耐用的基于酶的生物传感器和液滴沉积固定方法与流程

本申请要求于2016年12月9日提交的美国临时申请号为62/432,513、名称为"通过液滴沉积固定方法提供的耐用的基于酶的生物传感器平台"的优先权，该申请的全部内容通过引用结合到本文中。

背景技术：

成功的健康护理系统以较低的成本在持续的基础上为更多的人提供更好的健康。实时即时(poc)检验可以帮助有效的疾病控制和适当的治疗干预。在这点上，正在努力开发使用唾液作为指示流体来筛选癌症患者的非侵入性方法。wong，jcalifdentassoc，2006，2006.34(4)：p.303-

8；wong，jamdentassoc，2006，137(3)：p.313-21；和castagnola等，

actaotorhinolaryngologicaitalica，2011，31(6)：p.347-357。在慢性疾病管理领域中，已经开发了生物标志物监测技术，以向患者提供测量实时健康状况的简单和快速的方式，没有疼痛、没有感染风险和没有疤痕，所有这些使得过程无应激。已经针对该目的开发的生物传感器将生物分子与电化学检测相结合，以测量包括小分子、蛋白质、激素和抗原在内的一种或多种分析物。zhangw，sensingandbiosensingresearch，2015，4：p.96-102；duy，biosensors，2016，6(1)：p.10；du，journalofdiabetesscienceandtechnology，2016，10(6)：1344-1352；zhangw，sensingandbiosensingresearch，2015，4：p.23-29；和malon等，biomedresint，vol.2014，articleid962903。然而，许多这些使用酶检测分析物的生物传感器具有短的保存期。这限制了它们作为可靠的疾病检测/监测装置的用途。

需要能够实时评估个人健康和/或诊断疾病的鲁棒装置(robust

devices)。

技术实现要素：

本技术提供了基于包含交联的生物分子(例如酶)的电化学装置的鲁棒且稳定的生物传感器。该装置的工作电极具有纳米材料传感器元件的层，该纳米材料传感器元件涂覆有含有生物分子的功能化涂层。该生物传感器是高度灵敏的，并且能够特异性检测和定量液体样品中的分析物或生物标志物。生物传感器通常具有一年或更长的储存稳定性。

本技术的一个方面是用于确定液体样品中生物标志物浓度的传感器。该传感器包括：绝缘或半导体基板；至少一个工作电极、反电极和参比电极；以及在所述基板表面上的样品放置区域，该区域用于在测定所述液体样品中的生物标志物浓度期间容纳所述液体样品。一个或多个工作电极、反电极和参比电极中的每一个包括沉积在样品放置区域中的基板上的导电金属层。工作电极在样品放置区域中涂覆有多个传感器元件。所述传感器元件用功能化涂层功能化，所述功能化涂层包含季铵化合物、多个金属纳米颗粒、催化对所述生物标志物特异性的电子转移反应的交联的酶。工作电极、反电极和参比电极连接到电流分析电路。传感器测量进入工作电极的电子转移。电流分析电路的输出电压与沉积在样品放置区域中的液体样品中的生物标志物的浓度相关。

本技术的另一方面是确定液体样品中生物标志物浓度的方法。该方法包括以下步骤：(a)提供上述传感器；(b)将液体样品引入传感器的样品放置区域；和(c)从传感器的电输出确定液体样品中的浓度。

本技术的另一方面是生物标志物分析系统，其包含上述传感器和处理来自传感器的电信号的信号调节和/或分析装置。

本技术的另一方面是生物标志物传感器阵列，其包括共享共有基板的多个如上所述的传感器。

本技术的另一方面是制造生物标志物传感器的方法。该方法包括以下步骤：(a)在绝缘基板的表面上微制造一个或多个工作电极、参比电极和反电极，其中所述电极中的每一个接触基板上的样品放置区域；(b)将多个传感器元件沉积到工作电极上；(c)将功能化涂层沉积到传感器元件上，该功能化涂层包括一个或多个功能化层；其中每个功能化层包括季铵化合物、多个金属纳米颗粒、催化对所述生物标志物特异性的电子转移反应的酶；和(d)通过将交联剂施加到功能化涂层上而将酶交联。

