，为了排除1％dmso对aβ42的聚集的任何影响，在不存在和存在dmso时使用点印迹法和基于tht的动力学随后平行地进行试验。没有观测到dmso对aβ42的影响。我们使用了纤维敏感的oc第一抗体在聚集反应的期间的十二个不同时间点探测了aβ42的数量，并且基本上定量了印迹的强度。纤维特异性的oc抗体仅识别纤维种类，其示出了在不存在和存在1％dmso时aβ42的相似的聚集曲线。使用了基于tht的动力学进一步确认了这些结果，该动力学示出了在不存在和存在1％dmso时的相同的s形曲线。有趣的是，无论tht或1％dmso是否存在，聚集反应的半衰期被发现是相似，因此排除了tht和1％dmso对aβ42的聚集动力学的影响。在过量3倍的12种小分子加入至2μmaβ42的溶液之后，我们观测到在aβ42的聚集中的差异化的延迟，除了bms753之外该延迟对于所有的小分子是显著的(图8a)。观测到的延迟在大多数情况中比贝沙罗汀的延迟更强，并且更有趣的是，十二种分子中的五种分子(即，mm11253、bms493、阿达帕林、cd1530和le135)在10-15个小时之内完全抑制了aβ42的聚集(图8a)。为了进一步监测此影响以及排除小分子对tht结合至aβ42纤维的任何可能的干扰并且因此对产生的荧光的干扰，使用与上述相似的纤维敏感的oc第一抗体，我们已经在聚集反应期间的十二个不同时间点探测了在存在1％dmso或小分子时被转化成纤维aβ42的数量。在点印迹试验中由小分子诱导的延迟被发现与在基于tht的动力学试验观测到的延迟相同，因此进一步支持了化学动力学试验在评估小分子在抑制蛋白聚集的影响中起关键作用。一致的是，相同的五种分子在10-15个小时之内完全地抑制聚集反应，与在基于tht的试验中观测的效果类似。为了更好理解通过后面的这些分子抑制aβ42的聚集的机制，我们在亚化学计量的小分子的条件下执行了相同的试验(点印迹法和基于tht的动力学)(图8b)。有趣的是，这些分子被发现极其有效，因为aβ42的聚集在存在亚化学计量的小分子时基本上被延迟。iv-根据在抑制aβ42的聚集中的效果将rar和rxr配体进行排序使用两种非相关的定量方法(即，基于tht和无标记的点印迹动力学试验)，发现rxr和rar配体不同程度地延迟aβ42的聚集。相应地，可以根据在抑制聚集反应中的效果，将分子分类。定量了来自点印迹法的印迹的强度，并且靠着在存在1％dmso时的aβ42的值将相应的值归一化。因此，将在聚集反应中的两个早期时间点的值相对于从基于tht的动力学中推导的半衰期(图8c,d)进行绘制。有趣的是，在点印迹强度和半衰期的值之间可以观测到线性相关，因此进一步支持了在我们的试验之间的一致性。该相关性允许根据它们在aβ42的聚集中诱导的延迟的程度，将rar和rxr配体分类成分子的集合。可以区分为三个分子集合(图8c、d)：集合a，其由显示对聚集的没有任何影响的一个分子bms753组成(图8b)；集合b，其由显示与过量3倍的贝沙罗汀的影响相似或更强的所有分子组成(图8b)；以及集合c，由以过量3倍完全抑制聚集的小分子组成且在亚化学计量进一步分析它们的影响(图8d)。此外，在集合b和集合c分子的每一个中，可以将化合物在彼此之间排序，其中uvi3003是集合b之内最有效的分子，因为它与贝沙罗汀相比大幅延迟了聚集，然而mm11253和阿达帕林是集合c之内最有效的分子，因为以过量0.5倍将2μmaβ42的样品的聚集延迟了至少3倍。此外，rar和rxr配体以浓度依赖的方式抑制了aβ42的聚集反应，其中集合c的分子能够以低至过量0.2倍显著地抑制聚集反应(图8e、f)。注意，即使在高至过量5倍时，bms753(即集合a)仍没有示出对aβ42的聚集动力学的任何影响。引人注目的是，rar和rxr激动剂和拮抗剂在增强或抑制它们相应受体的活性中的初始功能，以及它们在抑制aβ42的聚集的效果之间，没有观测到相关性。