用于神经学疾病的诊断的测定法的制作方法
开发用于神经学疾病的诊断系统是生物医学科学中的一项持续的挑战，这绝不是因为许多所遇到的神经学症状可以由极其多种多样的原因(包括遗传继承性疾病、药物滥用、营养不良、感染、损伤、精神病学疾患、免疫学缺陷和癌症)来解释。
由于神经学疾病很少与独特的临床症状样式相关联，因而常常难以基于对患者的观察和临床检查或者基于病史来提供可靠的诊断。
早期诊断的重要性怎么强调都不过分。许多神经学病症，最突出地神经变性疾病，例如阿尔茨海默病(ad)和帕金森病(pd)，目前还不能被治愈，但是可以用于减缓其进展的药物是可得的。诊断越早，利用可得药物谱以使患者充分受益的机会就越好。
另外，神经变性疾病在独个患者中以惊人地不同的速率进展。虽然在有些患者中症状在几个月内恶化，但其他患者可能继续携带轻微症状生活多年。
任何用于评估未来发展的选项都可以帮助患者、他们的医生、亲戚和照顾者相应地去调整治疗和患者的生活方式。这对于处于升高的发展出ad或pd或者精神病学状况例如抑郁症的风险中的患者来说也可以是有用的选项。
不幸的是，目前可得的诊断生物标志物不允许预测该疾病的未来进展。特别地，tau和aβ是关于未来认知衰退的具有有限诊断价值的状态标志物。缠结和斑块仅与认知缺损弱相关。
现有技术公开了一系列测定法。ep1774023公开了基于在各种类型的样品中检测全长神经颗粒蛋白来诊断脑损伤出现的方法，但没有公开另外检测在脑脊液(csf)中的bace1的测定法。
barao等人(2013)公开了用于检测bace1(而不是神经颗粒蛋白)的夹心式elisa。但是，bace1被认为是“差的关于ad的诊断标志物”，其中在来自ad患者和对照组的样品之间具有“非常小的”差异。显然地，存在开发出可以用于预测此类疾病的发作或未来过程的诊断测定法的需要。
因此，作为本发明基础的问题是提供可以用于诊断神经变性疾病，更特别地ad的诊断测定法。
特别地，这样的测定法应当允许诊断具有可以与神经变性疾病和其他神经学疾病或者精神病学疾病例如抑郁症均相关联的特异和/或非特异的症状的患者。
作为本发明基础的另一个问题是提供允许预测神经变性疾病，更特别地ad的未来进展的诊断测定法。
作为本发明基础的另一个问题是提供可以用于诊断精神病学疾病，更特别地抑郁症的测定法。
通过所附的独立和从属权利要求的主题解决了作为本发明基础的问题。
在第一个方面，作为本发明基础的问题通过在诊断上有用的载体而得到解决，所述在诊断上有用的载体包含用于捕获神经颗粒蛋白的工具，用于捕获bace1的工具，和优选地，用于捕获一种或多种另外的生物标志物的工具。
在第二个方面，作为本发明基础的问题通过包含根据本发明的在诊断上有用的载体的试剂盒而得到解决，所述试剂盒任选地进一步包含用于检测神经颗粒蛋白的工具，用于检测bace1的工具，和优选地，用于检测所述一种或多种另外的生物标志物的工具。
在一个优选的实施方案中，所述用于特异性地捕获神经颗粒蛋白的工具和所述用于特异性地捕获bace1的工具是在空间上分开的。
在另一个优选的实施方案中，所述在诊断上有用的载体选自包括珠粒、测试条、微量滴定板、印迹的组，优选地选自包括western印迹、线印迹(lineblot)和斑点印迹、玻璃表面、载玻片、生物芯片、膜、微阵列、电泳凝胶和亚微米大小的颗粒的组，
和更优选地，要么为微量滴定板，其具有包含所述用于特异性地捕获神经颗粒蛋白的工具的孔，具有包含所述用于特异性地捕获bace1的工具的孔，和任选地具有一个或多个另外的孔，每个另外的孔包含用于特异性地捕获所述一种或多种另外的生物标志物的工具，
要么为包含所述用于特异性地捕获神经颗粒蛋白的工具的珠粒，和包含所述用于特异性地捕获bace1的工具的珠粒，和任选地一种或多种另外的珠粒，每种另外的珠粒包含用于特异性地捕获所述一种或多种另外的生物标志物的工具，
最优选地，为所述微量滴定板。
在第三个方面，作为本发明基础的问题通过一种方法而得到解决，所述方法包括下列步骤：
(a1)使来自受试者的样品与用于捕获神经颗粒蛋白的工具相接触，
(b1)从所述样品中分离所述用于捕获神经颗粒蛋白的工具，
并且
(a2)使来自受试者的样品与用于捕获bace1的工具相接触，和(b2)从所述样品中分离所述用于捕获bace1的工具。
在另一个优选的实施方案中，所述方法进一步包括下列步骤：
(c1)使所述用于捕获神经颗粒蛋白的工具与可检测的结合神经颗粒蛋白的配体相接触，和
(c2)使所述用于捕获bace1的工具与可检测的结合bace1的配体相接触。
在另一个优选的实施方案中，所述方法进一步包括下列步骤：
(d1)检测任何所捕获的神经颗粒蛋白，和
(d2)检测任何所捕获的bace1。
在另一个优选的实施方案中，所述方法进一步包括下列步骤：
(a3)使来自受试者的样品与用于捕获一种或多种另外的生物标志物的工具相接触，
(b3)从所述样品中分离所述用于捕获所述一种或多种另外的生物标志物的工具，和
任选地，
(c3)使所述用于捕获所述一种或多种另外的生物标志物的工具与可检测的结合所述一种或多种另外的生物标志物的配体相接触，和
任选地，
(d3)检测任何所捕获的所述一种或多种另外的生物标志物。
在第四个方面，作为本发明基础的问题通过经由根据本发明的方法可获得的在诊断上有用的载体而得到解决。
在另一个优选的实施方案中，所述一种或多种另外的生物标志物选自包括abeta42和abeta40、p-tau、t-tau和神经丝蛋白的组。
在另一个优选的实施方案中，所述载体、试剂盒或方法适合于通过使用从包括下列各项的组中选择的方法来检测神经颗粒蛋白、bace1和任选地一种或多种另外的生物标志物：免疫扩散技术；免疫电泳技术；光散射免疫测定法；凝集技术；标记免疫测定法，例如，从包括放射性标记免疫测定法、酶免疫测定法例如比色测定法、化学发光免疫测定法、荧光免疫测定法、纳米金标记的组中选择的那些；质谱法；和表面等离子体共振，优选地酶免疫测定法。
在另一个优选的实施方案中，所述载体、试剂盒或方法适合于基于夹心式elisa来检测神经颗粒蛋白、bace1和任选地一种或多种另外的生物标志物。
在第五个方面，作为本发明基础的问题通过根据本发明的在诊断上有用的载体或试剂盒用于诊断神经学疾病或神经变性疾病，优选地阿尔茨海默病(ad)的用途而得到解决。
在另一个优选的实施方案中，所述诊断旨在预测未来认知下降的速率。
在另一个优选的实施方案中，所述诊断旨在辨别神经变性疾病，优选地轻度ad，和具有或不具有认知缺损的抑郁症。
在第六个方面，作为本发明基础的问题通过用于诊断抑郁症(优选地在老年患者中)的根据本发明的在诊断上有用的载体或试剂盒而得到解决。