本技术的再一方面是包含设置在真空存储容器(例如真空凝胶盒(gelbox))中的上述传感器的试剂盒(kit)。

该技术可由以下实施方式的列表进一步概括。

1.一种用于确定液体样品中生物标志物浓度的传感器，所述传感器包括：

绝缘或半导体基底；

至少一个工作电极、反电极和参比电极，和

位于所述基板的表面上的样品放置区域，该区域用于在确定所述液体样品中的生物标志物浓度期间容纳所述液体样品；

其中一个或多个工作电极、反电极和参比电极中的每一个包括沉积在样品放置区域中的基板上的导电金属层；

其中，所述工作电极在样品放置区域中涂覆有多个传感器元件；

其中所述传感器元件用功能化涂层功能化，所述功能化涂层包含季铵化合物、多个金属纳米颗粒、催化对所述生物标志物特异性的电子转移反应的交联的酶；

其中所述工作电极、反电极和参比电极连接到电流分析电路；

其中所述传感器测量进入工作电极的电子转移；以及

其中所述电流分析电路的输出电压与沉积在样品放置区域中的液体样品中的生物标志物的浓度相关。

2.实施方式1所述的传感器，其中所述基板包括选自由硅、玻璃、纸、氧化铝、陶瓷、非导电聚合物及其任意组合组成的组中的材料。

3.实施方式1或2所述的传感器，其中所述工作电极包括选自由如下组成的组中的一种或多种材料：金、铂、石墨、碳、铱、银/氯化银、铜、铋、钛、锑、铬、镍、锡、铝、钼、铅、钽、钨、钢及其任意组合。

4.前述实施方式任一项所述的传感器，其中所述传感器元件包括选自由单壁碳纳米管(swnt)、双壁碳纳米管、多壁碳纳米管、石墨、石墨烯、碳纳米纤维、碳纳米线、碳纳米棒及其任意组合组成的组中的材料。

5.前述实施方式中任一项所述的传感器，其中所述功能化涂层不包含聚阳离子聚合物。

6.前述实施方式中任一项所述的传感器，其中所述季铵化合物包含链长为约c2至约c16的烷基链。

7.前述实施方式中任一项所述的传感器，其中所述季铵化合物是氯盐或溴盐。

8.前述实施方式中任一项所述的传感器，其中所述季铵化合物选自由以下组成的组：四乙基溴化铵、四丙基溴化铵、四丁基溴化铵、十六烷基三甲基溴化铵、苯扎氯铵、烷基链长为c12-c16的烷基二甲基苄基氯化铵和烷基链长为c8-c10的二烷基二甲基氯化铵。

9.前述实施方式任一项所述的传感器，其中所述多个金属纳米颗粒选自由以下组成的组：金纳米颗粒、铂纳米颗粒、银纳米颗粒、铜纳米颗粒、钯纳米颗粒、钌纳米颗粒、铼纳米颗粒及其任意组合。

10.前述实施方式中任一项所述的传感器，其中所述酶是使用同双官能交联剂或异双官能交联剂交联的。

11.前述实施方式中任一项所述的传感器，其中所述酶是通过选自由以下组成的组中的试剂交联的：戊二醛、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺、n-羟基琥珀酰亚胺、n-羟基磺基琥珀酰亚胺、二环己基碳二亚胺、二亚胺代己二酸二甲酯(dimethyladipimidate)、二亚胺代辛二酸二甲酯(dimethylsuberimidate)及其任意组合。

