结肠直肠癌分类的标志物基因、判断淋巴结转移以预后结肠直肠癌的方法及用于其的试剂盒与流程

本发明涉及癌症、特别是结肠直肠癌的分类、预后和治疗领域。

背景

结肠直肠癌(crc)是世界上癌症患者中死亡率的第二主要原因和全球第三大诊断形式的癌症。这代表健康护理系统的巨大负担。crc的最重要的预后特征是淋巴结转移的存在或不存在(changg.j.等人.j.natl.cancerinst.,第99卷，第433-441页(2007)；iddingsd.和bilchika.j.surg.oncol.,第96卷，第671-677页(2007)；nicastrid.g.等人.j.mol.diagn.,第9卷，第563-571页(2007))。只有当患者被切除治愈时，相关淋巴结用于研究才是可行的。因此，彻底确定切除的肿瘤样本中的淋巴结状态是至关重要的。目前，约50％的具有肿瘤细胞阳性的淋巴结，即，iii期crc(anytn1-2m0)的患者以及约25％的不具有检测到的肿瘤细胞阳性的淋巴结，即i期(tl-2n0m0)和ii期(t3-4n0m0)的患者将复发(c.等人.actaoncol.,第54卷，第5-16页(2015))。这些结果强烈暗示淋巴结中的肿瘤细胞在侵袭性方面可以变化，并且在许多情况下，结中肿瘤细胞的存在被目前的标准方法遗漏。因此，极度重要的是1)准确检测淋巴结中肿瘤细胞的存在，和2)确定它们的转移潜能，即它们的侵袭性。通过改进淋巴结状态(n-分期)的确定，并且引入用于扩散的肿瘤细胞的侵袭性参数，将获得改进的分期，从而避免i期和ii期患者的治疗不足和iii期患者的过度治疗，此外，如果其淋巴结中具有肿瘤细胞的患者可根据复发和癌症死亡风险的差异被分类为亚组，那么该信息不仅可用于通过目前药物库的治疗，而且可用于开发新药物、新治疗计划表以及根据复发风险调整的随访计划表等。

在临床实践中，淋巴结转移的存在或不存在目前通过苏木精&伊红(h&e)染色的切除的区域淋巴结组织切片的组织病理学检查来确定。目前的指南要求应检查至少12个淋巴结(tsaih.l.等人.bmcsurg.,第16卷，第17页(2016))。在tnm分类中，n1表示1至3个检查的结关于肿瘤细胞的存在为阳性，并且n2表示4至6个结为阳性。n2患者的预后比n1患者差。此外，淋巴结比率，即阳性淋巴结数与检查的淋巴结总数的比率，是重要的预后因素——比率越高，预后越差(parnabyc.n.等人，br.j.cancer,第113卷，第212-219页(2015))。通过常规方法遗漏肿瘤细胞的主要原因是双重的：样品尺寸太小和灵敏度不足。通过组织切片的h&e染色至多只能检查淋巴结体积的几％。替代方法是确定在该类型的所有肿瘤细胞中表达的一种或若干种生物标志物的mrna水平，并且从整个淋巴结或者出于伦理原因目前的选择为一半结中提取rna。已经表明，在具有拷贝标准物情况下的实时定量逆转录酶-聚合酶链式反应(qrt-pcr)分析是用于生物标志物的mrna分析的最有用的方法。其是高度灵敏的、客观的、定量的，和可自动化修改的。发现生物标志物癌胚抗原(cea，ceacam5)的mrna分析对于检测源自大肠的肿瘤细胞非常有用。该生物标志物允许鉴定其淋巴结中具有肿瘤细胞的i期和ii期患者，这些肿瘤细胞没有被目前的金标准，即h&e染色的切片的组织病理学检测出(ohlssonl.等人.br.j.cancer,第95卷，第218-225页(2006)；ohlssonl.等人.int.j.cancer,第130卷，第1833-1843页(2012))。这些患者中的一些已经死于复发性疾病(ohlssonl.等人.br.j.cancer,第95卷，第218-225页(2006)；ohlssonl.等人.int.j.cancer,第130卷，第1833-1843页(2012))。因此，与单独的金标准相比，通过使用该标志物获得更精细的分层。生物标志物细胞角蛋白20(ck20)也可用于该目的，尽管灵敏性有点低(ohlssonl.等人.br.j.cancer,第95卷，第218-225页(2006))。目前仅存在一种公开的用于crc的生物标志物，即激肽释放酶相关肽酶6(klk6)，所述标志物显示出侵袭性标志物特性(ohlssonl.等人.br.j.cancer,第107卷，第150-157页(2012))。它在crc肿瘤细胞中异位表达，并且显示出以随着侵袭性增加而增加的水平表达。

crc中发展远端转移的普遍接受的途径是肿瘤细胞经由淋巴管离开结肠或直肠中的原发部位，首先在区域淋巴结中定居，并且然后扩散到远端部位，如肝脏。最终杀死患者的是远端转移。该途径的证据是区域淋巴结中肿瘤细胞的存在或不存在是crc死亡或存活的最佳预后标志物的事实。