本发明涉及在诊断上有用的载体，其优选地为由人工材料例如玻璃或塑料制成的固体载体。该载体与用于特异性地捕获在来自受试者，优选地哺乳动物受试者，更优选地人受试者的体液样品中的抗体的工具相联合。在一个优选的实施方案中，所述固体载体为诊断装置，其更优选地选自包括珠粒、测试条、微量滴定板、印迹的组，优选地选自包括western印迹、线印迹和斑点印迹、玻璃表面、载玻片、生物芯片、膜、微阵列、电泳凝胶和亚微米大小的颗粒的组，更优选地微量滴定板或珠粒，最优选地所述微量滴定板。所述诊断载体可以为一体式诊断载体，例如微量滴定板，其具有多于一个孔，例如一个孔包含用于捕获神经颗粒蛋白的工具而另一个孔包含用于捕获bace1的孔，或者它可以包含两个或更多个部件，所述部件中的每一个可以用于分开的测定法。例如，所述诊断装置可以包括包含用于捕获神经颗粒蛋白的工具的第一种珠粒和包含用于捕获bace1的工具的另一种珠粒。
根据本发明，所述载体包含两种或更多种用于特异性地捕获多肽的工具，其中包括一种用于捕获神经颗粒蛋白的工具和一种用于捕获bace1的工具，任选地一种或多种用于捕获一种或多种另外的生物标志物的工具，例如一种、两种、三种、四种、五种、十种、五十种、一百种或一千种或更多种的工具，其中每一种用于捕获另外的生物标志物。
所述工具被固定在所述载体上，从而将所述工具恰当地进行放置以与待捕获的多肽例如神经颗粒蛋白、bace1或任何另外的生物标志物相互作用和结合(当与包含所述待捕获的多肽的液体样品相接触时)，以便形成包含所述工具和待捕获的多肽的复合物。所述工具可以为任何特异性地结合神经颗粒蛋白、bace1或任何另外的生物标志物的试剂，并且优选地选自包括下列各项的组：抗体，优选地单克隆或多克隆抗体，更优选地单克隆抗体；和适体，更优选地抗体。除了抗体或适体外，还可以使用钙调蛋白或其变体作为特异性地结合神经颗粒蛋白的工具。所述抗体优选地为分离的和/或重组的抗体。本领域技术人员熟悉可以用于产生这样的工具的方法。
优选地，所述用于捕获的工具具有这样的与待捕获的分子(优选地神经颗粒蛋白、bace1或任何另外的生物标志物)的结合亲和力kd，其具有小于下列值的值(即指示更强的结合的值)：1mm，以优先级渐增的顺序，0.5mm、0.250mm、0.100mm、50μμ、25μμ、10μμ、5μμ、1μμ、0.5μμ、0.25μμ、0.1μm、50nμ、25nμ、10nμ、1nμ、100pμ、50pm、25pm、10pm、5pm、1pm、0.5pm、0.25pm、0.1pm，这在25℃下在ph7的pbs中通过使用表面等离子体共振来测量。
在一个优选的实施方案中，在本文中所使用的术语“神经颗粒蛋白”是指全长的哺乳动物(优选地人)神经颗粒蛋白(由数据库条目uniprotq92686所表示的)或其片段，更优选地所述神经颗粒蛋白的在c-末端处经截短的片段，其包含至少seqidno4，和任选地另外的n-末端氨基酸残基，但缺乏全长神经颗粒蛋白的三个c-末端残基，更特别地s76、g77和d78，该经截短的形式在整个该申请中也被称为“神经颗粒蛋白truncp75”。所检测的神经颗粒蛋白或其片段可以携带一个或多个修饰，包括从由包括下列各项的组中选择的那些：n-乙酰化，例如n-乙酰基-met1；磷酸化，例如磷酸-ser36；和瓜氨酸化，例如对于基于seqidno1的编号的arg68的。在整个该文档中所提及的任何数据库条目涉及在申请日之时在线的在那个数据库中的版本和序列。
在一个优选的实施方案中，在本文中所使用的术语“bace1”是指全长的哺乳动物(优选地人)bace1或其片段，优选地由seqidno2所表示的片段。所检测的bace1或其片段可以携带一个或多个修饰，包括从由包括下列各项的组中选择的那些：乙酰化，优选地从包括lys105、lys254、lys258、lys264、lys278、lys279和lys286的组中选择的赖氨酸侧链的乙酰化；糖基化，优选地从包括asn132、asn151、asn202和asn333的组中选择的天冬酰胺侧链的糖基化；二硫键，优选地在从包括cys195和cys399、cys257和cys422以及cys309和cys359的组中选择的半胱氨酸侧链对之间的二硫键。(所有上面的氨基酸编号均基于seqidno2)。
在一个优选的实施方案中，所述一种或多种另外的生物标志物为这样的生物标志物，其可以用于诊断神经变性疾病，更优选地ad，更优选地选自精神病学状况(例如抑郁症)的ad症状。所述一种或多种另外的生物标志物优选地选自包括下列各项的组：abeta42(αβ1-42)，其优选地由seqidno5所表示；abeta40(αβ1-40)，其优选地由seqidno6所表示；tau，其优选地由seqidno7所表示，要么总tau(也称为t-tau)，要么包含至少一个经磷酸化的序列基序的tau(也称为p-tau)；和神经丝蛋白，其优选地由seqidno8所表示。在一个优选的实施方案中，在本文中所使用的术语“t-tau”包括所有tau分子或其片段的全体。在另一个优选的实施方案中，在本文中所使用的术语“p-tau”包括所有经磷酸化的tau分子或其片段的全体。
根据本发明，需要用于检测所捕获的多肽，例如神经颗粒蛋白、bace1或者所述一种或多种另外的生物标志物的工具。在一个优选的实施方案中，使用结合所捕获的多肽的第二抗体或适体，其与第一捕获抗体或适体不同或相同。所述第二抗体或适体可以与直接进行检测的标记物(例如荧光的、放射性的或具有酶促活性的标记物)相联合，其中后者可以催化化学发光反应，或者催化通过使用比色法或光谱学或另一种分析方法可检测的分子的产生。
所述用于检测的工具优选地如此地进行设计，从而它结合所捕获的多肽，并且后者可以在结合的同时被检测。例如，如果使用一抗来以夹心样方式捕获多肽，那么二抗结合在该多肽与一抗相结合的同时仍然可接近的另一个表位。
根据本发明，提供了第一反应混合物，其包含在诊断上有用的载体、样品和用于捕获神经颗粒蛋白的工具，所述工具任选地与神经颗粒蛋白相复合；和第二反应混合物，其与第一反应混合物相接触或在空间上分开，优选地在空间上分开，其包含在诊断上有用的载体、样品和用于捕获bace1的工具，所述工具任选地与bace1相复合。处于复合物中的神经颗粒蛋白可以与可检测的关于神经颗粒蛋白的配体相联合。处于复合物中的bace1可以与可检测的关于bace1的配体相联合。
本发明的教导提供了试剂盒，其优选地用于诊断神经变性疾病，更优选地用于诊断ad。此类试剂盒为这样的容器，其包含对于实施本发明的方法来说需要的特殊试剂，特别地根据本发明的在诊断上有用的载体，任选地另外还有一种或多种对于实施本发明的方法来说需要的溶液，其优选地选自包括下列各项的组：样品稀释缓冲液，洗涤缓冲液，和包含用于检测任何所捕获的多肽的工具(例如二抗)的缓冲液。进一步地，它可以包含使用说明书，其详细说明了如何使用该试剂盒和本发明的在诊断上有用的载体来使本发明的多肽与来自受试者(优选地人受试者)的体液样品相接触。进一步地，所述试剂盒可以包含阳性对照，例如重组神经颗粒蛋白和/或bace1，其已知与用于捕获神经颗粒蛋白、bace1和任选地一种或多种另外的生物标志物的工具相结合；和阴性对照。最后，此类试剂盒可以包含一种或多种用于制备校准曲线的标准溶液，例如包含以已知浓度的神经颗粒蛋白的标准溶液，包含以已知浓度的bace1的标准溶液，和任选地一种或多种这样的标准溶液，每种标准溶液包含以已知浓度的另外的生物标志物。