12.前述实施方式中任一项所述的传感器，还包括覆盖功能化的传感器元件的保护膜。

13.前述实施方式中任一项所述的传感器，其中所述保护膜包括nafion、聚(二烯丙基二甲基铵)氯化物、蛋壳膜、水凝胶、牛血清白蛋白、脂质双层。

14.前述实施方式中任一项所述的传感器，具有至少约9个月的保存期。

15.前述实施方式中任一项所述的传感器，具有至少约一年的保存期。

16.前述实施方式中任一项所述的传感器，其被构造为一次性装置或可重复使用的装置。

17.前述实施方式中任一项所述的传感器，其中所述酶是葡萄糖氧化酶，并且所述生物标志物是葡萄糖。

18.实施方式17所述的传感器，其能够检测低至5μm浓度的葡萄糖。

19.实施方式17或18所述的传感器，其具有30秒或更短的响应时间。

20.实施方式17-19中任一项所述的传感器，其具有至少4.8ma·s/m的灵敏度。

21.实施方式17-20中任一项所述的传感器，其被构造为用于确定唾液中的葡萄糖浓度。

22.确定液体样品中生物标志物浓度的方法，该方法包括以下步骤：

(a)提供实施方式1-21中任一项所述的传感器；

(b)将液体样品引入传感器的样品放置区域；以及

(c)从传感器的电输出确定液体样品中的浓度。

23.实施方式22所述的方法，还包括以下步骤：

(d)除去在步骤(b)中引入的液体样品；

(e)将新的液体样品引入传感器的样品放置区域；以及

(f)从传感器的电输出确定新的液体样品中新的生物标志物浓度。

24.实施方式22或23所述的方法，其中所述酶是葡萄糖氧化酶，所测量的生物标志物是葡萄糖，并且液体样品来自患有糖尿病、怀疑患有糖尿病或健康的受试者。

25.实施方式22-24中任一项所述的方法，其中所述液体样品是唾液。

26.生物标志物分析系统，包括：

实施方式1-21中任一项所述的传感器；

处理来自传感器的电信号的信号调节和/或分析装置。

27.实施方式26所述的生物标志物分析系统，还包括用于将无线电信号发送到远程接收器和/或数据处理装置的发送器装置，其中，所述无线电信号携带与所述液体样本中的生物标志物浓度相关的信息，所述信息从所述信号调节和/或分析装置获得。

28.实施方式26或27所述的生物标志物分析系统，还包括存储装置，用于累积与液体样本中的生物标志物浓度相关的数据，所述数据在不同时间获得或者从不同液体样本获得。

29.实施方式26-28中任一项所述的生物标志物分析系统，还包括用于化学或物理处理液体样品并将处理后的样品递送到所述装置的样品放置区域的装置。

30.生物标志物传感器阵列，包括共享共同基板的多个根据实施方式1-21中任一项所述的传感器。

31.制造生物标志物传感器的方法，包括步骤：

(a)在绝缘基板的表面上微制造一个或多个工作电极、参比电极和反电极，其中所述电极中的每一个接触基板上的样品放置区域；

(b)将多个传感器元件沉积到工作电极上；

(c)将功能化涂层沉积到传感器元件上，该功能化涂层包括一个或多个功能化层；其中每个功能化层包括季铵化合物、多个金属纳米颗粒、催化对所述生物标志物特异性的电子转移反应的酶；以及

(d)通过将交联剂施加到功能化涂层上来将酶交联。

32.实施方式31所述的方法，其中所述交联剂被施加到功能化涂层的顶部，或者其中所述交联剂通过将其包含在一个或多个功能化层中的一个或多个而施加。

33.实施方式31或32所述的方法，其中所述一个或多个功能化层是通过包含季铵化合物、金属纳米颗粒和酶的溶液或悬浮液的液滴沉积来沉积亚层而沉积的。

34.实施方式31或32所述的方法，其中所述一个或多个功能化层是通过包含季铵化合物、金属纳米颗粒和酶的单一悬浮液的液滴沉积而沉积的。

35.实施方式31-34中任一项所述的方法，其中所述单一悬浮液还包含同双官能交联剂或异双官能交联剂。

36.实施方式31-35中任一项所述的方法，其中所述酶是通过选自由以下组成的组中的试剂交联的：戊二醛、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺、n-羟基琥珀酰亚胺、n-羟基磺基琥珀酰亚胺、二环己基碳二亚胺、二亚胺代己二酸二甲酯、二亚胺代辛二酸二甲酯及其任意组合。

37.实施方式31-36中任一项所述的方法，还包括在所述功能化层上沉积传感器元件保护膜。

38.实施方式31-37中任一项所述的方法，其中通过自组装工艺将传感器元件沉积在工作电极上，所述自组装工艺包括将传感器元件的液体悬浮液沉积在电极上。

39.试剂盒，其包括在真空储存容器中的实施方式1-21中任一项所述的传感器或实施方式26-29中任一项所述的生物标志物分析系统或实施方式30所述的生物标志物传感器阵列。

附图说明

图1描述了根据本技术的示例性的基于酶的生物传感器的制造。制造过程包括在工作电极上沉积传感器元件(即，多个纳米元件，例如单壁碳纳米管(swnt))的层，随后是包含对传感器元件和电极的功能化必要的成分的悬浮液的沉积的重复循环。生物传感器通过生物连接剂和交联剂稳定。

