本发明涉及一种胶体金试纸，特别是，涉及一种用于检测唾液中梅毒螺旋体抗体的胶体金试纸及其制备方法和使用方法。
背景技术：
检测血液中的梅毒螺旋体抗体一直被认为是诊断梅毒的前提。传统的血液检测法检测周期较长，而且还存在交叉感染的危险。近来研究表明，除血液标本外，梅毒感染者的尿液、唾液、精液、阴道分泌物中均可检测到抗梅毒螺旋体抗体。唾液和血液同作为人体体液的一部分，成分大多相似。临床检测中目标物质在唾液和血液中的出现较为一致，仅浓度存在差异，这些发现为梅毒检测提供了一个全新的发展方向。
技术实现要素：
为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种高灵敏度的用于检测唾液中梅毒螺旋体抗体的胶体金试纸，操作便捷，安全无创伤，不需要特殊设备及专业培训，适于与现场筛查。
为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
一种用于检测唾液中梅毒螺旋体抗体的胶体金试纸，包括样片垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和背板，所述样片垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次粘附在背板上，所述金标垫上包被有TP重组抗原I-质控组分-胶体金标记物，所述硝酸纤维素膜上分别包被有链霉亲和素-生物素-TP重组抗原II构成的检测线和质控线。
优选的，所述TP重组抗原I为TP重组抗原MD07，所述质控组分为鼠IgG，所述TP重组抗原II为TP重组抗原MD06，所述质控线由羊抗鼠IgG构成。
本发明还涉及一种用于检测唾液中梅毒螺旋体抗体的胶体金试纸的制备方法，包括：
S101.胶体金的制备：用氯金酸溶液和柠檬酸三钠溶液制备小颗粒胶体金溶液，再加入氯金酸溶液和巯基丁二酸溶液制备含羧基的大颗粒胶体金溶液；
S102.TP重组抗原标记：将重组抗原MD07加入大颗粒胶体金溶液中，制备TP重组抗原MD07-胶体金标记物；
S103.鼠IgG标记：将鼠IgG加入小颗粒胶体金溶液中，制备鼠IgG-胶体金标记物；
S104.金标垫的制备：将TP重组抗原MD07-胶体金标记物和鼠IgG-胶体金标记物混合后浸泡玻璃纤维，制得金标垫；
S105.TP重组抗原包被：在硝酸纤维素膜上分别包被链霉亲和素-生物素-TP重组抗原MD06构成的检测线和羊抗鼠IgG构成的质控线；
S106.试纸的制备：将样片垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次粘附在背板上，即得。
进一步的，所述步骤S101具体为：在圆底烧瓶中加热1L超纯水至沸腾，向沸水中加入氯金酸溶液，然后快速加入柠檬酸三钠溶液，搅拌混匀，保持溶液沸腾，直到液体呈酒红色停止加热，冷却至室温后补足1L，得到小颗粒胶体金溶液；取0.5L小颗粒胶体金溶液于三角瓶中，搅拌的同时缓慢加入氯金酸溶液和巯基丁二酸溶液，在滴加过程中溶液颜色逐渐变成深红色，待颜色不再变化停止搅拌，制得含羧基的大颗粒胶体金溶液。
进一步的，所述步骤S102具体为：取含羧基的大颗粒胶体金溶液，采用碳二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺活化羧基后，离心去除上清液；加入TP重组抗原MD07使得溶液中TP重组抗原MD07浓度为0.05mg/ml，搅拌并加入BSA溶液进行封闭后，离心弃去上清液，沉淀用缓冲液悬浮，保存备用。
进一步的，所述步骤S103具体为：取小颗粒胶体金溶液，采用碳酸钾调节pH后，缓慢加入鼠IgG，使溶液中鼠IgG的浓度为0.01mg/ml，搅拌并加入BSA溶液进行封闭后，离心弃去上清液，沉淀用缓冲液悬浮，保存备用。
进一步的，所述步骤S104具体为：将TP重组抗原MD07-胶体金标记物和鼠IgG-胶体金标记物按照体积比1∶1混合后浸泡玻璃纤维，将浸泡后的玻璃纤维干燥后即得金标垫。
进一步的，所述步骤S105具体为：向TP重组抗原MD06溶液中加入碳酸钾溶液调整pH至8.6，将生物素-N-琥珀酰亚胺基酯溶于DMF后加入重组抗原MD06溶液中，摇匀反应后，用PBS溶液透析得到生物素-TP重组抗原MD06包被液，向包被液中加入链霉亲和素至溶液中TP重组抗原MD06浓度为1mg/ml，将链霉亲和素-生物素-TP重组抗原MD06固定于硝酸纤维素膜构成检测线；取pH7.4的PBS溶液稀释羊抗鼠IgG至溶液中羊抗鼠IgG浓度为1mg/ml，将羊抗鼠IgG固定在硝酸纤维素膜构成质控线。