本发明涉及：1)鉴定用于crc的两种新侵袭性生物标志物；一种在crc肿瘤细胞自身中表达，而另一种在淋巴结微环境中的支持细胞中表达。2)用于确定淋巴结状态的方法，该方法准确地检测淋巴结中肿瘤细胞的存在或不存在，并且另外提供关于这些细胞的侵袭性的信息。在所提出的方法中，确定2种新生物标志物和3种先前描述的生物标志物的定量mrna水平。如果应用于crc淋巴结分析，那么它将准确地确定淋巴结累及，并且允许在初级治疗(即肿瘤手术切除)后，针对复发和癌症死亡的风险将crc患者分类为不同的风险组。迄今为止，该目标还不可能实现。

本发明的目的

本发明的一个目的是提供一组分子生物标志物，所述生物标志物可用于患有结肠直肠癌的受试者的分类、预后预测和指导患有结肠直肠癌的受试者的治疗决策。

本发明的另一个目的是提供用于对受试者中的结肠直肠癌进行分类，以及用于使用该分类来预测受试者的预后和用于为受试者做出治疗决策的客观和定量方法。

发明描述

本发明人已经鉴定出作为分子生物标志物的基因溶质载体家族35成员d3(slc35d3)(genbanknm_001008783)和骨膜蛋白、成骨细胞特异性因子(postn)(genbanknm_006475)的表达水平，可用于确定受试者中结肠直肠癌的转移潜能和/或肿瘤侵袭性。

基因slc35d3和postn的表达水平可优选与基因激肽释放酶相关肽酶6(klk6)(genbanknm_002774)的表达水平一起使用，并且甚至更优选还与形成低聚物粘液/凝胶的gen粘蛋白2(muc2)(genbanknm_002457)的表达水平一起使用，用于确定转移潜能和/或肿瘤侵袭性。

方法可被应用以确定从受试者获得的区域淋巴结样品中的基因表达水平，或从受试者获得的原发性肠肿瘤、血液和/或粪便样品中的基因表达水平。

这些基因的表达水平可与基因癌胚抗原相关细胞粘附分子5(ceacam5)(genbanknm_004363)(已知的肿瘤标志物)的表达水平相关和/或与18srrna的水平相关。

因此，本发明的一个方面提供用于确定受试者中结肠直肠癌的转移潜能和/或肿瘤侵袭性的方法，包括以下步骤：

a)确定从受试者获得的区域淋巴结样品中基因slc35d3和postn的基因表达水平；和

b)将步骤a)中确定的基因表达水平与参考患者群体中相同基因的参考基因表达水平进行比较；

其中与参考相比，基因slc35d3和postn的更高表达水平与增加的转移潜能和/或肿瘤侵袭性相关联。

优选地，方法还可包括确定所述样品中基因klk6的基因表达水平。

因此，在本发明的第一方面的一个实施方案中，提供用于确定受试者中结肠直肠癌的转移潜能和/或肿瘤侵袭性的方法，包括以下步骤：

a)确定从受试者获得的区域淋巴结样品中基因slc35d3、postn和klk6的基因表达水平；和

b)将步骤a)中确定的基因表达水平与参考患者群体中相同基因的参考基因表达水平进行比较；

其中与参考相比，基因slc35d3、postn和klk6的更高表达水平与增加的转移潜能和/或肿瘤侵袭性相关联。

优选地，方法还可包括确定所述样品中基因muc2的基因表达水平。

因此，在本发明的第一方面的另一个实施方案中，提供用于确定受试者中结肠直肠癌的转移潜能和/或肿瘤侵袭性的方法，包括以下步骤：

a)确定从受试者获得的区域淋巴结样品中基因slc35d3、postn、klk6和muc2的基因表达水平；和

b)将步骤a)中确定的基因表达水平与参考患者群体中相同基因的参考基因表达水平进行比较；

其中与参考相比，基因slc35d3、postn、klk6和muc2的更高表达水平与增加的转移潜能和/或肿瘤侵袭性相关联。

优选地，方法还可包括以下步骤：

c)确定所述样品中基因ceacam5的基因表达水平和18srrna的水平；

d)基于步骤a)和c)中获得的结果，计算比率slc35d3/ceacam5、klk6/ceacam5、postn/18srrna和muc2/ceacam5；

e)取决于所述比率是否大于基于所述参考患者群体中相同比率的截止值，赋予步骤d)中获得的比率(+1)或(0)的值，并且其中高于截止值的比率获得值(+1)，并且低于截止水平的值获得值(0)；和

f)使用步骤e)中获得的比率、使用式[a＝slc35d3/ceacam5+klk6/ceacam5+postn/18srrna-muc2/ceacam5]，计算指数；