例如，集合b的分子由rar和rxr两者的激动剂和拮抗剂组成，以及集合c的分子由rar的激动剂和拮抗剂组成。v-使用化学动力学比较分析rar和rxr配体对aβ42的聚集中的特定微观步骤的影响然后，我们通过基于主方程推导的速率定律将聚集曲线进行匹配，实施了集合b和c的分子的影响的定量分析，该方程使纤维数量的宏观时间演化与不同微观事件的速率常数相关。在该方法中，通过将在不存在抑制剂时评估的微观速率常数的每一个的适当扰动引入速率定律，描述了在抑制剂的存在下的聚集曲线。描述在存在不同浓度的抑制剂时的聚集曲线所需的速率常数的修正，随后表明了受化合物的存在影响的特定过程。因此，监测了在存在增加浓度的小分子时初级通路的速率常数(knk+)对次级通路(k2k+)的速率常数的演化。a-在静止状态下，集合b和集合c分子对aβ42的聚集的影响在存在浓度范围为2-10μm的集合b和集合c的分子时，2μmaβ42溶液的聚集曲线，示出了当集合b过量倍数低于3以及集合c过量倍数低于0.5–1时特异性地降低初级通路knk+时，非常好地描述该实验的数据。相反，在小分子的更高过量倍数时，实验数据与在初级通路(即，knk+)和次级通路(即，k2k+)两者的速率常数中的降低一致。这些实验揭示了，集合b和集合c的分子可以影响在aβ42的聚集反应中的两个通路，其中该影响在高浓度的小分子处是显著的(图9-10、11a-g、12a-e)。有趣的是，从在图9-10中的动力学曲线的形状中已经可以预测该影响，其中小分子以典型的方式影响观测到的动力学宏观曲线，即在相对于在不存在小分子时的aβ42的曲线，该曲线示出了在较高过量倍数处的不同斜率。b-集合b和集合c的分子对aβ42延长速率的影响为了揭开小分子对次级通路的个体微观步骤(即，表面催化的次级成核与延长)的影响，我们在存在小分子和10％的预先形成的纤维种子时，对该反应混合物实施了额外的一系列的aβ42的聚集动力学的测量，其中初级成核和次级成核步骤被绕过。在这样的情况下，通过由种子促进的延长反应极大地加速了可溶的肽成为成熟的纤维的转换。在存在10％纤维种子时，即使在过量5倍时，仍然没有观测到集合b的分子对2μm的aβ42溶液的聚集动力学的影响(图11h)；而在未接种条件下，相应的聚集过程被延迟了至少3倍(图8e)。通过从在不存在和存在集合b的分子时的动力学曲线中推导aβ42的生长速率，定量地对其进行了确认(图11i)。然而有趣的是，集合c的分子在过量5倍时使生长速率降低了25％(图12f,g)，因此解释了相对于集合b的分子的效力增加的集合c的分子的效力。注意，在过量0.5倍时，没有观测到集合c的对aβ42的纤维的延长的影响，因此表明抑制延长步骤需要比成核步骤更高浓度的小分子(图12h,i)。c-集合b和c的分子对aβ42的聚集的表面催化的次级成核速率的影响为了获得集合b和集合c的分子对aβ42的聚集的影响的完整的比较评估，我们还测量2μmaβ42样品在存在不同接种条件(即1％至5％)时的聚集动力学，旨在揭开小分子对表面催化的次级成核步骤的影响(图13-14)。事实上，早在…％的预先形成的种子已经被引入此溶液时，初级成核就被完全绕过。在另一方面，表面催化的次级成核和延长主要地有助于整体动力学，其中随着种子浓度增加延长的贡献变得更加显著。有趣的是，在存在温和接种浓度(即，1-5％的种子)时执行的试验，示出了在存在集合b和c的分子时aβ42的聚集的次级通路(即，k2k+)的浓度依赖的抑制。在集合b的分子的情况下，在过量0.5-和5-倍时这样的降低仅可以归因于在表面催化的次级成核的速率(即，k2)中的降低，因为可以观测到在高至过量5倍时对纤维的延长(即，k+)没有影响(图11h,i)。可以从动力学曲线中推导该速率，并且发现其在存在过量0.5-和5-倍的集合b的分子时分别降低了至少50％和75％。