本发明属于检测
技术领域：
，涉及镉离子核酸适配体及相关的丝网印刷电极电化学生物传感器。
背景技术：
：镉(cd,cadmium)是人体非必须的重金属元素，是一种高剧毒高危害环境污染物，具有不易代谢、强富集的特点。国际癌症研究机构(iarc)把镉列入为人类致癌物。镉作为一种工业生产中常用催化剂，含镉的废水、废气、废渣的任意排放是环境中重金属镉污染的重要原因，食品中镉的污染主要来源是农作物根系从土壤中吸收并富集镉，另一方面是镉在贝类等水产品中富集再经过食品链的传递导致人类中毒。近年来，我国频繁发生镉中毒事件，镉中毒分为急性中毒和慢性中毒，急性中毒危害表现为：恶心、呕吐、腹泻等与食物中毒相似，致死剂量为口服300mg以上；慢性中毒是被人体吸收和富集，集中表现为疲惫、贫血，骨骼异常、肾损伤等症状，还会致癌致畸。目前食品中重金属的污染主要来源包括环境污染和食品加工等过程，而现存的重金属镉的传统的检测方法主要有紫外分光光度法，原子荧光光谱法，石墨炉原子吸收法，电感耦合等离子体光谱法等，传统检测方法虽然能够对痕量重金属元素进行准确检测，但是设备昂贵，需要人员经过培训后才能操作，操作耗时，检测费用较高，无法现场、在线对食品进行实时监测，而电化学方法费用低、价格便宜、操作简单、灵敏度高、易于微型化，可现场、在线检测对重金属是未来发展的趋势。技术实现要素：针对现有对镉离子检测技术的不足，本发明的目的在于提供一种镉离子核酸适配体，该适配体具有亲和力高、特异性强、稳定性好、易于修饰、价格低廉、靶标范围广、对环境要求不高等特点。本发明所述的镉离子核酸适配体的特征在于，所述适配体的序列长度为22-28个碱基，且含有核酸序列gtgatgacctgc。优选地，所述适配体的序列如seqidno:1-10所示。根据本发明所述的镉离子核酸适配体的进一步特征，所述的适配体在其5’端修饰巯基即5’-sh-(ch2)6-。本发明的第二个目的是提供一种丝网印刷电极电化学生物传感器，该电化学生物传感器灵敏度更高，有良好稳定性和重现性，能用于检测重金属镉离子。本发明所述的丝网印刷电极电化学生物传感器含有本发明所述的镉离子核酸适配体。本发明的第三个目的是提供所述核酸适配体电化学生物传感器的制备方法。本发明所述的丝网印刷电极电化学生物传感器的制备方法，包括以下步骤：a.丝网印刷电极预处理：丝网印刷电极浸入0.5m浓硫酸中用循环伏安法扫描至稳定(清洗和活化电极表面)，丝网印刷电极以金为工作电极和辅助电极，银为参比电极；设置参数：扫描范围：-0.3v-1.3v，扫描速度0.1v/s；b.预处理后电极的适配体修饰：合成权利要求1所述的镉离子核酸适配体，加入1mol/lnacl配制成含5μmol/l的适配体组装液，滴加适配体组装液到步骤a预处理后的丝网印刷电极工作电极表面，密封4℃下组装20小时，得到所述的丝网印刷电极电化学生物传感器。本发明的第四个目的是提供所述的丝网印刷电极电化学生物传感器在检测镉离子方面的应用。本发明的第五个目的是提供一种基于丝网印刷电极电化学生物传感器的检测镉离子的方法。本发明所述的基于丝网印刷电极电化学生物传感器的检测镉离子的方法包括以下步骤：a.采用如权利要求3所述的丝网印刷电极电化学生物传感器对镉离子标准溶液进行检测，建立标准曲线；b.样品中加入镉离子标准液配制成不同浓度的溶液，进行dpv分析，通过建立标准曲线计算出对应的镉离子的浓度，即为实际样品镉离子的浓度。根据权利要求6所述的方法的进一步特征，所述步骤a包括以下步骤：将所述的是适配体电化学生物传感器用超纯水冲洗，去除未结合的适配体，然后把丝网印刷金电极置于浓5mmol/l的k3[fe(cn)6]，含0.1mol/lkcl的电解液中进行差分脉冲伏安法分析，记录核酸适配体传感器的dpv图及峰电流值ipo,电化学参数：工作电位300mv-700mv，扫速为100mv/s；将所述适配体电化学生物传感器依次置于浓度为：0.1、0.5、1、5、10、50、100ng/ml的镉离子标准溶液中，在25℃下反应30min，反应后用超纯水浸泡5min去除非特异性吸附的镉离子：在5mmol/l的k3[fe(cn)6]，含0.1mol/lkcl的电解液中进行差分脉冲伏安伏安法dpv扫描。电化学参数：工作电位300mv-700mv，扫速为100mv/s；记录镉离子各个浓度下对应的dpv图及其峰电流值ipn，其中n＝1,2...7，计算各标准品相对初始的适配体传感器的峰电流变化值△ip，并以各镉离子标准液浓度的对数为横坐标，相对应的△ip为纵坐标作图，建立标准曲线。