在一个优选的实施方案中，在本文中所使用的术语“检测”意指，可以确定待检测的多肽(优选地，神经颗粒蛋白、bace1或所述一种或多种另外的生物标志物)的存在或不存在。在一个更优选的实施方案中，所述术语是指至少半定量的测定，其允许浓度的粗略估计。在一个最优选的实施方案中，所述术语是指测定待检测的多肽的浓度(相对的或绝对的)，从而可以测定在样品中的神经颗粒蛋白与bace1的浓度比，和任选地神经颗粒蛋白或bace1与一种或多种另外的生物标志物的比例。例如，在样品中的神经颗粒蛋白和bace1两者的未知浓度可以通过下述方式来测定：在分开的反应中分别与已知量的神经颗粒蛋白和bace1相平行地运行待检查的样品的elisa，随后为基于已知量建立各自关于神经颗粒蛋白和bace1的校准曲线，和测定在样品中的神经颗粒蛋白和bace1的第一未知浓度。在一个优选的实施方案中，所述方法选自包括由下列各项组成的组：免疫扩散技术；免疫电泳技术；光散射免疫测定法；凝集技术；标记免疫测定法，例如，从包括放射性标记免疫测定法、酶免疫测定法例如比色测定法、化学发光免疫测定法、荧光免疫测定法、纳米金标记的组中选择的那些；质谱法；和表面等离子体共振，优选地酶免疫测定法。此类方法描述在现有技术中，例如在fredolini等人(2016)immunocapturestrategiesintranslationalproteomics,expt.rev.proteomics13(1),83-98中。
在一个优选的实施方案中，所述用于捕获神经颗粒蛋白、bace1和任选地所述一种或多种另外的生物标志物的工具是在空间上分开的，即分开在不同的反应区室中，从而当测定浓度时没有试剂的转移。备选地，所述反应可以以“单罐”方式来进行，条件是存在这样的可能性：测定神经颗粒蛋白、bace1和任选地所述一种或多种另外的生物标志物的比例，例如通过使用不互相干扰的不同的用于进行检测的工具。在另一个实施方案中，可以在捕获反应(其在相同的容器中进行)之后分开所述两种或更多种用于进行捕获的工具，以便分开地测定神经颗粒蛋白、bace1和所述一种或多种另外的生物标志物的浓度。在另一个实施方案中，所述在诊断上有用的载体包含两种或更多种用于进行捕获的工具，但在捕获反应之后被拆分开并且在两个在空间上分开的反应中与两种或更多种不同的用于检测神经颗粒蛋白、bace1和任选地一种或多种另外的生物标志物的工具进行反应。在一个优选的实施方案中，使相同的样品顺次地或相伴地经历用于检测神经颗粒蛋白、bace1和任选地一种或多种另外的生物标志物的反应。
在一个优选的实施方案中，所述在诊断上有用的载体为珠粒，其优选地为这样的颗粒，在其上可以附着用于捕获生物标志物的工具，从而所述珠粒连同此类工具一起可以基于其沉降特性而与液体溶液相分开，这比所述用于捕获生物标志物的工具靠自身，例如通过滗析、离心、过滤(优选地滗析)更为有效。典型地，这样的珠粒为由在水溶液中在化学上惰性的碳水化合物(例如琼脂糖或sepharose珠粒)制成的珠粒。所述珠粒可以为磁珠，其可以包含以5至30％(重量/重量)的含量的铁。所述珠粒可以具有0.1至10μm，优选地0.5至5μm的大小。所述在诊断上有用的载体可以包含包被有用于捕获神经颗粒蛋白的工具(优选地针对神经颗粒蛋白的抗体)的珠粒，和包被有用于捕获bace1的工具(优选地针对bace1的抗体)的珠粒，和任选地一种或多种这样的珠粒，其包被有用于捕获所述一种或多种另外的生物标志物的工具，优选地关于每种珠粒结合该另外的生物标志物的抗体，和任选地包被有用于捕获所述一种或多种另外的生物标志物的工具，优选地抗体或适体，优选地针对所述一种或多种另外的生物标志物的抗体。
在另一个优选的实施方案中，所述在诊断上有用的装置为微量滴定板，其包含包被有用于特异性地捕获神经颗粒蛋白的工具的孔，包被有用于特异性地捕获bace1的工具的孔，和任选地一个或多个这样的孔，每个孔包含用于捕获另外的生物标志物的工具。
根据本发明进行测试的样品为血液样品、脑组织样品或csf样品，优选地csf样品，更优选地来自活的患者的csf样品，所述患者优选地被怀疑罹患或显示出对于神经变性疾病来说特征性的症状，优选地神经变性疾病例如ad的初始症状。
本发明涉及包括在来自受试者的样品中检测神经颗粒蛋白、bace1和任选地一种或多种另外的生物标志物的步骤的方法。这样的方法可以包括下列步骤：提供来自受试者的样品，使所述样品与根据本发明的在诊断上有用的载体在与形成包含所述在诊断上有用的载体和待检测的多肽例如神经颗粒蛋白和bace1的复合物相容的条件下相接触，例如通过简单地用所述样品或用经稀释的样品浸渍所述在诊断上有用的载体足够的时间段。另一个后续步骤可以涉及从样品的其余部分中分离出任何复合物，例如通过在形成复合物后从所述载体上轻轻地去除样品从而保留所述复合物，例如通过滗析。随后，可以再次在允许所形成的复合物的组分保持相联合的条件下洗涤所述在诊断上有用的载体。最后，可以检测所述复合物，通过直接检测完整的复合物，例如通过添加结合所述复合物而不结合所述用于进行捕获的工具自身的可检测的配体。备选地，所述复合物可以通过下述方式来进行检测：在去除样品后解离所述复合物，从所述用于进行捕获的工具上移除待检测的多肽，和检测任何解离出的多肽。所述方法优选地为体外方法。
在一个优选的实施方案中，使用可检测的配体来检测多肽例如神经颗粒蛋白、bace1和任选地所述一种或多种另外的生物标志物。优选地，所述配体可以具有这样的与待检测的多肽的结合亲和力kd，其具有小于下列值的值(即指示更强的结合的值)：1mm，以优先级渐增的顺序，0.5mm、0.250mm、0.100mm、50μμ、25μμ、10μμ、5μμ、1μμ、0.5μμ、0.25μμ、0.1μm、50nμ、25nμ、10nμ、1nμ、100pμ、50pm、25pm、10pm、5pm、1pm、0.5pm、0.25pm或0.1pm，这在25℃下在ph7的pbs中通过使用表面等离子体共振来测量。最优选地，所述配体具有1nm或更小的与待检测的多肽的结合亲和力kd。在一个优选的实施方案中，所述可检测的配体优选地选自包括下列各项的组：抗体，优选地单克隆或多克隆抗体，更优选地单克隆抗体；或适体，更优选地抗体。所述抗体优选地为分离的和/或重组的抗体。所述可检测的配体可以与人工标记物(其优选地选自包括具有酶促活性的多肽、放射性核苷酸、自旋标记物、荧光标记物和生色团标记物的组)相联合。