这些发现示出了，虽然纤维的延长基本上不受集合b的分子的影响，但是这些化合物对aβ42聚集中的成核步骤有较大且高度选择性的影响，其中该影响对次级成核是显著的，因为低浓度的分子足够来显著地降低该速率。该观测进一步支持了，表面催化的次级成核作为在促进aβ42聚集的催化循环中的主要机制的关键作用。在另一方面，在集合c的分子的情况中，在延长不受影响的条件(即，在存在过量0.5-倍的小分子时)下，对表面催化的次级成核的速率的影响可以被量化。发现集合c的分子在抑制aβ42聚集中的表面催化的次级成核过程中，比集合b显著地更有效，其中在过量0.5-倍时该降低为高达75％，因此进一步确认相对于集合b的分子的效力而言集合c的分子更高的效力。为了进一步探测集合b和c的分子对在aβ42聚集中的表面催化的次级成核步骤的影响，我们执行了额外的实验，其中我们监测了在10％种子之下存在分子伴侣(丛生蛋白，clusterin)时小分子的影响。在这些实验之后的基本原理是，在10％种子之下，已存在的纤维将通过加入单体而在纤维末端处延长。然而，在存在分子伴侣丛生蛋白(已知其特异性地抑制aβ42纤维的延长步骤)时，纤维的末端被阻塞，并且因此表面催化的次级成核被预期被修复至一定水平，可以通过评估小分子对表面催化的次级成核的速率的影响来检测该水平。事实上，相对于aβ42，发现10％丛生蛋白将纤维生长的速率降低了大约40％，这表明近乎一半的纤维末端被丛生蛋白阻塞，并且因此预期10％的预先形成的纤维种子与含有5％的种子的溶液类似地影响aβ42的聚集动力学。其后在存在10％的预先形成的纤维种子和10％的丛生蛋白时，监测集合b和集合c的分子对aβ42的聚集的影响。有趣的是，这些实验示出了集合b的分子以浓度依赖的方式延迟聚集，而观测到在相应的没有丛生蛋白的反应中没有影响(图15a-c)。观测到的延迟因此与在表面催化的次级成核的速率中的降低一致。这些结果进一步支持了，在表面催化的次级成核通路和延长通路之间的机制的可交换性，其中抑制一个步骤将聚集反应重新定向至另一个。可以对由集合b的分子诱导的在速率中的降低进行定量，并且将其与在存在5％的预先形成的纤维种子时的降低进行比较(图15d)。有趣的是，在过量0.5-倍的集合b的分子时，在10％的种子和存在丛生蛋白时对aβ42的聚集的影响与在5％种子下观测到的影响是非常相当的。然而出乎意料的是，在过量5倍的分子时，当丛生蛋白和小分子都促进该影响时，在表面催化的次级成核的速率中的降低更加显著。考虑到在存在分子伴侣时的体内条件下，小分子被预期来更强烈地影响聚集，该发现是至关重要的。更高的影响可能是由小分子对在聚集的aβ42种类和分子伴侣之间产生的复合物的更高亲和力所致。在存在集合c的分子时，也观测到在10％种子下以及存在丛生蛋白时对aβ42的聚集的相同的剂量依赖性影响(图16a-c)。此外，在过量0.5倍的集合c的分子时，其中延长步骤不受影响，发现了与在存在5％的种子时观测到的降低相比，表面催化的次级成核的速率中的降低在存在丛生蛋白时更高，这与集合b的分子相似(图16d)。有趣的是，在存在过量0.5倍的集合c的分子时观测到的在表面催化的次级成核的速率中的降低，与过量5倍的集合b分子观测到的降低是相当的，因此进一步确认了与集合b的分子对aβ42聚集的表面催化的次级成核步骤的效力相比，集合c的分子的效力更高(即，至少高10倍)。d-小分子可能与其相互作用的靶标种类的识别集合b和集合c分子影响在aβ42的聚集中的不同的微观步骤的观测，可以基本上由沿着聚集通路的小分子与不同的aβ42种类的相互作用造成(图17a)。事实上，抑制初级成核和表面催化的次级成核可以由小分子与初级核及次级核和/或纤维表面的结合造成。在另一方面，通过集合c的分子抑制三个微观步骤对应于小分子结合aβ42的单体种类的情形，因为该单体涉及三个微观步骤。