其中指数(+3)与非常高的转移潜能和/或肿瘤侵袭性相关联，指数(+2)和(+1)与高转移潜能和/或肿瘤侵袭性相关联，并且指数(0)和(-1)与低转移潜能和/或肿瘤侵袭性相关联。

所述截止值可以为所述参考患者群体的第7十分位数的比率、所述参考患者群体的第3四分位数的比率或所述参考患者群体的第8十分位数的比率。

方法可以被体外和/或离体执行。

方法还可包括在有相应需要的受试者中治疗结肠直肠癌的另外步骤。

在另一方面，本发明提供确定受试者中结肠直肠癌的转移潜能和/或肿瘤侵袭性的方法，包括：

a)确定从受试者获得的原发性肠肿瘤、血液或粪便样品中的基因slc35d3、klk6、muc2和ceacam5的基因表达水平；

b)基于步骤a)中获得的结果，计算比率slc35d3/ceacam5、klk6/ceacam5和muc2/ceacam5；和

c)将步骤b)中确定的比率与根据参考患者群体中相同基因的表达水平计算的参考比率进行比较；

其中与参考相比，更高的比率slc35d3/ceacam5和klk6/ceacam5与增加的转移潜能和/或肿瘤侵袭性相关联，并且与参考相比，更高的比率muc2/ceacam5与降低的转移潜能和/或肿瘤侵袭性相关联。

方法可以被体外和/或离体执行。

方法还可包括在有相应需要的受试者中治疗结肠直肠癌的另外步骤。

根据本发明，基因表达水平可通过定量从所述基因表达的mrna的量来确定。

mrna的量可通过杂交、测序或定量rt-pcr来确定。

更具体地，mrna的量可通过使用选自微阵列和珠阵列技术、转录组测序、实时定量rt-pcr、多重定量rt-pcr的方法来确定。

根据方法，基因表达水平可使用rna或dna拷贝标准物来确定和/或18srrna水平可使用18srrna标准物来确定。

本发明的另一方面提供用于确定被诊断患有结肠直肠癌的受试者的预后的方法。所述方法可包括使用根据本发明的方法确定受试者中结肠直肠癌的转移潜能和/或肿瘤侵袭性。

所述方法可包括如果转移潜能和/或肿瘤侵袭性低，那么确定受试者具有良好的预后，或

如果转移潜能和/或肿瘤侵袭性高，那么确定受试者具有差的预后。与良好的预后相比，差的预后可以为存活可能性的降低。

方法可以被体外和/或离体执行。

方法还可包括在有相应需要的受试者中治疗结肠直肠癌的另外步骤。

本发明的另一方面提供用于确定用于被诊断患有结肠直肠癌并且患有肿瘤的受试者的治疗的方法。所述方法可包括使用根据本发明的方法确定受试者中结肠直肠癌的转移潜能和/或肿瘤侵袭性，和取决于确定的转移潜能和/或肿瘤侵袭性来确定用于所述受试者的治疗。

方法可以被体外和/或离体执行。

方法还可包括在有相应需要的受试者中治疗结肠直肠癌的另外步骤。

治疗可以为对被确定具有高转移潜能和/或肿瘤侵袭性的患者给予术后治疗，例如化疗。

治疗可以为对具有低转移潜能和/或肿瘤侵袭性的患者避免术后治疗。

本发明的另一方面提供用于确定被诊断患有结肠直肠癌的受试者的转移潜能和/或肿瘤侵袭性的试剂盒。试剂盒可包括用于确定基因ceacam5、klk6、postn、slc35d3和muc2中的一种或更多种的基因表达水平的核酸引物和探针，和任选地用于确定18srrna水平的核酸引物和探针。

在本发明的一个实施方案中，提供用于确定被诊断患有结肠直肠癌的受试者的转移潜能和/或肿瘤侵袭性的试剂盒，包括用于确定基因slc35d3和postn的基因表达水平的核酸引物和探针。

在本发明的另一个实施方案中，提供用于确定被诊断患有结肠直肠癌的受试者的转移潜能和/或肿瘤侵袭性的试剂盒，包括用于确定基因slc35d3、postn和klk6的基因表达水平的核酸引物和探针。

在本发明的另一个实施方案中，提供用于确定被诊断患有结肠直肠癌的受试者的转移潜能和/或肿瘤侵袭性的试剂盒，包括用于确定基因slc35d3、postn和muc2的基因表达水平的核酸引物和探针。