在一个优选的实施方案中，使用夹心式elisa来检测待检测的多肽，更特别地神经颗粒蛋白和bace1和任选地一种或多种另外的生物标志物。简而言之，所述在诊断上有用的载体，优选地微量滴定板或珠粒，包含固定在所述载体上的第一抗体或适体，其充当用于捕获待检测的多肽的工具。包含第一抗体或适体和待检测的多肽的复合物通过添加第二抗体或适体(其携带标记物，并且结合与结合第一抗体的表位相同或不同的表位)来进行检测。各种用于检测神经颗粒蛋白和bace1的免疫测定法描述在现有技术中，例如在devos等人,2015；kvartsberg等人,2015；thorsell等人,2010；wo2012/155134；和barao等人,2013中。在一个优选的实施方案中，使用夹心式测定法来检测神经颗粒蛋白，通过使用第一单克隆抗体作为捕获抗体和第二单克隆抗体作为检测抗体。在一个更优选的实施方案中，所述检测抗体结合比所述捕获抗体所结合的表位更靠近c-末端的神经颗粒蛋白表位，优选地包含seqidno3(agggp)的具有至少五个氨基酸，优选地至少10个氨基酸的表位。最优选地，这两种抗体均结合位于由seqidno4所表示的神经颗粒蛋白的胶原样结构域中的神经颗粒蛋白表位。
在一个优选的实施方案中，在本文中所使用的术语“诊断”是指任何类型的旨在下列目的的程序：获得在评估患者是否在过去、在诊断之时或在未来罹患或可能罹患或比平均或比较受试者(其优选地具有相似的症状)更可能罹患某种疾病或状况之中有帮助的信息；发现疾病如何正在进展或在未来可能如何进展；或者评价患者对于某一治疗(例如，施用合适的减缓神经变性疾病的进展的药物)的应答性。换言之，术语“诊断”不仅包括诊断，而且还包括预测和/或监测疾病或病症的过程。在一个优选的实施方案中，所述疾病或病症为神经学疾病，更优选地神经变性疾病，更优选地ad，并且这可以通过使用本发明的教导而与具有或不具有认知缺损(优选地不具有认知缺损)的抑郁症相区别。在年龄为至少40岁，更优选地50岁，更优选地60岁，更优选地65岁，更优选地70岁，更优选地75岁，更优选地80岁的人中。
因此，术语“诊断”优选地并不暗示根据本发明的诊断方法或试剂将会是决定性的并且足以基于单个测试(更不用说参数)来完成诊断。相反，它可以是指对于所谓的“鉴别诊断”(即在某些诊断参数的基础上考虑一系列可能状况的可能性的系统性诊断程序)的贡献。这可以涉及通过排除另一个而间接地来诊断疾病或状况。术语“诊断”还可以是指用于为患者选择最具希望的治疗方案的方法或试剂。换言之，所述方法或试剂可以涉及为受试者选择治疗方案。
根据本发明，可以使用所述诊断载体或试剂盒或方法来在来自受试者的样品中检测神经颗粒蛋白和bace1。在这样的受试者为罹患由于阿尔茨海默病而引起的轻度认知缺损(mci)或者罹患由于阿尔茨海默病而引起的痴呆的患者，例如在本发明的实施例中所描述的患者的情况下，在那名受试者的csf中的神经颗粒蛋白与bace1的比例可以用于评估或监测那个个体的认知下降的进展速度，这借助于随时间的改变的简短精神状态检查(mini-mentalstateexamination，mmse)值。30的mmse值表明正常的、认知健康的状态。小于30，更优选地25或更小的mmse值表明mci或由于ad而引起的痴呆。在csf中的神经颗粒蛋白与bace1的比例可以用于评估或监测阿尔茨海默病的进展速度，其中高的比例表明比更低的比例更高的更快下降速度的可能性。可以通过使csf样品经历本发明的方法来诊断mci或ad患者，其中在那个csf样品中的低于0.105的神经颗粒蛋白与bace1的比例优选地可以表明在接下来的6年中小于0.42mmse单位的mmse降低。优选地，在0.105和0.144之间的神经颗粒蛋白与bace1的比例可以表明在接下来的6年中在1.64和1.84mmse单位之间的mmse降低。优选地，大于0.144的神经颗粒蛋白与bace1的比例将会表明在接下来的6年中大于2.68mmse单位的mmse降低。在一个优选的实施方案中，在本文中所使用的术语“神经颗粒蛋白与bace1的比例”是指在目的样品中的以pg/ml表示的神经颗粒蛋白的浓度除以在相同样品中的以pg/ml表示的bace1的浓度。
本发明通过下面的非限制性实施例、序列和附图(从其中可以得到本发明的进一步的特征、实施方案、方面和优点)来进一步举例说明。
本申请中的序列包括：
seqidno1：待检测的神经颗粒蛋白的最小序列
seqidno2：待检测的没有跨膜结构域和胞质尾区的成熟bace1的序列(基于从位置22至460的uniprot序列p56817)
seqidno3：c-末端神经颗粒蛋白表位(agggp)
seqidno4：神经颗粒蛋白的胶原样结构域
seqidno5：abeta42
seqidno6：abeta40
seqidno7：tau
seqidno8：神经丝蛋白
图1显示了：
(a)mabsadxngci2和adxngct1两者的表位作图，其用从r51至d78变动的重叠合成肽来进行。
(b)通过western印迹分析来评价mabsadxngci2和adxngct1的特异性，合成的全长神经颗粒蛋白以及在p75处经截短的合成的神经颗粒蛋白肽两者均包括在凝胶电泳中，旁边为人i、iii和iv型胶原。adxngci2阳性染色了所述两种合成肽，而adxngct1仅标记了经截短的形式。所述mabs中没有一个检测出胶原蛋白质。
(c)数种在其c-末端不同的合成的神经颗粒蛋白肽(即完整的(具有完整c-末端的肽)，或者在p75处(肽truncp75)或在s76处(肽truncs76)经截短的)的分析，以确证原型elisa对于不同浓度的在p75处经截短的神经颗粒蛋白种类的特异性。
图2显示了针对年龄进行绘图的在20名认知健康的人(黑色方框)和161份处于宽的年龄范围内的未经选择的csf样品(空心圆)中的神经颗粒蛋白truncp75(a)、bace1(b)、总-tau(c)、αβ1-42(d)、αβ1-40(e)和αβ1-38(f)的csf水平。
图3显示了散点图，其显现了在下列不同诊断组中在csf中的神经颗粒蛋白truncp75(a)或bace1(b)的浓度：具有高的关于阿尔茨海默病的概率的轻度认知缺损(mci)(n＝38)；由于阿尔茨海默病而引起的痴呆(ad)(n＝50)；和认知健康的参与者(ctrl)(n＝20)。在每个点图中以线来表示的是中值水平。棒条表示四分位数间距。组之间的统计学显著差异通过**＝p<0.01而呈现在所述图中。
图4显示了基线csf神经颗粒蛋白truncp75/bace1水平对于随时间的mmse演变的影响的图解说明。将样品按照该比例的csf水平分为三个组。所述图版显示了csf神经颗粒蛋白p75/bace1的水平的低的(上图版)、中间的(中图版)和高的(下图版)范围。对于mci(a)和ad患者(b)两者制作分开的图版。对于mci和ad组两者，均关于每个范围将所观察到的mmse对时间进行绘图。细线表示关于特定患者的所观察到的mmse数据，粗线代表平均mmse对时间的线性回归线。