有趣的是，nmr光谱测量示出了，在集合c的所有分子和uvi3003(集合b的最有效的分子)的加入之前或之后，在25μm样品的15n-标记的单体aβ42hsqc光谱中，没有化学位移和强度的显著扰动(图17b)。这表明，集合c的分子可能结合至初级核及次级核和/或纤维表面和纤维末端(图17a)。这些发现一起表明，aβ42的初级核和次级核可能具有相似的结构特征，因为它们能够与集合b和集合c的分子相互作用，并且因此aβ42的相同残基可能涉及初级成核事件和次级成核事件。相反地，抑制在aβ42聚集中的延长步骤可能需要仅在集合c的分子中存在的额外的化学特征。事实上，在集合b中最有效的分子uvi3003示出了与集合c的分子的影响一样显著的对aβ42的表面催化的次级成核步骤的影响，即在过量0.5倍时在k2中75％的降低，而可以观测到即使在过量5倍时对延长步骤仍然没有影响。此外，这些实验表明，可能出现小分子的选择性的优先的顺序结合，并且因此它们从初级通路至次级通路连续地影响三个步骤，其中对表面催化的次级成核的影响比对延长步骤的影响更有利。在对该发现的进一步支持中，所有分子示出了对初级成核的更高抑制，其反映了它们对于在该步骤中涉及的种类的结合偏好，并且仅在更高剂量时可以观测到对aβ42的次级通路的影响。此外，这些实验已经示出了，相比初级成核步骤，低浓度的小分子能够更显著地抑制表面催化的次级成核步骤。这些发现对于药物发现是至关重要的，因为它们提供了用于建立适当的临床试验的关键信息。vi-结构-动力学活性关系(s-kar)为了理解在贝沙罗汀的骨架之内不同化学结构特征对其活性的相对贡献，我们已经引入了新的基于动力学的结构-活性关系方法，该方法允许破译在抑制聚集过程中小分子的每一个化学组分的作用。我们将该方法称为结构-动力学活性关系或skar。事实上，典型的sar研究由比较在配体和蛋白之间的解离常数(kd)的值(即，结合亲和力)组成。然而，在蛋白质错误折叠疾病的情况中应用此步骤是非常具有挑战性的，因为考虑到结合种类的高异质性和不稳定性，不可能直接测量kd值。因此，我们开发了新的skar方法，其将小分子对聚集蛋白的动力学的影响与小分子其本身的化学结构相联系。skar允许检测在小分子和并存聚集蛋白种类之间微弱的结合事件，其中不同于在sar中由kd值组成的输出，该输出对应于在聚集反应中单一微观步骤的速率。设计出在贝沙罗汀的骨架中具有单个化学取代的三个小分子，并且使用我们的基于动力学的试验通过定量微观速率改变来评估它们的作用。skar研究共同地解决了在贝沙罗汀的骨架之内的三个组分(图18a)：亲水基团、中心接头以及疏水基团。有趣的是，动力学试验已经显示，在末端部分(即，在亲水和疏水基团处)引入的旨在降低贝沙罗汀的亲水和疏水性质的修饰使得该化合物完全无活性，而将中心接头从烯烃修饰成羰基没有废除其活性。然而，后面的这样的修饰相对于贝沙罗汀降低了分子的效力(图18a)。这些结果是至关重要的，因为它们表明贝沙罗汀的双重疏水-亲水性质对于抑制aβ42的聚集是关键的，而接头组分影响抑制的程度，其可能是通过将末端部分定向在靶标的口袋中实现的。作为对这些结果的进一步支持，所有集合b和集合c的分子示出了由接头隔开的亲水-疏水双重特性。此外，与skar结果进一步一致的是，仅在接头部分之内相对于贝沙罗汀具有不同取代基的ttnpb、他米巴罗汀和sr11237(即，来自集合b的三个分子)不同程度延迟了aβ42的聚集。这些发现表明了，我们skar策略对于以下方面是关键的：i)理解小分子的单个化学组分的作用，ii)设计抗蛋白聚集的潜在分子，以及iii)更普遍地，该策略通常可用于评估小分子对于涉及错误折叠疾病的蛋白聚集的影响。vii-抗aβ42的聚集的特异性药效团的生成基于所有这些实验，抗aβ42的聚集的特异性药效团可以从在集合b和集合c中的所有阳性分子的骨架中计算出(图18b)(参见方法)。有趣的是，生成的药效团显示出与s-kar研究结果完全一致的特征(图18b)。