在本发明的另一个实施方案中，提供用于确定被诊断患有结肠直肠癌的受试者的转移潜能和/或肿瘤侵袭性的试剂盒，包括用于确定基因slc35d3、postn、klk6和muc2的基因表达水平的核酸引物和探针。

在本发明的另一个实施方案中，提供用于确定被诊断患有结肠直肠癌的受试者的转移潜能和/或肿瘤侵袭性的试剂盒，包括用于确定基因slc35d3、postn、klk6、muc2和ceacam5的基因表达水平的核酸引物和探针。

核酸引物和探针可选自表1中给出的那些引物和探针。更具体地，核酸引物和探针可选自seqidno:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15。

试剂盒还可包括mrna、rna和/或dna拷贝标准物。

本发明的另一方面提供用于治疗结肠直肠癌的方法。所述方法可包括使用根据本发明的方法确定受试者中结肠直肠癌的转移潜能和/或肿瘤侵袭性，和取决于确定的转移潜能和/或肿瘤侵袭性来治疗所述受试者。

治疗可以为对被确定具有高转移潜能和/或肿瘤侵袭性的患者给予术后治疗，例如化疗。

治疗可以为对具有低转移潜能和/或肿瘤侵袭性的患者避免术后治疗。

附图说明

图1.原发性crc肿瘤(●)(n＝56)和正常结肠组织(n＝5)(○)中ceacam5、muc2、klk6、postn和slc35d3mrna的表达水平。

图2.患有i至iv期crc的患者和对照患者(ctr)的淋巴结中的(a)slc35d3和(b)postnmrna表达水平。166名crc患者和23名对照患者中的每个由具有最高mrna值的淋巴结代表。

图3.来自患有i至iv期crc的患者的淋巴结中生物标志物mrna与ceacam5mrna的比率。166名患者中的每个由具有最高mrna值的淋巴结代表，并且由实心圆指示。

图4.根据卡普兰-迈耶(kaplan-meier)的crc患者(n＝166)累积存活曲线。基于生物标志物slc35d3、postn、klk6、muc2和ceacam5的mrna值并且根据式(式a＝slc35d3/ceacam5+klk6/ceacam5+postn/18srrna-muc2/ceacam5)进行计算，将患者分组(-1、0、+1、+2和+3)。将每种标志物的mrna值的第8十分位数用于将标志物值分类为阳性或阴性，赋予前者值(1)，并且赋予后者值(0)。选择具有最高ceacam5mrna值的淋巴结代表患者。另外的细节参见正文。

图5.根据卡普兰-迈耶的crc患者(n＝166)累积存活曲线。基于生物标志物slc35d3、klk6、muc2和ceacam5的mrna值并且根据式(式e＝slc35d3/ceacam5+klk6/ceacam5-muc2/ceacam5)进行计算，将患者分组(-1、0、+1和+2)。另外的细节参见图4的说明和正文。

实施例

鉴定与结肠直肠癌受试者中癌症死亡风险显著相关的基因和基因标签

对肿瘤进展重要的基因最可能在原发性肿瘤组织和引流肠的区域淋巴结中存在的继发性肿瘤二者中表达。通过分析来自4名患有iii期crc的患者的4个不同h&e阳性淋巴结(即含有肿瘤细胞的淋巴结)加上来自这些患者中的3名患者的3个原发性肿瘤的rna执行进展标志物的微阵列搜索。还分析来自7名对照患者(来自2名溃疡性结肠炎患者、1名克罗恩氏结肠炎患者、1名结肠脂肪瘤患者和3名正常结肠上皮细胞样品的淋巴结)的rna。将crc样品分别地相对于作为一个组的所有对照样品进行比较。通过将统计显著性设置为p<0.05，将倍数改变设置为≥5，并且将最小强度设置为15，过滤微阵列数据。以这种方式，鉴定在大多数crc样品(≥5/7)中表达的倍数改变≥5倍的许多基因。其中包括slc35d3、postn和klk6。

商购可得的实时qrt-pcr测定被用于验证postn、slc35d3和klk6的微阵列结果(taqman基因表达测定)。在最后一种情况下，对于不同剪接形式进行3次测定。所有三种基因都在一组原发性crc肿瘤样品中表达(n＝8)，而slc35d3和klk6但不是postn在所有crc细胞系中表达(n＝5)。