实施例
材料和方法
1.1研究群体
csf样品通过在l3/l4或l4/l5间隙处的腰部穿刺(lp)来获得，收集在聚丙烯管中，立即在液氮中进行冷冻，并且储存于-80℃直至分析。在lp之前或之后3个月内，对于每名患者进行至少由简短精神状态检查(mmse)得分组成的神经心理学检查。
包括了具有由于ad而引起的mci的患者(以下称为‘mci’)(n＝38)以及年龄匹配的具有由于ad而引起的痴呆的患者(‘ad’)(n＝50)，并且按照nia-aa标准进行诊断(albert等人(2011)thediagnosisofmildcognitiveimpairmentduetoalzheimer'sdisease:recommendationsfromthenationalinstituteonaging-alzheimer'sassociationworkgroupsondiagnosticguidelinesforalzheimer'sdisease.alzheimersdement7(3),270-279；mckhann等人(2011)thediagnosisofdementiaduetoalzheimer'sdisease:recommendationsfromthenationalinstituteonaging-alzheimer'sassociationworkgroupsondiagnosticguidelinesforalzheimer'sdisease.alzheimersdement7(3),263-269)。
为了区分ad与认知正常的人，在该研究之前已经在biodem实验室使用商业试剂盒(innotestβ-amyloid(1-42)、innotesthtau-ag和innotestphospho-tau(181p)；fujirebioeurope,ghent,belgium)分析了csf生物标志物αβ1-42、t-tau和p-tau181p，其中应用了实验室的截止值[vandermussele等人(2014)depressioninmildcognitiveimpairmentisassociatedwithprogressiontoalzheimer'sdisease:alongitudinalstudy.jalzheimersdis42(4),1239-1250]。所有mci患者(其中包括2名具有致病的ad基因突变的患者)具有高的ad病因学概率，按照nia-aa标准(还可参见补充表格1)。关于年龄匹配且性别匹配的认知健康的对照组('ctrl')(n＝20)的参与者，借助于神经心理学筛选来排除认知衰退。ctrl受试者不具有神经学和精神病学前例、中枢神经系统病症或炎症综合征。
如果可得，在该研究中包括来自随访神经心理学检查(在lp(＝基线)之后至少一年)的mmse总得分。这允许基于关于年龄和性别进行调整的线性混合模型来计算认知下降的速度。
1.2用于csf的研究型神经颗粒蛋白elisa
将96-孔微量滴定板用在磷酸盐缓冲盐水(pbs)中的mabadxngci2在21℃下包被1小时。在用包含tween-20的pbs(pbst)洗涤孔后，将平板用封闭试剂在21℃下封闭2小时。在样品稀释剂(sd)(具有封闭试剂和去污剂的基于pbs的缓冲液)中以900pg/ml的初始浓度制备校准品，即包含在pro75处经截短的神经颗粒蛋白的c-末端的合成肽(由proteogenix,france定制的)，并且进行随后的三倍稀释。将样品以及校准品稀释物同时地与在sd中的经生物素化的mabadxngct1一起在21℃下温育3小时。在用pbst洗涤平板后，添加缀合有辣根过氧化物酶的链霉抗生物素蛋白。在21℃下温育30分钟后，洗涤平板并添加3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液以进行显色。在21℃下30分钟后，终止着色反应，并且在biotek微量培养板阅读器中在450nm处对平板进行读取。基于校准曲线，通过内推法(5pl曲线拟合；log(x))来计算神经颗粒蛋白truncp75的水平。
1.3用于csf的bace1elisa
所使用的bace1elisa基于
1.4关于csf生物标志物总-tau、ab1-42、ab1-40和ab1-38的elisa
在该研究期间重新分析了总-tau、aβ1-42、aβ1-40的csf水平，其中使用从euroimmunmedizinischelabordiagnostikaag,lübeck,germany商购可得的总-tauelisa、β-淀粉状蛋白(1-42)elisa和β-淀粉状蛋白(1-40)elisa试剂盒(β-淀粉状蛋白1-38，产品编号eq6501-9601(用于血浆)，eq6501-9601-l(用于csf)；β-淀粉状蛋白1-40elisa，eq6501-9601(用于血浆)，eq6501-9601-l(用于csf)；β-淀粉状蛋白1-42elisa，产品编号eq6501-9601(用于血浆)，eq6501-9601-l(用于csf))。
此外，还使用由euroimmunmedizinischelabordiagnostikaag,lübeck,germany提供的测定法来测量csfαβ1-38。
1.4统计学分析
将graphpadprism6.02和r版本3.1.2用于统计学分析和附图。分析物和/或参数之间的相关性强度用spearman相关系数来表示。为了比较组之间的定量变量数据，应用kruskal-wallis检验。使用mmse作为因变量来对线性混合模型进行拟合，固定效应包括时间(连续变量)、csf标志物值和其相互作用。随机效应包括关于个体的随机截距和关于时间的随机斜率。在csf标志物值和时间之间的相互作用的显著性招致csf标志物的水平对于随时间的mmse改变是否具有显著影响。使用具有关于自由度数目的kenward-roger校正的f-检验来检验该项的显著性。对于p-值<0.05，结果被认为是显著的。
结果
1.5神经颗粒蛋白单克隆抗体的产生