进一步的，所述步骤S106中，所述样片垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫纸件分别有2mm重叠。
本发明还涉及一种用于检测梅毒的胶体金试纸的使用方法，包括：将样品垫擦拭上下牙龈多次后含于口腔内舌下，放置1-5min，至肉眼可见唾液样本移动至硝酸纤维素膜处，即可取出开始检测。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
1、本发明使用时安全无创伤，操作人仅需将样品垫擦拭上下牙龈部位，对口腔黏膜刺激非常小，几乎不会造成口腔黏膜损伤，减少检测人员职业暴露的几率与风险；
2、本发明检测方便快速，唾液样本通过样品垫收集富集，直接将样本输送至硝酸纤维素膜，方便快速检测唾液中梅毒螺旋体抗体；
3、本发明检测高效准确，口腔渗出的唾液量可以满足检测需要，且在金标垫和硝酸纤维素膜上分别包埋了梅毒螺旋体重组抗原，提高了检测的有效率，保证了灵敏度和特异性。
附图说明
图1为本发明中用于检测梅毒的胶体金试纸的结构示意图；
其中，1为样片垫、2为金标垫、3为硝酸纤维素膜、31为检测线、32为质控线、4为吸水垫、5为背板。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明。
如图1所示，本发明涉及一种用于检测唾液中梅毒螺旋体抗体的胶体金试纸，包括样片垫1、金标垫2、硝酸纤维素膜3、吸水垫4和背板5，样片垫1、金标垫2、硝酸纤维素膜3和吸水垫4依次粘附在背板5上，金标垫2上包被有TP重组抗原MD07-鼠IgG-胶体金标记物，硝酸纤维素膜3上分别包被有链霉亲和素-生物素-TP重组抗原MD06构成的检测线31和羊抗鼠IgG构成的质控线32。具体的，背板5由PVC板材制得。
本发明还涉及一种用于检测唾液中梅毒螺旋体抗体的胶体金试纸的制备方法，包括：
S101.胶体金的制备：用氯金酸溶液和柠檬酸三钠溶液制备小颗粒胶体金溶液，再加入氯金酸溶液和巯基丁二酸溶液制备含羧基的大颗粒胶体金溶液；
S102.TP重组抗原标记：将重组抗原MD07加入大颗粒胶体金溶液中，制备TP重组抗原MD07-胶体金标记物；
S103.鼠IgG标记：将鼠IgG加入小颗粒胶体金溶液中，制备鼠IgG-胶体金标记物；
S104.金标垫的制备：将TP重组抗原MD07-胶体金标记物和鼠IgG-胶体金标记物混合后浸泡玻璃纤维，制得金标垫；
S105.TP重组抗原包被：在硝酸纤维素膜上分别包被链霉亲和素-生物素-TP重组抗原MD06构成的检测线和羊抗鼠IgG构成的质控线；
S106.试纸的制备：将样片垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次粘附在背板上，即得。
进一步的，所述步骤S101具体为：在圆底烧瓶中加热1L超纯水至沸腾，向沸水中加入氯金酸溶液，然后快速加入柠檬酸三钠溶液，搅拌混匀，保持溶液沸腾，直到液体呈酒红色停止加热，冷却至室温后补足1L，得到小颗粒胶体金溶液；取0.5L小颗粒胶体金溶液于三角瓶中，搅拌的同时缓慢加入氯金酸溶液和巯基丁二酸溶液，在滴加过程中溶液颜色逐渐变成深红色，待颜色不再变化停止搅拌，制得含羧基的大颗粒胶体金溶液。所述步骤S102具体为：取含羧基的大颗粒胶体金溶液，采用碳二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺活化羧基后，离心去除上清液；加入TP重组抗原MD07使得溶液中TP重组抗原MD07浓度为0.05mg/ml，搅拌并加入BSA溶液进行封闭后，离心弃去上清液，沉淀用缓冲液悬浮，保存备用。所述步骤S103具体为：取小颗粒胶体金溶液，采用碳酸钾调节pH后，缓慢加入鼠IgG，使溶液中鼠IgG的浓度为0.01mg/ml，搅拌并加入BSA溶液进行封闭后，离心弃去上清液，沉淀用缓冲液悬浮，保存备用。所述步骤S104具体为：将TP重组抗原MD07-胶体金标记物和鼠IgG-胶体金标记物按照体积比1∶1混合后浸泡玻璃纤维，将浸泡后的玻璃纤维干燥后即得金标垫。所述步骤S105具体为：向TP重组抗原MD06溶液中加入碳酸钾溶液调整pH至8.6，将生物素-N-琥珀酰亚胺基酯溶于DMF后加入重组抗原MD06溶液中，摇匀反应后，用PBS溶液透析得到生物素-TP重组抗原MD06包被液，向包被液中加入链霉亲和素至溶液中TP重组抗原MD06浓度为1mg/ml，将链霉亲和素-生物素-TP重组抗原MD06固定于硝酸纤维素膜构成检测线；取pH7.4的PBS溶液稀释羊抗鼠IgG至溶液中羊抗鼠IgG浓度为1mg/ml，将羊抗鼠IgG固定在硝酸纤维素膜构成质控线。所述步骤S106中，所述样片垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫纸件分别有2mm重叠。