图2a是功能化电极的实施方式的示意图，示出了涂覆有传感器元件层20的电极10和沉积在所述传感器元件层上的多个功能化层30。图2b示出了功能化电极的另一个实施方式，该电极具有沉积在传感器元件20上的单个功能化层30。

图3显示了在一年的时间内测量的基于酶的生物传感器的活性。将传感器包装在真空凝胶盒中并在4℃下储存。误差线：±标准偏差；n＝2。

图4描述了使用基于酶的生物传感器检测唾液中的生物标志物，所述生物传感器已经在真空凝胶盒中4℃下储存42天。通过使用生物连接剂和交联剂稳定生物传感器。误差线：±标准偏差和n＝3。

具体实施方式

本文所述技术涉及使用基于生物分子的生物传感器检测生物标志物，该生物传感器与先前生物传感器相比具有延长的保存期。在优选的实施方式中，生物传感器依赖于酶的使用，该酶催化对待检测的生物标志物特异性的电子转移反应。在其它实施方式中，使用除酶以外的生物分子(例如非酶蛋白质、抗体、适体、脂质、核苷酸、细菌及其任意组合)检测生物标志物。

以前的基于酶的生物传感器(例如使用葡萄糖氧化酶的那些)通常缺点是保存期短，常常小于一个月，或仅持续几天，这主要是因为在它们的设计中使用的酶是不稳定的。这限制了基于酶的生物传感器的临床使用。参见gibson,t.d.biosensors：thestabilityproblem，analusis，1999，27(7)：p.630-638。根据本技术制造的生物传感器克服了这个缺点。该技术需要(i)将酶(或其它生物分子)交联以提高稳定性，和(ii)使用季铵化合物以提高保存期和提高灵敏度。

如本文所用，"保存期"是指一段时间，在该段时间内通常损失小于50％，例如小于30％、小于20％、小于10％、小于5％、小于2％或小于1％的初始活性，例如灵敏度(分析物检测的下限)、响应性(即，对于给定的分析物浓度的电压输出)或信噪比。可以测量保存期并将其指定为贮存条件的函数，例如在室温、冰箱温度(约4℃)、冷冻温度、真空下或在环境条件(室温和大气压)下。通常，保存期指定在室温和真空下。

本文所述的生物传感器可以包括例如在基板或芯片上的三电极或四电极电化学电池(cell)。优选地，每个生物传感器包含三个电极：工作电极、反电极和参比电极。酶附着于沉积在工作电极上的组分上。当包含目标分析物(例如葡萄糖)的样品液体滴落到传感器上时，其接触所有三个电极。使用电流测定法测量存在的分析物的量。电极的几何形状和相对面积优选地被优化以产生对于用于测试的样品体积的最佳结果。样品体积可以在几纳升到几毫升或更多的范围内。

为了构造生物传感器，工作电极涂覆有纳米材料的层，所述纳米材料例如单壁碳纳米管(swnt)或其它纳米元件，其通常是导电的或半导电的。合适的方法描述于wo2014/110,492中，其通过引用整体结合到本文中。纳米元件的层在本文中被称为"传感器元件"，因为这些纳米元件为装置的生物分子传感器提供导电的、高表面积的接触。接着，在传感器元件上形成功能化涂层。一个或多个功能化层可以通过逐层组装工艺或通过包含功能化涂层的所有所需组分的单层的液滴沉积来添加。功能化层的组分包括"生物连接剂(bio-linker)"，例如季铵化合物、金属纳米颗粒和酶(或其它生物分子)，其优选吸附到金属纳米颗粒上。在加入酶之后，将交联剂加入到每层中，或仅加入到涂层的最上层或顶面中，并将酶交联在功能化涂层内。如果交联剂作为最后的亚层加入，它可以渗透穿过下面的层并引起这些层中酶(或其它生物分子)的交联。见图1。