通过用包含神经颗粒蛋白的c-末端的合成肽对小鼠进行免疫接种来产生抗神经颗粒蛋白mabsadxngci2和adxngct1。在用偶联有klh的包含c-末端神经颗粒蛋白的内部序列(r51-d78)的肽进行注射和用全长合成神经颗粒蛋白进行额外加强后，在pharmabs(kuleuven,belgium)在balb/c小鼠中产生了mabadxngci2(同种型igg2a)。所述肽和全尺寸神经颗粒蛋白两者均在proteogenix(france)合成。在用缀合有klh的相应于在p75处经截短的c-末端(g60-p75)的肽(在biotem合成)进行免疫接种后，从of1小鼠中分离出mabadxngct1(同种型igg1)(在biotem,france)。这两种mabsadxngci2和adxngct1各自识别在神经颗粒蛋白上的不同表位，如在图1a中所描绘的。采用链霉抗生物素蛋白包被和经生物素化的覆盖神经颗粒蛋白的c-末端的肽通过elisa进行的扫描揭示了，adxngci2的表位位于序列r51-a66之内。mabadxngct1靶向从g62开始在p75结束的氨基酸范围。这两种mabs的该特异性还通过对于合成神经颗粒蛋白(全尺寸的以及在p75处经截短的)的凝胶电泳而得到确证。还包括了三种丰富的人胶原类型，因为adxngci2和adxngct1靶向神经颗粒蛋白的胶原样结构域(图1b)。
1.6靶向在p75处经截短的神经颗粒蛋白的elisa的设计
为了测量神经颗粒蛋白，发明人将作为捕获抗体的adxngci2和作为经生物素化的检测抗体的adxngct1组合入对于在p75处经截短的神经颗粒蛋白来说特异的研究型夹心式elisa中(图1c)。神经颗粒蛋白的该形式在人csf中比完整的c-末端更丰富[kvartsberg等人(2015)cerebrospinalfluidlevelsofthesynapticproteinneurogranincorrelateswithcognitivedeclineinprodromalalzheimer'sdisease.alzheimersdement11(10),1180-1190]。基于所述新mabs的测定法的灵敏度用以4次重复进行运行的具有低内源性水平的神经颗粒蛋白truncp75的三个csf样品来进行评估，并且最低可定量浓度(具有20的变异系数(％cv))为26pg/ml(基于以二次重复的标准曲线)。使用包含在p75处结束的神经颗粒蛋白的c-末端序列的合成肽的三倍系列稀释物来产生标准曲线，从900至4pg/ml变动。
1.7csf神经颗粒蛋白、csfbace1和经典的csfad生物标志物的年龄依赖性
在临床研究的准备中，发明人首先在一大组的csf样品中作为“概念证明(proof-of-concept)”验证了神经颗粒蛋白truncp75测定法。特别地，除了一群诊断不明确的csf样品(n＝161)(biomnis,france)外，发明人还分析了关于该临床研究的对照组(n＝20)。发明人选择了在宽的年龄范围内并具有相似的男性和女性受试者数目的前一个样品组。总共分析了181份样品(104名女性/77名男性受试者)，其中中值年龄为50.3(岁)(范围7.0-92.1)。除了神经颗粒蛋白truncp75外，发明人还分析了bace1、tau、αβ1-42、αβ1-40和aβ1-38的csf水平。表1汇总了所有分析物的浓度。如所描述的，仅在非常少数目的样品中不能测定神经颗粒蛋白truncp75水平，即2.8％，这与其他五种分析物是高度相当的，即1.7％(对于总-tau、αβ1-42和αβ1-40)、1.1％(对于αβ1-38)和0％(对于bace1)。另外，所有csf分析物均显示出与年龄的关联，虽然在αβ1-42的情况下非常弱：神经颗粒蛋白truncp75(ρ＝0.253；p＝0.0007)、bace1(ρ＝0.412；p<0.0001)、tau(ρ＝0.366；p<0.0001)、αβ1-42(ρ＝0.147；p＝0.050)、αβ1-40(ρ＝0.305；p<0.0001)和αβ1-38(ρ＝0.326；p<0.0001)。图2(其图解说明了数种csf分析物与年龄之间的该关系)也确证了关于该临床研究的年龄匹配的对照组的这一准确选择。最后，一方面在神经颗粒蛋白truncp75、bace1和tau之间存在强的相关性，和另一方面在这三种αβ-种类之间存在牢固的关系(表2)。
1.8在mci和ad患者中神经颗粒蛋白truncp75、bace1和经典的csfad生物标志物的csf水平。
在建立了关于神经颗粒蛋白的研究型测定法的“概念证明”后，发明人调查了相对于认知正常的参与者(ctrl)(n＝20)而言在mci(n＝38)和ad(n＝50)患者的csf中的神经颗粒蛋白truncp75和bace1的水平。另外，在样品中对总-tau、αβ1-42、αβ1-40和αβ1-38进行了定量，所述样品是在对临床诊断不知情的情况下进行测试的。表3总结了每种分析物的水平，与该群体的人口统计学和临床数据相组合地。
相比于ctrl组而言，csf神经颗粒蛋白truncp75在mci患者中显著地增加(p<0.01)，但在ad患者中没有显著地不同(表3，图3)。类似地，在mci和ad组之间未注意到显著的差异。相反地，csfbace1水平在mci组中相比于ad患者而言更高(p<0.01)，而在ctrl和mci之间和在ctrl和ad之间未见显著的差异。对于这两种蛋白质，在从认知正常进展至mci时均存在渐增的组水平这样的趋势，随后为降低，在向ad进展的情况下。这些发现通过接受者操作特征(receiveroperatingcharacteristic，roc)分析而得到反映，其中比较了ctrl组与这两个患者组(表4)。csf神经颗粒蛋白truncp75(作为单一分析物)在区分mci与认知健康的人中运作良好，其中具有0.741的roc曲线下面积(auc)(p＝0.003)，但是不能区别ad与对照(auc＝0.615，ns)。关于bace1，对于作为单一分析物的csfbace1，对于mci(auc＝0.620，ns)和对于ad(auc＝0.554，ns)均未注意到显著的区分力。如所预期的，roc统计学证明了经典的csf生物标志物总-tau和αβ1-42的强的诊断价值。关于csf总-tau的auc值在mci的情况下为0.842(p<0.0001)，和对于ad为0.854(p<0.0001)，而关于csfαβ1-42，auc值在mci的情况下为0.765(p＝0.001)，和对于ad为0.849(p<0.0001)。将所述生物标志物组合成比例明显地导致更高的auc值以及增加的统计学强度(表4)。关于csf神经颗粒蛋truncp75/αβ1-42的比例的auc值在用于区分mci与ctrl时为0.874(p<0.0001)，和在ad对ctrl的情况下为0.903(p<0.0001)，相伴的是csfaβ1-42/总-tau这一比例的最大的区分性能(auc(mci)＝0.871，p<0.0001；auc(ad)＝0.923，p<0.0001)。这两种突触蛋白质即神经颗粒蛋白truncp75和bace1的组合还导致高于作为单一参数的这两种分析物的值的auc值。关于csf神经颗粒蛋白truncp75/bace1的auc值在关于mci患者的情况下为0.715(p＝0.008)，和对于ad组为0.806(p<0.0001)。