本发明所述的适配体电化学生物传感器是以本发明所述的适配体为识别元件来检测镉离子的，其原理是：当镉离子存在的情况下，本发明所述的适配体与镉离子特异性发生特异性结合，引起所述适配体空间构象发生变化，导致电解液中铁氰化钾与电极界面之间的电子转移速率发生变化。通过建立镉离子浓度的对数与△ip之间的线性关系，就可以达到检测镉离子的作用。本发明的有益效果是：本发明基于适配体与镉离子的特异性识别作用，采用dpv为电化学检测技术，建立了一种电化学适配体生物传感器检测镉离子的方法，为镉离子的检测提供了一种新的方法和途径。与目前的个例子检测方法相比较，本发明具有如下优点：(1)该传感器的制备是基于适配体与镉离子的特异性识别作用所构建的，相比蛋白质而言，适配体具有亲和力高，特异性强，稳定性好，易于修饰，价格低廉，靶标范围广，对环境要求不高等特点。(2)采用丝网印刷金电极为工作电极，利用au与sh能以共价键相连au-sh键的作用实现了对适配体的一步修饰，大大简化了适配体的修饰过程。(3)适配体电化学生物传感器制备所需实际用量极少，丝网印刷电极可直接连接便携式电化学检测仪器，携带方便，与传统的检测方法相比，本方法具有特异性强，简便灵活，分析速度快，检测成本低，可实现现场快速检测等优点。附图说明图1是本发明所述的丝网印刷电极电化学生物传感器在不同浓度的镉离子标准溶液中检测的dpv图谱。图2是本发明所述的丝网印刷电极电化学生物传感器在不同浓度的镉离子标准溶液中检测的信号变化趋势图。图3是镉离子标准溶液检测得到的标准曲线图。具体实施方式实施例一：本发明所述的丝网印刷电极电化学生物传感器的构建(一)试剂与仪器硝酸镉四水化合物(cd(no3)2·4h2o)购买于sigma，纯度99％，文中所述的镉离子核酸适配体由上海生物工程有限公司合成。na2hpo4·12h2o、nah2po4·2h2o、nacl、kcl、k4[fe(cn)6]·3h2o、k3[fe(cn)6]、浓硫酸、硝酸均为分析纯，购于广州化学试剂厂。实验用水为超纯水(电阻率：18.2mω/cm)。chi660c电化学工作站(上海辰华仪器有限公司)，丝网印刷金电极(dropsens)以金为工作电极(直径4mm)、和辅助电极，银为参比电极。镉离子核酸适配体序列为：ctttgtgcagtgatgacctgctgccg。该核酸适配体为26个碱基长度的单链dna探针。在dna核酸单链的5’开始端进行巯基-sh-(ch2)6-修饰即：-5’-sh-(ch2)6-ctttgtgcagtgatgacctgctgccg。镉离子核酸适配体组装液的配制：含5μmol/l适配体组装液的5’端修饰了氨基即：-5’-sh-(ch2)6-ctttgtgcagtgatgacctgctgccg的单链dna适配体溶液，用1mol/l的nacl溶液溶解配制。(二)适配体电化学生物传感器的构建1.丝网印刷电极预处理丝网印刷电极预处理：丝网印刷电极浸入0.5m浓硫酸中用循环伏安法扫描至稳定，丝网印刷电极以金为工作电极和辅助电极，银为参比电极。设置参数：扫描范围：-0.3v-1.3v，扫描速度0.1v/s；2.电极修饰处理后的电极用超纯水冲洗，浸入到5μmol/l的适配体组装液中，4℃下密封组装20h，得到所述的适配体电化学生物传感器。镉离子核酸适配体序列从5’端到3’端的核酸序列如：(seqidno.1)，5’端修饰了巯基即-5’-sh-(ch2)6-ctttgtgcagtgatgacctgctgccg。浓度100μmol/l的镉离子核酸适配体溶液是5’端修饰了巯基即-5’-sh-(ch2)6-ctttgtgcagtgatgacctgctgccg适配体探针溶液。实施例二：适配体传感器对镉离子标准品的检测及其标准曲线的绘制将所述的适配体丝网印刷电化学生物传感器用超纯水冲洗，去除未结合的适配体，丝网印刷电极以金为工作电极和辅助电极，银为参比电极。，在5mmol/l的k3[fe(cn)]6，含5mmol/lk3[fe(cn)]6的电解液中进行差分脉冲伏安分析，记录适配体传感器的dpv图及其峰电流值ipo。电化学参数为：工作电位300mv-700mv，扫速为100mv/s，静息时间为2s；将所述适配体电化学生物传感器依次与浓度为0.1、0.5、1、5、10、50、100ng/ml共7个镉离子标准液孵育，25℃下反应30min,反应后用超纯水浸泡5min去除非特异性吸附的镉离子，在5mmol/l的k3[fe(cn)]6，含5mmol/lk3[fe(cn)]6的电解液中进行微分脉冲伏安分析，电化学参数：工作电位300mv-700mv，扫速为100mv/s，静息时间为2s；。