表1.用于slc35d3、postn、klk6、muc2、ceacam5和18srrna的qrt-pcr测定中的引物和探针序列

使用如(fahlgrena.等人.clin.exp.immunol.,第131卷，第90-101页(2003)；ohlssonl.thesis,isbn978-91-7459-318-1(2011))所描述的taqmanezrt-pcr技术，通过rna拷贝标准物构建实时qrt-pcr测定。用于slc35d3、postn、klk6、muc2和ceamrna的实时qrt-pcr测定的引物和探针序列在表1中示出，并且用于构建rna拷贝标准物的引物在表2中示出。使用这些测定，分析一组包括原发性crc肿瘤、正常结肠组织和纯化的结肠上皮细胞、crc细胞系、外周血单核细胞(pbmc)、不同免疫细胞系和成纤维细胞细胞系的rna样品(表3)。图1中示出56个原发性crc肿瘤和5个正常结肠样品的个体值。为了进行比较，包括ceacam5和muc2的结果(ohlssonl.thesis,isbn978-91-7459-318-1(2011))。

明显的是，所有五种生物标志物mrna都在原发性crc肿瘤中表达，尽管以高度不同的对样品中的18srrna含量归一化的拷贝数水平，从ceacam5的中位数164到slc35d3的中位数0.17，反映特定mrna编码的蛋白分子的丰度。

其次，crc细胞系表达除postn以外的所有标志物mrna，而postn在成纤维细胞细胞系中以高水平表达。

第三，没有一个标志物在免疫细胞系中表达至显著程度。

第四，ceacam5在原发性crc肿瘤和正常结肠上皮细胞中以类似水平表达。基于后面的发现和先前的知识(ohlssonl.等人.br.j.cancer，第95卷，第218-225页(2006))，ceacam5被认为是源自大肠的细胞的优选标志物。此外，它的高表达水平使得它成为用于检测淋巴结中的结肠直肠癌细胞的非常灵敏的标志物。

第五，muc2测量crc肿瘤是否为粘液性的程度，muc2是结肠和直肠中的主要粘蛋白。具有粘液性肿瘤的患者的预后比具有非粘液性肿瘤的患者好(byrdj.c.和bresalierr.s.cancermetastasisreview，第23卷，第77-99页(204)；ohlssonl.等人.int.j.cancer，第130卷，第1833-1843页(2012))。

最后，与ceacam5和muc2相比，klk6和slc35d3二者在crc肿瘤和大多数crc系中表达，但不在正常结肠上皮细胞中表达，即，它们在crc肿瘤中异位表达。

表2.用于克隆cdna和构建用于slc35d3、postn、klk6、muc2、ceacam5和18srrna的rna拷贝标准物的rt-pcr中的引物序列

表3.slc35d3、postn、klk6、muc2和ceacam5mrna在原发性crc肿瘤、正常结肠、正常结肠上皮细胞、crc细胞系、免疫细胞系、成纤维细胞细胞系、crc肝转移和正常肝脏中的表达水平。

*中位数和四分位数的间距从第25到第75百分位数。**细胞系和pbmc，3次测定的平均值。ec，纯化的上皮细胞；pbmc，外周血单核细胞；0，<0.00001mrna拷贝/18srrna单位。

应用组合生物标志物mrna分析来预测crc死亡的概率

分析来自166名手术治疗的具有代表所有四个tnm期的crc并且具有已知的ceacam5mrna、klk6mrna、muc2mrna和18srrna表达水平的患者的淋巴结的临床材料的slc35d3mrna和postnmrna的表达水平。总共分析来自多于600个淋巴结的mrna。将mrna值相对于18srrna归一化，并且表示为mrna拷贝/18srrna单位。由我们小组以前的研究证明，18srrna是用于归一化的优异的rna种类(basa.等人，scand.j.immunol.，第59卷，第566-573页(2004)；ohlssonl.等人.int.j.cancer，第130卷，第1833-1843页(2012))。在另外的分析中，具有最高mrna表达水平的结被用于代表患者。这类似于当前的临床实践，即h&e阳性结被认为是信息性的，而h&e阴性结被认为是非信息性的，除了当所有结都是阴性时的情况之外。图2示出结果。该图还示出来自非crc对照患者的淋巴结的mrna值，并且虚线指示该对照组的最高值。来自iii和iv期患者的淋巴结比来自i或ii期患者的结显示出更大比例的具有mrna值高于截止水平的结[slc35d3：i期＝18％，ii期＝9％，iii期＝25％，和iv期＝79％；postn：i期＝25％，ii期＝13％，iii期＝32％，和iv期＝69％]。