此外，发明人还调查了在临床组中所有csf分析物之间的关系，并且与上面所描述的“概念证明”分析相似，在mci(0.793，p<0.0001)以及ad(0.711，p<0.0001)患者中，在神经颗粒蛋白truncp75和bace1之间存在强的相关性(表5)。还观察到在这些突触分析物和总-tau之间的中等强的相关性，即神经颗粒蛋白truncp75和tau在mci(0.635，p<0.0001)和ad(0.617，p<0.0001)中均相关，如bace1和tau在mci(0.588，p<0.001)和ad(0.497，p<0.001)中那样。尽管神经颗粒蛋白truncp75、bace1和tau看起来紧密相关联，但当研究它们与αβ-种类的各自关联时，细微的差异变得明显。神经颗粒蛋白truncp75在mci以及ad中与aβ1-40和αβ1-38两者均相关，但在这两种情况下均不与αβ1-42相关。另一方面，tau在mci中显示出尽管弱但显著的与αβ1-42的相关性(0.383，p<0.05)，而bace1在ad中与αβ1-42相关(0.408，p<0.01)。当考虑csfαβ1-42/αβ1-40和csfαβ1-42/αβ1-38这些比例时，发现更多的差异(表6)。在mci群体中，神经颗粒蛋白truncp75和bace1两者与这两个比例均相关，而tau则不是。
1.9csf生物标志物与mmse下降的关系
除了其诊断性能外，发明人还通过评估它们与认知下降的关系而评价了作为可能的进展生物标志物的分析物。因此，发明人在其中监测mmse的mci(n＝36)和ad(n＝45)患者的亚组中，考虑了所有分析物的csf水平(作为单一参数以及比例)。在关于年龄和性别进行调整后，以纵向mmse测量值作为结果的线性混合模型分析证明，处于基线的单一分析物(即神经颗粒蛋白truncp75、bace1和经典的csfad生物标志物)中没有一个与认知下降的速度相关联(表7)。大多数的生物标志物比例也不相关，虽然存在有csf生物标志物的一个特殊比例，其在mci和ad患者两者中均显示出对于mmse的纵向下降的始终如一地显著的影响，即csf神经颗粒蛋白truncp75/bace1(β＝-0.018；p<0.05，对于mci；β＝-0.051；p<0.01，对于ad)。倘若将两个可能的混杂因素(tau和αβ1-42的csf水平)作为固定效应添加至该模型，统计学显著性仍然不变。为了阐明神经颗粒蛋白truncp75/bace1比例与认知衰退之间的这一相关性，将具有在lp时和在lp后随访的mmse的患者亚组按照比例水平分为三个三分位组(图5)。在mci和ad组中，具有最高比例水平的个体(每个由细线表示)，即在最高的三分位组中的个体，均具有最陡的斜率或mmse的最大改变。该效应在ad患者中更加明显。存在一个另外的也与认知下降显著相关的比例，虽然仅在ad患者中：csf神经颗粒蛋白truncρ75/αβ1-42(β＝-3.589；p<0.05)。
2结果
2.1神经颗粒蛋白单克隆抗体的产生
将作为捕获抗体的adxngci2和作为经生物素化的检测抗体的adxngct1相组合导致对于在p75处经截短的神经颗粒蛋白来说特异的研究型夹心式elisa(图1c)。
2.2csf神经颗粒蛋白、csfbace1和经典的csfad生物标志物的年龄依赖性
在临床研究的准备中，发明人首先在一大组的csf样品中作为“概念证明(proof-of-concept)”验证了神经颗粒蛋白truncp75测定法。特别地，除了一群诊断不明确的csf样品(n＝161)(biomnis,france)外，还分析了关于该临床研究的对照组(n＝20)。选择了在宽的年龄范围内并具有相似的男性和女性受试者数目的前一个样品组。总共分析了181份样品(104名女性/77名男性受试者)，其中中值年龄为50.3(岁)(范围7.0-92.1)。除了神经颗粒蛋白truncp75外，我们还分析了bace1、tau、αβ1-42、αβ1-40和aβ1-38的csf水平。表1汇总了所有分析物的浓度。如所描述的，仅在非常少数目的样品中不能测定神经颗粒蛋白truncp75水平，即2.8％，这与其他五种分析物是高度相当的，即1.7％(对于总-tau、αβ1-42和αβ1-40)、1.1％(对于αβ1-38)和0％(对于bace1)。另外，所有csf分析物均显示出与年龄的关联，虽然在αβ1-42的情况下非常弱：神经颗粒蛋白truncp75(ρ＝0.253；p＝0.0007)、bace1(ρ＝0.412；p<0.0001)、tau(ρ＝0.366；p<0.0001)、αβ1-42(ρ＝0.147；p＝0.050)、αβ1-40(ρ＝0.305；p<0.0001)和αβ1-38(ρ＝0.326；p<0.0001)。图3(其图解说明了数种csf分析物与年龄之间的该关系)也确证了关于该临床研究的年龄匹配的对照组的这一准确选择。最后，一方面在神经颗粒蛋白truncp75、bace1和tau之间存在强的相关性，和另一方面在这三种αβ-种类之间存在牢固的关系(表2)。
2.3在mci和ad患者中神经颗粒蛋白trunc75、bace1和经典的ad标志物的csf水平
发明人调查了相对于认知正常的参与者(ctrl)(n＝20)而言在mci(n＝38)和ad(n＝50)患者的csf中的神经颗粒蛋白truncp75和bace1的水平。另外，在样品中对总-tau、αβ1-42、αβ1-40和αβ1-38进行了定量，所述样品是在对临床诊断不知情的情况下进行测试的。表3总结了每种分析物的水平，与该群体的人口统计学和临床数据相组合地。
相比于ctrl组而言，csf神经颗粒蛋白truncp75在mci患者中显著地增加(p<0.01)，但在ad患者中没有显著地不同(表3，图4)。类似地，在mci和ad组之间未注意到显著的差异。相反地，csfbace1水平在mci组中相比于ad患者而言更高(p<0.01)，而在ctrl和mci之间和在ctrl和ad之间未见显著的差异。对于这两种蛋白质，在从认知正常进展至mci时均存在渐增的组水平这样的趋势，随后为降低，在向ad进展的情况下。这些发现通过接受者操作特征(receiveroperatingcharacteristic，roc)分析而得到反映，其中比较了ctrl组与这两个患者组(表4)。csf神经颗粒蛋白truncp75(作为单一分析物)在区分mci与认知健康的人中运作良好，其中具有0.741的roc曲线下面积(auc)(p＝0.003)，但是不能区别ad与对照(auc＝0.615，ns)。关于bace1，对于作为单一分析物的csfbace1，对于mci(auc＝0.620，ns)和对于ad(auc＝0.554，ns)均未注意到显著的区分力。如所预期的，roc统计学证明了经典的csf生物标志物总-tau和αβ1-42的强的诊断价值。