优选地，在本技术中，避免使用聚烯丙胺(paa)、壳聚糖和其它阳离子聚合物作为电极涂层或在功能化涂层内。

用于多层薄膜组装的生物连接剂优选是季铵化合物。一般而言，已知这些化合物用作抗微生物剂(jennya.l，macromolecules，2009，42(22)：p.8573-8586；lichter等，macromolecules，2009，42:p.8573-86)、纳米颗粒稳定剂(petkova等，nanoscaleresearchletters，2012，7(1)：287)、nafion改性剂(moore等，biomacromolecules，2004，5(4)：p.1241-1247；meredith等，jove-journalofvisualizedexperiments，2012(65))，或阳离子表面活性剂(zhou等，journalofmaterialschemistry，2004，14(14)：p.2311-2316)。在本文所述的生物传感器中，它们导致延长的保存期和改进的灵敏度。

本技术需要将酶(或其它生物分子)交联，生物传感器发挥作用依赖于酶(或其它生物分子)的活性。蛋白质交联已经用于许多目的，包括研究蛋白质结构和功能、将蛋白质锚定到固体支持物、制备免疫原、免疫毒素和其它结合的蛋白质试剂，以及用于稳定蛋白质三级和四级结构。在本技术中，交联用于稳定蛋白质的结构，使得生物传感器具有延长的保存期。已知有几种将蛋白质交联的方法(参见double-doproteincross-linkers，handbook&selectionguide，archived，12/7/2017；和thermoscientificcrosslinkingtechnicalhandbook，archived，12/7/2017)。在交联剂的目标官能团中，有伯胺、羧基、巯基、糖类和羧酸。蛋白质分子具有许多这些官能团，因此可以使用交联剂容易地结合。必须小心以优化交联度。太少，传感器的保存期可能被缩短；过多，酶或其它生物分子可能被变性并丧失其活性和/或特异性。

交联剂基于其反应性基团的数量和相似性可以分成两组：具有两个相同反应性末端的同双官能交联剂，和具有两个不同反应性部分的异双官能交联剂。在一步反应中使用同官能交联剂，而异双官能交联剂需要两个相继反应。前者提供了使用的便利性，后者对交联过程有更好的控制。优选的交联剂是戊二醛(见图1)或戊二醛聚合物，其是同双官能交联剂。1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、二环己基碳二亚胺、二亚胺代己二酸二甲酯和二亚胺代辛二酸二甲酯是可以使用的其它试剂的实例。

酶交联与本技术的滴涂沉积过程相结合使得基于酶的生物传感器的稳定性显著提高。不受任何理论或作用机制的限制，认为稳定化涉及通过离子交换的快速蛋白质吸附，随后是戊二醛上的醛基(-cho)基团和酶上的氨基(-nh2)基团之间的化学相互作用(zucca和sanjust，methodsandmechanisms.molecules,2014,19(9)：p.14139-14194和ismail,ia和wu,w.h.1992，us5116729a)。戊二醛因为其小尺寸作为交联剂是有利的(约1nm³；castagnola等，actaotorhinolaryngologicaitalica，2011,31(6):p.347-357)，这使得其渗透到酶分子的内部。交联通过使蛋白质主链和聚合物链之间能够共价、离子和超分子相互作用而有助于蛋白质稳定。它提供了一种简单而快速的方法来稳定所吸附的生物反应性酶，同时防止它们再折叠。

图1显示了制备多层膜以涂覆工作电极的逐层组装方法的实例。在该实施例中，每层包括如下亚层：季铵化合物生物连接剂、金属纳米颗粒和其表面上吸附有交联的酶的金属纳米颗粒。交联用戊二醛进行。对于涂有作为传感器元件的swnt的电极，swnt上的负电荷通过静电吸引与季铵化合物相互作用。金属纳米颗粒(np)被认为通过范德华力或其它非共价相互作用与季铵(qa)化合物和所选的生物分子(例如酶)缔合。qa-np-酶单元层可重复数次以形成多层涂层。可以调整层数以实现最佳的感测性能。例如，qa-np-酶单元可以用作单层，或可以重复以形成2-10层，或2-5层，或3-5层，或3-6层，或4-6层，或4-7层，或5-8层。

多个相同或不相同的传感器可以被包括在单个芯片上，从而可以以多路传输格式(multiplexformat)或以允许内部确证(internalcorroboration)的格式执行测量。