实施例1
制备用于检测唾液中梅毒螺旋体抗体的胶体金试纸
S101.胶体金的制备：在圆底烧瓶中加热1L超纯水至沸腾，向沸水中加入1ml 10％氯金酸溶液，快速加入4.0ml 10％柠檬酸三钠溶液，搅拌混匀，保持溶液沸腾，直到液体呈酒红色停止加热，冷却至室温后补足1L，得到小颗粒胶体金溶液；取0.5L小颗粒胶体金溶液于三角瓶中，搅拌的同时缓慢加入0.5ml 10％氯金酸溶液和4ml 10％巯基丁二酸溶液，在滴加过程中溶液颜色逐渐变成深红色，待颜色不再变化停止搅拌，制得含羧基的大颗粒胶体金溶液；
S102.TP重组抗原标记：取10ml含羧基的大颗粒胶体金溶液，采用2mg碳二亚胺和0.5mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺活化羧基后，离心去除上清；然后加入0.5mg TP重组抗原MD07使得溶液中TP重组抗原MD07浓度为0.05mg/ml，继续搅拌120min后，加入0.1ml的10％BSA溶液封闭15min，12000r/min离心30min，弃去上清液，沉淀用缓冲液悬浮，4℃保存备用；
S103.鼠IgG标记：取小颗粒胶体金溶液，采用碳酸钾调节pH后，缓慢加入鼠IgG，使溶液中鼠IgG的浓度为0.01mg/ml，继续搅拌30min后，加入10％BSA溶液封闭15min，12000r/min离心30min，弃去上清液，沉淀用缓冲液悬浮，4℃保存备用；
S104.金标垫的制备：将TP重组抗原MD07-胶体金标记物和鼠IgG-胶体金标记物按照体积比1∶1混合后浸泡玻璃纤维，玻璃纤维干燥后即得金标垫；
S105.TP重组抗原包被：取0.5ml 2.0mg/ml的TP重组抗原MD06溶液，加入碳酸钾溶液调整pH至8.6，取生物素-N-琥珀酰亚胺基酯0.5mg，溶于0.05ml DMF，然后加入到重组抗原MD06溶液中，摇匀反应2h，用PBS溶液透析得到生物素标记的重组抗原MD06包被液；向包被液中加入0.5mg链霉亲和素至溶液中，再加PBS调溶液体积为1ml，TP重组抗原MD06浓度为1mg/ml，将链霉亲和素-生物素-TP重组抗原MD06固定于硝酸纤维素膜构成检测线；取pH7.4的PBS溶液稀释羊抗鼠IgG至溶液中羊抗鼠IgG浓度为1mg/ml，将羊抗鼠IgG固定在硝酸纤维素膜构成质控线；
S106.试纸的制备：将样片垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次粘附在背板上，样片垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫纸件分别有2mm重叠，即得用于检测梅毒的胶体金试纸。
实施例2
制备用于检测唾液中梅毒螺旋体抗体的胶体金试纸
S201.胶体金的制备：在圆底烧瓶中加热1L超纯水至沸腾，向沸水中加入1.0ml 10％氯金酸溶液，快速加入3.5ml 10％柠檬酸三钠溶液，搅拌混匀，保持溶液沸腾，直到液体呈酒红色停止加热，冷却至室温后补足1L，得到小颗粒胶体金溶液；取0.5L小颗粒胶体金溶液于三角瓶中，搅拌的同时缓慢加入0.5ml10％氯金酸溶液和4.0ml 10％巯基丁二酸溶液，在滴加过程中溶液颜色逐渐变成深红色，待颜色不再变化停止搅拌，制得含羧基的大颗粒胶体金溶液；
S202.TP重组抗原标记：取10ml含羧基的大颗粒胶体金溶液，采用1.5mg碳二亚胺和0.5mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺活化羧基后，离心去除上清；然后加入0.6mgTP重组抗原MD07使得溶液中TP重组抗原MD07浓度为0.06mg/ml，继续搅拌10min后，加入0.1ml的10％BSA溶液封闭20min，13000r/min离心25min，弃去上清液，沉淀用缓冲液悬浮，4℃保存备用；
S203.鼠IgG标记：取小颗粒胶体金溶液，采用碳酸钾调节pH后，缓慢加入鼠IgG，使溶液中鼠IgG的浓度为0.015mg/ml，继续搅拌30min后，加入10％BSA溶液封闭20min，13000r/min离心25min，弃去上清液，沉淀用缓冲液悬浮，4℃保存备用；