事实上，接头组分没有被识别为关键特征，支持了接头对于抑制aβ42的聚集非必要的发现。在另一方面，存在疏水和亲水基团，因为它们在抑制聚集过程中起关键作用。此外，在贝沙罗汀的骨架中存在的在亲水末端基团之内的芳香环不是生成的药效团的一部分，这与不具有芳香环的uvi3003的结构一致(图7)。viii-小分子中负责小分子效力的化学特征研究发现，rar和rxr调节剂抑制在aβ42的聚集中的不同微观步骤。事实上，与集合b的分子不同，集合c的分子抑制三个步骤，其中对初级成核步骤和次级成核步骤的影响大于集合b的分子的影响。因此，识别可以解释这些区别的化学特征以及随后设计能够影响在aβ42的聚集中的特定微观步骤的分子至关重要。计算小分子的组成型描述(constitutionaldescriptors)以及分子特性，并且评估了两个不同参数：亲脂性(通过ghose-crippen辛醇-水系数表示)；以及蓬松度(bulkiness，通过原子范德华体积(atomicvanderwaalsvolume)的总和表示)。有趣的是，我们已经可以识别这两个参数之间线性相关，该相关性能够解释所有的小分子效力(图18c)。事实上，亲脂性和范德华值越大，小分子的效力越高，非常低的值导致完全地废除小分子的作用，如bms753。引入注目的是，根据获得的相关性，发现在集合b中最有效的分子uvi3003具有与集合c的分子效力相似的效力(图18c)。事实上，uvi3003的结构特征在于与集合c的分子相似的亲脂性和范德华值。有趣的是，在化学动力学试验中，尽管没有观测到对在aβ42的聚集中的延长步骤的影响，但是uvi3003显示出与在集合c中的分子相似的对初级成核和次级成核步骤的抑制。这表明亲脂性和范德华体积可以描述了小分子对初级成核和次级成核步骤的影响，但不适用于延长步骤。为了破译对抑制延长步骤负责的小分子的化学特征，我们考虑了额外的参数，即小分子的相对芳香性的值。有趣的是，我们发现芳香性值高对于抑制aβ42的延长是必需的(如图18c所示)。事实上，所有集合c的分子比集合b的分子具有更高的芳香性值。这些发现表明，使用了这三个参数就能够破译小分子对aβ42的聚集的微观步骤的作用。相应地，基于虚拟筛选方法现在可以用于筛选旨在识别额外的小分子的数据库，并且最终生成特异性地抑制aβ42的聚集的小分子的多样性文库。实施例ii的材料和方法aβ肽的制备重组的aβ(m1-42)肽(mdaefrhdsgyevhhqklvffaedvgsnkgaiiglmvggvvia(seqidno:1))，本文称为aβ42，在bl21gold(de3)大肠杆菌菌株(stratagene,ca,u.s.a.)中表达并且纯化(如前文所述，略有修改)(51)。简而言之，纯化的步骤涉及大肠杆菌细胞的超声处理，包涵体在8m尿素中的溶解以及在二乙氨乙基树脂上以成批的方式进行的离子交换以及冻干。使用superdex75hr26/60柱(gehealthcare,buckinghamshire,u.k.)进一步纯化冻干的级分，使用sds-page分析洗脱液以确定存在期望的蛋白产物。将含有重组蛋白的级分合并，使用液氮冰冻，并且再次冻干。通过在37℃含有500mlm9分批基础培养基的1l培养瓶中培养转化的大肠杆菌bl21gold(de3)菌株(stratagene,ca,u.s.a.)制备同位素标记的15n-aβ42。简而言之，将在含有100μg/l氨苄青霉素的lb培养基中生长过夜至饱和的20ml预培养物1/25稀释在补充有100μg/l的氨苄青霉素的2yt培养基中，并且在37℃下生长。当在600nm处od值达到0.5时，将细胞收获、在基础培养基中洗涤、并且接种在1/4的起始培养体积的含有100μg/l氨苄青霉素并补充了15nh4cl(2g/l)(cambridgeisotopeslaboratories)的m9基础培养基中。