传感器元件纳米材料可以是金属纳米材料和半导体纳米材料的混合物，或者可以是均质的金属或半导体。该纳米材料提供了极大的表面-体积比，并具有有用的电性能。根据本技术的传感器通过电化学机制操作，由此特定分析物/生物标志物的存在导致电子转移到工作电极，并且可以通过测量流过传感器的所得电流来识别和量化。使用电流分析法，可以将电流改变为输出电压。该特征使得传感器比在分析物存在下产生swnt电阻变化的其它类型的传感器更精确和可靠。认为通过使用能催化电子转移反应的除酶以外的生物分子，可选择检测条件(如施加的电压)使得发生向工作电极的或从工作电极的电子转移，其然后可通过与工作电极连接的电流分析电路检测。

例如但不作为限制，电极材料可以包含如下材料或由如下材料组成：金、铂、铱、银、银/氯化银、铜、铝、铬或其它导电金属或其它导电材料。用于生物传感器的酶可以是天然存在的或重组产生的。此外，它们可以具有天然存在的或突变的或工程化的氨基酸序列。为了检测葡萄糖，可以使用催化葡萄糖特异性电子转移反应的葡萄糖氧化酶作为所述酶。葡萄糖氧化酶可以从天然来源分离，例如黑曲霉(aspergillusniger)的细胞，或者在转化或转染的宿主细胞(例如细菌细胞、酵母或真菌细胞，或哺乳动物细胞)中重组产生。在使用葡萄糖氧化酶检测葡萄糖时，所涉及的反应是氧化反应。传感器通过跟踪进入工作电极的电子并测量所得电流来检测样品液体中的生物标志物的水平，所述电流由电流分析检测电路检测并表示为输出电压的变化。电子或反应产物到达电极的途径可以是通过多种机制，包括扩散、从酶的直接电子转移或各种机制的组合。

通过用各种材料(包括生物分子或多孔薄膜(film)或膜(membrane))改性涂覆的电极，可以进一步改进感测性能。

根据本技术的生物传感器可以是传感器系统的一部分，该传感器系统另外包括处理来自传感器的电信号的信号调节和/或分析装置。传感器系统可以使用处理过的或未处理的体液作为样品。样品流体的处理例如可以通过使其经过涂覆传感器表面的半透膜来实现。或者，为了便于使用，传感器系统可允许传感器元件与体液(例如口中的唾液)直接接触。在一个实施方式中，传感器系统包括内置过滤机构，其可以是例如基于微流体的系统。在某些实施方式中，传感器系统用作包括信号调节器和微控制器的葡萄糖计。该系统可以执行一系列电流测量，并显示来自每次测量的葡萄糖浓度作为输出信号或值，例如使用数字显示器、图形显示器、刻度盘指示器或指示所选范围或条件的基于颜色的显示器。可选地，传感器系统可以计算和显示与测量的唾液葡萄糖水平对应的估计的等效血糖水平。

上述系统可以在单个芯片上实现，在该芯片上施加一滴样品液体。芯片或传感器可以设计成单次使用(即一次性的)或重复使用，在读数之间进行样品的冲洗或简单置换。它可以用于在家和昼夜对个体进行疾病相关生物标志物(例如葡萄糖)的实时、非侵入性监测。通过连续或周期性监测，可以获得额外的时间信息，例如生物标志物水平的趋势、幅度、持续时间和频率，这允许跟踪数据以更好和更准确地评估个体的疾病以及总体健康状况。例如，在葡萄糖监测的情况下，传感器系统可以激活异常或极端葡萄糖水平的警报，从而在试图维持严格的血糖控制时减少护理工作量。同样关于葡萄糖监测，这种系统可以促进在胰岛素输送系统(例如人工胰腺或胰岛素泵)中的自动反馈控制的胰岛素输送。

在根据本技术制备的生物传感器的一个实施方案中，使用四丁基溴化铵作为生物连接剂，并且戊二醛交联的葡萄糖氧化酶作为用于检测葡萄糖的酶。观察到生物传感器在5-500μm范围内是高度精确的，具有4.82ma·s/m的良好灵敏度，5μm的低检测极限，和30秒的响应时间。见图4。生物传感器显示出超过一年的保存期。见图3。这种耐用的生物传感器适用于poc应用以及家庭使用。

如本文所用，"基本上由…组成"允许包括不会实质上影响所要求的基本和新颖特征的材料或步骤。本文中任何对术语"包括"的叙述，特别是在对组合物的组分的描述中或在对装置的元件的描述中，可以与"基本上由…组成"或"由…组成"互换。