将来自slc35d3mrna和postnmrna表达水平的分析的结果与已知的crc患者的相同结中ceacam5mrna、klk6mrna和muc2mrna的表达水平组合使用(ohlssonl.等人.br.j.cancer，第95卷，第218-225页(2006)；ohlssonl.thesis,isbn978-91-7459-318-1(2011)；ohlssonl.等人.br.j.cancer，第107卷，第150-157页(2012))。5种生物标志物的截止水平如下确定：根据最高淋巴结中的生物标志物表达水平对患者进行排序，并且然后将患者分成患者数相等的五组。使用cox回归分析针对无疾病存活比较各组。根据该分析，截止水平被定义为第8十分位数处的mrna表达水平，因为对于所有5种标志物，各组低于第8十分位数在无疾病存活方面没有显著差异。死于crc以外原因的患者被认为无疾病。将患者分成两组，即mrna表达值高于截止的组和mrna表达值低于截止的组，并且对于每个组，通过根据卡普兰-迈耶的累积存活分析来计算手术后平均存活时间，并且根据单因素cox回归分析来估计crc复发的风险。五种生物标志物的结果在表4中示出。如可以看出的，对于所有生物标志物来说，高于截止水平的mrna值与较差的预后相关，具有非常显著p值。

表4.具有生物标志物(+)或生物标志物(-)淋巴结的crc患者的平均存活时间和疾病复发的风险的比较分析

*截止水平为患者群体的第8十分位数。

**如通过根据卡普兰-迈耶的累积存活分析计算的手术后平均存活时间。

***如根据单因素cox回归分析计算的风险比率。

确定所有五种生物标志物的水平并且组合不同的测量实现患者组针对存活的进一步区分。在本发明的一个实施方案中，衍生自生物标志物分析以预测手术后存活的组合信息如下使用：对于每个最高淋巴结，将生物标志物slc35d3、klk6和muc2的值首先除以它们对应的ceacam5值。对于slc35d3/ceacam5和klk6/ceacam5，比率然后被称为>0.00001或<0.00001的两组中的一组(图3)。前一组被指定值1，并且后一组被指定值0。对于muc2/ceacam5，划分是以3.0的比率实现的，具有高于3.0的值的结被指定值1，并且具有低于3.0的值的结被指定值0(图3)。对于postn，postn/18srrna比率和临床截止(8.0拷贝/18srrna单位；图2)被用于获得两组，高于临床截止时被指定值1，并且低于临床截止时被指定值0。使用式(式a：slc35d3/ceacam5+klk6/ceacam5+postn/18srrna-muc2/ceacam5)将每个患者分类为五组(式的结果：-1、0、+1、+2、+3)中的一组，并且对这些组执行根据卡普兰-迈耶的累积存活分析。结果在图4中示出。获得五条不同的曲线。组(-1)和(0)示出良好的3年和5年存活，组(+1)和(+2)示出相对差的存活和组(+3)示出非常差的存活(表5)。与组(-1)相比，根据单因素cox回归分析计算的组(0)、(+1)、(+2)和(+3)的风险比率在表6中示出。

在本发明的其他实施方案中，生物标志物mrna测量以与式a中相同的方式计算，除了在这些式(例如式b至式e)中，项中的一个被系统地排除。图5示出根据式e计算的根据卡普兰-迈耶的累积存活，表5总结了如通过5个式(式a至式e)确定的生物标志物mrna测量的3年和5年存活，并且表6总结了如通过式a、b和c确定的生物标志物mrna测量的风险比。尽管通过根据式b至式e处理的生物标志物数据产生了关于手术后存活的有用信息，但是清楚的是，根据式a处理生物标志物mrna数据是最具信息性的，证明所有这些生物标志物都对结果有贡献。