在诱导之前，细胞在37℃生长2小时。然后将iptg加入至1mm的终浓度，并且细胞在37℃下生长过夜。如上文所述进行15n-aβ42的纯化。用于动力学实验的样品的制备通过将冻干的aβ42肽溶解在6mguhcl中制备单体的肽溶液。使用superdex7510/300gl柱(gehealthcare)以0.5ml/min的流速从可能的寡聚体种类和盐中纯化单体形式，并且在补充有200μmedta和0.02％nan3的20mm磷酸钠缓冲液(ph8)中洗脱。收集峰的中心，并且使用ε280＝1400lmol-1cm-1根据积分峰面积的吸光度测定肽的浓度。用缓冲液稀释获得的单体至所需浓度并从1mm储存液中补充了20μm硫磺素(tht)。所有样品制备于在冰上的低结合的eppendorf管中，小心移液以避免引入气泡。然后将每个样品吸入96孔半区、低结合、透明底部及peg包被的板(corning3881)的多个孔中，80μl每孔。对于接种实验，紧接在该实验之前制备预制成的纤维。正如上文所述建立用于在含有200μmedta、0,02％nan3和20μmtht的20mm磷酸钠缓冲液(ph8)中的4μmaβ42样品的动力学实验。监测tht荧光3小时以验证纤维的形成。然后从孔中收集样品到低结合的管中。在所考虑的条件(即，4μmaβ42)下，在平衡时单体的浓度是可忽略的(31)。纤维(成单体的等同物)的最终浓度被认为等于单体的初始浓度。然后加入纤维至新鲜制备的单体，从而达到1％、2％、5％或10％的纤维最终浓度。在所有的情况中，首先使贝沙罗汀溶解在100％dmso中至5mm的浓度，然后在肽溶液中稀释以达到最大1％的最终dmso浓度。我们验证了在反应混合物中加入1％dmso对aβ42的聚集没有影响。动力学试验通过将96-孔板放置在37℃处于静止条件下的酶标仪(fluostaromega,fluostaroptima或fluostargalaxy,bmglabtech,offenburg,germany)开始试验。用440nm激发滤光片以及480nm吸收滤光片通过板底部测量tht荧光。每个样品重复三次测量tht荧光。理论分析：通过下述综合的速率定律描述了总的纤维质量浓度m(t)的时间演化其中，动力学参数b±、c±、κ、κ∞和是两种微观速率常数组合k+k和knk2的函数，其中kn,k+和k2分别是初级成核、延长以及次级成核速率常数。首先将在1％dmso中的单独的aβ42建模计算以获得k+k2和knk2的组合微观速率常数。通过引入不同的小分子，可以通过一个或多个单个微观反应抑制聚集过程。在存在分子时获得了微观速率常数k+k2和knk2，并且与单独的aβ42的初始值比较。这样的比较使得能够理解哪一个速率被主要地扰动，以及化合物相对彼此的效力(通过它们的微观速率的相对变化来比较)。药效团的3d模型的生成：首先使用corina生成了阳性化合物的3d构象。这些构象(成mol2格式)被用作默认选项的输入，并且随后应用pharmagist的算法来生成药效团模型。所计算出的药效团的特征与输入的所有分子匹配。小分子的物理-化学性质的计算:使用e-dragon1.0软件计算组成型描述和分子特性。分子的亲脂性通过其ghose-crippen辛醇-水系数表示，其体积通过原子范德华体积的总和表示，并且其芳香性通过芳香比表示。