记录不同镉离子浓度下所对应的dpv图谱以及峰电流值ipn(n＝1,2...7)，计算各标准品相对初始的适配体传感器的峰电流变化值△ipo以各镉离子标准液浓度的对数为横坐标，以与其对应的△ip为纵坐标作图，建立标准曲线，如图1和图2所示，随着镉离子浓度不断增加，响应的峰电流值ip逐渐增大，在0.1ng/ml-100ng/ml浓度范围内，△ip随镉离子浓度的增大而增大，△ip与镉离子浓度的对数呈现良好的线性关系(r2＝0.9776)，-△ip＝13.533lgc(ng/ml)+24.276，检测限为0.1ng/ml(s/n＝3)(s/n＝3)。实施例三：实际样品检测将本发明所述的适配体传感器用于实际样品测定及回收率检测，本实施例中选用怡宝纯净水作为样品进行加标回收检测，分别加入含1ng/ml,5ng/ml,10ng/ml,50ng/ml镉离子标准品进行dpv分析，通过实施例二建立的标准曲线，计算出对应的个例子的浓度即为怡宝纯净水中镉离子的样品浓度。测定结果如表1所示，电化学法所测得样品回收率在85.3％-107.5％之间，平均样品回收率为97.9％。表1：样品中镉离子含量的测定结果样品编号添加量(ng/ml)检出量(ng/ml)回收率(％)rsd(％)111.075107.55.11254.67593.54.753108.53285.311.2045052.650105.33.65实施例四:基于不同的适配体构建的电化学生物传感器在上述实施例1到3中，通过实验验证了基于序列为seqidno.1的镉离子核酸适配体构建的电化学检出实际样品的效果。进一步实验中，在seqidno.1z中，核心序列为gtgatgacctgc，而其他碱基可以自由搭配，符合长度22-28碱基即可，表2是实验中设计的一系列适配体及其实验结果：表2：镉离子核酸适配体上表中，seqidno.2至10是专门设计的极端序列，在序列gtgatgacctgc的两端加上a、g、c、t碱基中任意连续碱基，通过实验表现这些序列的检测灵敏度与随机设计的seqidno.1的相当，证明以序列gtgatgacctgc是关键序列，其他碱基可以任意搭配成镉离子核酸适配体，序列长度符合22-28个碱基即可。序列表<110>暨南大学<120>镉离子核酸适配体及丝网印刷电极电化学生物传感器<160>10<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>26<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1ctttgtgcagtgatgacctgctgccg26<210>2<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2ctgtggagtgatgacctgcttgc23<210>3<211>25<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3atgcttgcgtgatgacctgcatgca25<210>4<211>28<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4ttgtaccgttcgtgatgacctgccgacg28<210>5<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5gttcgtactgtgatgacctgccg23<210>6<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6aattcccgtgatgacctgcggc22<210>7<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7ggcttacggtgatgacctgctgc23<210>8<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8tcgatcgtgatgacctgctttact24<210>9<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>9ttatgtgatgacctgcttcgat22<210>10<211>25<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>10agtcgtcagtgatgacctgcaatgc25当前第1页12