表5.如通过根据卡普兰-迈耶的累积存活确定的在手术后3年和5年死于癌症的crc患者的百分比。根据式a、b、c、d和e分组的患者之间的比较。

式a：[slc35d3/ceacam5+postn/18srrna+klk6/ceacam5-muc2/ceacam5]，给出组-1、0、+1、+2、+3

式b：[slc35d3/ceacam5+postn/18srrna-muc2/ceacam5]，给出组-1、0、+1、+2

式c：[klk6/ceacam5+postn/18srrna-muc2/ceacam5]，给出组-1、0、+1、+2

式d：[slc35d3/ceacam5+klk6/ceacam5+postn/18srrna]，给出组0、+1、+2、+3

式e：[slc35d3/ceacam5+klk6/ceacam5-muc2/ceacam5]，给出组-1、0、+1、+2。

表6.如根据单因素cox回归分析计算的手术后crc复发的风险。根据式a、b和c分组的患者之间的比较。

式a：[slc35d3/ceacam5+postn/18srrna+klk6/ceacam5-muc2/ceacam5]，给出组-1、0、+1、+2和+3

式b：[postn/18srrna+slc/ceacam5-muc2/ceacam5]，给出组-1、0、+1、+2

式c：[postn/18srrna+klk6/ceacam5-muc2/ceacam5]，给出组-1、0、+1和+2。

用于确定生物标志物mrna的试剂盒

本发明还包括用于分析生物标志物mrna和18srrna以及将原始数据转化为临床上有用的信息(如由式，式a至式e所示出的)的试剂盒。

在本发明的一个实施方案中，表1中给出的特定正向和反向引物以及探针序列被用于实时定量rt-pcr。通过使用用于逆转录的特定拷贝标准物(rna)和3'引物来实现定量，其中生物标志物mrna值针对样品中18srrna的含量和/或ceacam5mrna的含量被归一化。根据生物标志物水平，归一化的值被分配至两组中的一组，(1＝高复发风险)或(0＝低复发风险)，其中截止水平根据来自手术治疗的crc患者的淋巴结的临床材料的分析确定。使用专门设计的算法，基于式：slc35d3/ceacam5+klk6/ceacam5+postn/18srrna-muc2/ceacam5，将每种生物标志物的(1)和(0)的值转化为具有范围为-1、0、+1、+2、+3的癌症死亡相对风险的估计值，其中-1代表最低风险，并且+3代表最高风险。

在如图4和5以及表5和6中举例说明的本发明的实施方案中，优选地，只有来自具有最高生物标志物mrna的淋巴结的信息具有价值。然而，许多患者具有不止一个含有肿瘤细胞的淋巴结。根据本发明的方法也可用于这种情况，即用于n1和n2期患者之间的区分，增加预后价值。

实验方法

一般方法

生物信息学分析—对于直接杂交测定，通过使用illuminabeadstudio软件(版本3.3)分析来自微阵列基因表达分析的结果。强度数据在减去背景的情况下通过beadstudio三次样条算法进行归一化。使用beadstudio软件误差模型illuminacustom计算表达的显著差异，其中使用benjamini和hochberg错误发现率进行多次测试校正(reinera.等人.bioinformatics,第19卷，第368-375页(2003))。基因表达的差异被计算为倍数改变，将感兴趣的crc样品中的信号除以对照的平均信号。

细胞系和外周血单核细胞—利用以下建立的人类细胞系：ls174t、ht29、t84、hct8和caco2(所有结肠癌)、jurkat和molt-4(t细胞淋巴瘤)、b6和kr4(ebv转化的b细胞系)、u266(浆细胞瘤)、u937(单核细胞样细胞系)、k562(类成红血细胞(erythroblastoid)细胞系)、hl60(粒细胞细胞系)、fsu(成纤维细胞细胞系)。外周血单核细胞(pbmc)通过ficoll-isopaque梯度离心从健康成人的外周血中分离。pbmc通过与okt3单克隆抗体(50ng/ml)在补充有0.4％人类血清白蛋白的hepes缓冲的rpmi1640中孵育而被体外活化。将来自七个个体的pbmc与刺激物在平行培养物中一起孵育4、7、20、48和72小时，洗涤、合并并且提取rna。

crc患者和对照的临床特征—治疗crc的手术是在166名患者[81名男性，85名女性，中位数年龄72岁，(范围为42-90岁)]中进行的。13名肿瘤位于直肠，且153名肿瘤位于结肠。七名直肠癌患者接受25gy的术前放疗。在所有患者中进行局部根治性肿瘤切除术。肿瘤分化程度在11、145和10个肿瘤中分别为差、中等和高。对2,351个淋巴结执行常规苏木精和伊红(h&e)染色，给出中位数为13(范围1-51)个结/患者。根据tnm分类，30名患者处于i期(t1-2n0m0)，74名患者处于ii期(t3-4n0m0)，46名患者处于iii期(anytn1-2m0)，且16名患者处于iv期(anytanynm1)。三十四名患者(4名处于ii期，19名处于iii期且11名处于iv期)手术后接受化疗。中位数随访时间为75(范围33-147)个月，并且随访时没有患者丢失。

对照包括18名男性和5名女性[中位数年龄为25岁(范围10-61岁)]，他们经历溃疡性结肠炎手术(n＝18)、克罗恩氏结肠炎手术(n＝3)、直肠脱垂手术(n＝1)和结肠脂肪瘤手术(n＝1)。

从患者和在一个案例中他的父母获得知情同意书。瑞典于默奥大学的医学院研究伦理委员会(theresearchethicscommitteeofthemedicalfaculty,university,sweden)批准了该研究。

原发性和远端crc肿瘤和正常结肠组织—分析来自85个原发性crc肿瘤的一百一十三个样品的生物标志物mrna水平(22个样品来自16名i期患者，44个样品来自35名ii期患者，41个样品来自25名ii期患者，且8个样品来自8名iv期患者)。原发性肿瘤期分布(ptl-pt4)分别为2、14、55和13个。11个肿瘤分化程度差，71个肿瘤分化程度中等，且3个肿瘤分化程度高。尺寸为约0.5×0.5×0.5cm的一至四个样品在切除术后立即从原发性肿瘤样本中收集，快速冷冻，并且储存在-70℃直到rna提取。收集从近端或远端切除边缘取回的六个正常结肠样品和两个远端肝转移样品，并且以与原发性crc肿瘤相同的方式进行处理。