参考文献1.alzheimer'sassociation,2012alzheimer'sdiseasefactsandfigures.alzheimer'sdementia8,131-168(2012).2.f.chiti,c.m.dobson,proteinmisfolding,functionalamyloid,andhumandisease.annu.rev.biochem.75,333-366(2006).3.c.m.dobson,proteinfoldingandmisfolding.nature426,884-890(2003).4.d.j.selkoe,foldingproteinsinfatalways.nature426,900-904(2003).5.c.haass,d.j.selkoe,solubleproteinoligomersinneurodegeneration:lessonsfromthealzheimer'samyloidβ-peptide.nat.rev.mol.cellbiol.8,101-112(2007).6.w.e.balch,r.i.morimoto,a.dillin,j.w.kelly,adaptingproteostasisfordiseaseintervention.science319,916-919(2008).7.f.u.hartl,a.bracher,m.hayer-hartl,molecularchaperonesinproteinfoldingandproteostasis.nature475,324-332(2011).8.d.eisenberg,m.jucker,theamyloidstateofproteinsinhumandiseases.cell148,1188-1203(2012).9.t.p.knowles,m.vendruscolo,c.m.dobson,theamyloidstateanditsassociationwithproteinmisfoldingdiseases.nat.rev.mol.cellbiol.15,384-396(2014).10.j.habchi,p.tompa,s.longhi,v.n.uversky,introducingproteinintrinsicdisorder.chem.rev.114,6561-6588(2014).11.j.bieschke,naturalcompoundsmayopennewroutestotreatmentofamyloiddiseases.neurotherapeutics10,429-439(2013).12.j.chen,a.h.armstrong,a.n.koehler,m.h.hecht,smallmoleculemicroarraysenablethediscoveryofcompoundsthatbindthealzheimer'sabetapeptideandreduceitscytotoxicity.j.am.chem.soc.132,17015-17022(2010).13.m.ito,j.johansson,r.stromberg,l.nilsson,effectsofligandsonunfoldingoftheamyloidbeta-peptidecentralhelix:mechanisticinsightsfrommoleculardynamicssimulations.plosone7,e30510(2012).14.h.krothetal.,discoveryandstructureactivityrelationshipofsmallmoleculeinhibitorsoftoxicbeta-amyloid-42fibrilformation.j.biol.chem.287,34786-34800(2012).15.m.necula,r.kayed,s.milton,c.g.glabe,smallmoleculeinhibitorsofaggregationindicatethatamyloidbetaoligomerizationandfibrillizationpath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