关于csf总-tau的auc值在mci的情况下为0.842(p<0.0001)，和对于ad为0.854(p<0.0001)，而关于csfαβ1-42，auc值在mci的情况下为0.765(p＝0.001)，和对于ad为0.849(p<0.0001)。将所述生物标志物组合成比例明显地导致更高的auc值以及增加的统计学强度(表4)。关于csf神经颗粒蛋truncp75/αβ1-42的比例的auc值在用于区分mci与ctrl时为0.874(p<0.0001)，和在ad对ctrl的情况下为0.903(p<0.0001)，相伴的是csfaβ1-42/总-tau这一比例的最大的区分性能(auc(mci)＝0.871，p<0.0001；auc(ad)＝0.923，p<0.0001)。这两种突触蛋白质即神经颗粒蛋白truncp75和bace1的组合还导致高于作为单一参数的这两种分析物的值的auc值。关于csf神经颗粒蛋白truncp75/bace1的auc值在关于mci患者的情况下为0.715(p＝0.008)，和对于ad组为0.806(p<0.0001)。
此外，发明人还调查了在临床组中所有csf分析物之间的关系，并且与上面所描述的“概念证明”分析相似，在mci(0.793，p<0.0001)以及ad(0.711，p<0.0001)患者中，在神经颗粒蛋白truncp75和bace1之间存在强的相关性(表5)。还观察到在这些突触分析物和总-tau之间的中等强的相关性，即神经颗粒蛋白truncp75和tau在mci(0.635，p<0.0001)和ad(0.617，p<0.0001)中均相关，如bace1和tau在mci(0.588，p<0.001)和ad(0.497，p<0.001)中那样。尽管神经颗粒蛋白truncp75、bace1和tau看起来紧密相关联，但当研究它们与αβ-种类的各自关联时，细微的差异变得明显。神经颗粒蛋白truncp75在mci以及ad中与aβ1-40和αβ1-38两者均相关，但在这两种情况下均不与αβ1-42相关。另一方面，tau在mci中显示出尽管弱但显著的与αβ1-42的相关性(0.383，p<0.05)，而bace1在ad中与αβ1-42相关(0.408，p<0.01)。当考虑csfαβ1-42/αβ1-40和csfαβ1-42/αβ1-38这些比例时，发现更多的差异(表6)。在mci群体中，神经颗粒蛋白truncp75和bace1两者与这两个比例均相关，而tau则不是。
2.4csf生物标志物与mmse下降的关系
发明人在其中在lp后纵向地监测mmse至少一年的mci(n＝36)和ad(n＝41)患者的亚组中，考虑了所有分析物的csf水平(作为单一参数以及比例)。在关于年龄和性别进行调整后，以纵向mmse测量值作为结果的线性混合模型分析证明，处于基线的单一分析物(即神经颗粒蛋白truncp75、bace1和经典的csfad生物标志物)中没有一个与认知下降的速度相关联。但是，存在有csf生物标志物的一个特殊比例，其横跨mci和ad组两者均显示出对于mmse的纵向下降的始终如一地显著的影响，即csf神经颗粒蛋白truncp75/bace1(β＝-0.018；p<0.05，对于mci；β＝-0.051；p<0.01，对于ad)(图5)。倘若将两个可能的混杂因素(tau和αβ1-42的csf水平)作为固定效应添加至该模型，统计学显著性仍然不变。存在一个另外的也与认知下降显著相关的比例，虽然仅在ad患者中：csf神经颗粒蛋白truncρ75/αβ1-42(β＝-3.589；p<0.05)。
总结
在本研究的样品组中，发明人已显示，csf神经颗粒蛋白truncp75/bace1的比例在由于ad而引起的mci以及由于ad而引起的痴呆中与正在经历的和未来的认知下降相关，这与作为单一参数的神经颗粒蛋白truncp75和bace1形成对比，或者与目前的adcsf生物标志物总-tau、αβ42或αβ40形成对比。
表1
在未经选择的csf样品的群组和关于该临床研究的年龄匹配的对照组中，所有经定量的分析物以及其与年龄的相关性的概览。
％n＝不可定量的样品的百分比(181个之中)
表2
在来自该临床研究的年龄匹配的对照和在诊断上未经选择的样品的群组中，关于csf生物标志物的spearman相关性分析。在该表中由spearmanρ-值所表示的每个所研究的在分析物之间的关系是在统计学上显著的(p<0.0001)。
表3
临床组的人口统计学、临床和生物标志物数据的汇总，其中关于分析物的数据被汇总为中值，其具有25th和75th四分位数。在年龄匹配的对照组(ctrl)与mci和ad组之间的中值差异使用kruskal-wallis检验来进行检验。
ad＝阿尔茨海默病；ctrl＝认知健康的；f＝女性；lp＝腰部穿刺；m＝男性；mci＝具有高的关于ad的概率的轻度认知缺损；mmse＝简短精神状态检查；n＝样品数目；yr＝岁
统计学显著性(相对于ctrl)由*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001；****p<0.0001来表示。
表4
关于csf生物标志物的roc-统计学(作为单一分析物或作为比例)，其中将ctrl组的那套数据与mci或ad组进行比对。<0.05的p-值以粗体字进行强调。
ad＝阿尔茨海默病；auc＝roc下面积；ctrl＝认知健康的；f＝女性；m＝男性；mci＝具有高的关于ad的概率的轻度认知缺损；mmse＝简短精神状态检查；n＝样品数目；roc＝接受者操作曲线；yr＝岁
表5
在mci(对角线之上)和ad(对角线之下)患者中，关于csf生物标志物的spearman相关性分析。
ad＝阿尔茨海默病；mci＝具有高的关于ad的概率的轻度认知缺损。统计学显著性由*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001；****p<0.0001来表示。
表6
在ctrl以及mci和ad中，以csfaβ1-42/aβ1-40和csfαβ1-42/αβ1-38这些比例关于csf神经颗粒蛋白truncp75、bace1和总-tau的spearman相关性分析
ad＝阿尔茨海默病；ctrl＝认知健康的；mci＝具有高的关于ad的概率的轻度认知缺损。
相应的统计学显著性由**p<0.01；***p<0.001；****p<0.0001来表示。
表7
在认知下降与单一分析物和比例之间的关联性的统计学显著性，其基于关于年龄和性别进行调整的线性混合模型分析(mcin＝36；adn＝45)。<0.05的p-值加有下划线和以粗体字进行强调。
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序列表
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