来自结肠组织的上皮细胞—结肠上皮细胞(ec)如描述的(fahlgrena.等人.clin.exp.immunol.,第131卷，第90-101页(2003))在切除边缘处从正常结肠粘膜中分离。

淋巴结—淋巴结从切除的样本中取回，并且用单独的无菌刀平分。每个结的一半被固定在10％缓冲福尔马林中用于常规h&e染色。另一半被快速冷冻在液氮中，并且储存在-70℃直到rna提取。从crc患者收集503个淋巴结(分别来自i-iv期患者的91、253、107和52个结)。获得中位数为2(范围1-15)个淋巴结/患者。

从对照患者收集108个淋巴结(分别来自溃疡性结肠炎、克罗恩氏结肠炎、结肠脂肪瘤和直肠脱垂患者的82、9、13和4个结)。

rna分离—通过在第一均质步骤中每25mg组织添加0.5ml含有4m硫氰酸胍、25mm柠檬酸钠(ph7.0)、0.5％十二烷基肌氨酸钠和0.1m2-巯基乙醇的溶液和多至2.5×10⁶个细胞，使用酸性胍酚氯仿法(chomczynskip和sacchin.,analyt.biochem.,第162卷，第156-159页(1987))从淋巴结、正常和肿瘤结肠组织、结肠上皮细胞、pbmc和细胞系中提取总rna。将提取的rna溶解在含有rna酶抑制剂rnasin(1u/μl；promega,madison,wi)的无rna酶的水中。在nanodropnd-1000分光光度计(nanodroptechnologies)中测量rna浓度，并且，对于珠微阵列分析，在2100bioanalyzer中使用rna纳米测定(agilenttechnologies)分析rna的完整性。

rna拷贝标准物的制备—来自原发性crc肿瘤、来自两名患有crc的患者的两个淋巴结以及结肠癌细胞系ls174t和t84的总rna被用作拷贝标准物制备的起始材料。用于rt-pcr的引物在表2中给出。包括定量rt-pcr中扩增的相应序列的pcr产物被克隆、测序并且用作用于通过t7聚合酶/核糖探针体外转录系统(t7polymerase/riboprobeinvitrotranscriptionsystems；promega)进行体外转录的模板。将3-7μg线性化的dna用于在37℃持续2-3小时进行的大规模合成反应中。然后，在37℃用1u/μg的无rna酶的dna酶(promega)处理反应产物30-40min，随后用苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)提取。用2.5体积的99.5％乙醇和0.5体积的7.5m乙酸铵在-70℃沉淀rna至少一小时。dna酶处理重复至少两次。最终，通过rt-pcr和pcr检查拷贝标准物以评估dna的含量，其被证明对于所有拷贝标准物，dna的含量低于0.2％。基于od260值、转录物分子量和阿伏伽德罗(avogadro)数计算转录物的浓度。标准物最终被稀释到10⁸拷贝/μl。

实时qrt-pcr—使用tacmanezrt-pcr技术(appliedbiosystemsfostercityca)，构建用于slc35d3、postn、klk6、ceacam5和muc2的具有rna拷贝标准物的实时qrt-pcr测定。引物和探针序列在表1中示出。rt-pcr谱为49℃持续2min，59℃持续30min，94℃持续5min，随后为93℃持续20sec和61℃持续1min的45个循环。每个分析中包括浓度从10³至10⁸拷贝/μl的相应rna拷贝标准物的系列稀释物。所有qrt-pcr分析一式三份进行。通过abiprism7900序列检测系统(perkin-elmer,wellesley,ma)监测释放的报告物染料的发射。对于mrna水平的归一化，根据制造商的方案(appliedbiosystems)，或者通过使用表1中给出的引物和探针(seqidno:16-18)和通过使用表2中给出的引物制备的拷贝标准物(seqidno:26、17)，通过实时qrt-pcr确定每个样品中18srrna的浓度。将结果表示为每单位18srrna的mrna拷贝或者每拷贝18srrna的rna拷贝，在两种情况下都产生生物标志物的直接可比较的水平。

统计分析—根据卡普兰-迈耶存活模型，结合对数秩检验和单因素cox回归分析，计算患者组之间的无疾病存活和手术后复发疾病的风险的差异。p值<0.05的存活时间和风险比的差异被认为具有统计学意义。利用的软件是spss(版本18)。