S204.金标垫的制备：将TP重组抗原MD07-胶体金标记物和鼠IgG-胶体金标记物按照体积比1∶1混合后浸泡玻璃纤维，玻璃纤维干燥后即得金标垫；
S205.TP重组抗原包被：取0.5ml 2.0mg/ml的TP重组抗原MD06溶液，加入碳酸钾溶液调整pH至8.6，取生物素-N-琥珀酰亚胺基酯0.6mg，溶于0.06ml DMF，然后加入到重组抗原MD06溶液，摇匀反应1.5h，用PBS溶液透析得到生物素标记的重组抗原MD06包被液；向包被液中加入0.6mg链霉亲和素至溶液中并调TP重组抗原MD06浓度为1mg/ml，将链霉亲和素-生物素-TP重组抗原MD06固定于硝酸纤维素膜构成检测线；取pH7.4的PBS溶液稀释羊抗鼠IgG至溶液中羊抗鼠IgG浓度为1mg/ml，将羊抗鼠IgG固定在硝酸纤维素膜构成质控线；
S206.试纸的制备：将样片垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次粘附在背板上，样片垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫纸件分别有1.8mm重叠，即得用于检测梅毒的胶体金试纸。
实施例3
制备用于检测唾液中梅毒螺旋体抗体的胶体金试纸
S301.胶体金的制备：在圆底烧瓶中加热1L超纯水至沸腾，向沸水中加入1.0ml 10％氯金酸溶液，快速加入3.0ml 10％柠檬酸三钠溶液，搅拌混匀，保持溶液沸腾，直到液体呈酒红色停止加热，冷却至室温后补足1L，得到小颗粒胶体金溶液；取0.5L小颗粒胶体金溶液于三角瓶中，搅拌的同时缓慢加入0.5ml10％氯金酸溶液和4.0ml 10％巯基丁二酸溶液，在滴加过程中溶液颜色逐渐变成深红色，待颜色不再变化停止搅拌，制得含羧基的大颗粒胶体金溶液；
S302.TP重组抗原标记：取10ml含羧基的大颗粒胶体金溶液，采2.5mg碳二亚胺和0.75mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺活化羧基后，离心去除上清；然后加入0.5mgl TP重组抗原MD07使得溶液中TP重组抗原MD07浓度为0.05mg/ml，继续搅拌140min后，加入0.1ml的10％BSA溶液封闭10min，15000r/min离心20min，弃去上清液，沉淀用缓冲液悬浮，4℃保存备用；
S303.鼠IgG标记：取小颗粒胶体金溶液，采用碳酸钾调节pH后，缓慢加入鼠IgG，使溶液中鼠IgG的浓度为0.01mg/ml，继续搅拌30min后，加入10％BSA溶液封闭10min，15000r/min离心20min，弃去上清液，沉淀用缓冲液悬浮，4℃保存备用；
S304.金标垫的制备：将TP重组抗原MD07-胶体金标记物和鼠IgG-胶体金标记物按照体积比1∶1混合后浸泡玻璃纤维，玻璃纤维干燥后即得金标垫；
S305.TP重组抗原包被：取0.4ml 2.0mg/ml的TP重组抗原MD06溶液，加入碳酸钾溶液调整pH至8.6，取生物素-N-琥珀酰亚胺基酯0.4mg，溶于0.04ml DMF，然后加入到重组抗原MD06溶液，摇匀反应2h，用PBS溶液透析得到生物素标记的重组抗原MD06包被液；向包被液中加入0.5mg链霉亲和素至溶液中TP重组抗原MD06浓度为1mg/ml，将链霉亲和素-生物素-TP重组抗原MD06固定于硝酸纤维素膜构成检测线；取pH7.4的PBS溶液稀释羊抗鼠IgG至溶液中羊抗鼠IgG浓度为1mg/ml，将羊抗鼠IgG固定在硝酸纤维素膜构成质控线；
S306.试纸的制备：将样片垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次粘附在背板上，样片垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫纸件分别有2.2mm重叠，即得用于检测梅毒的胶体金试纸。
实施例4
将实施例1-3获得的用于检测唾液中梅毒抗体的胶体金试纸在医护人员的指导下，检测临床确诊断为梅毒螺旋体抗体阳性的患者(200名，编号为A-001～A-200)和梅毒螺旋体抗体阴性的人员(200名，编号为B-001～B-200)。分别将试纸的样品垫擦拭上下牙龈多次后含于口腔内舌下，放置1-5min，至肉眼可见唾液样本移动至硝酸纤维素膜处，取出开始检测。结果，阳性患者的200份试纸中，198份试纸的检测线和质控线均为红色，2份试纸的检质控线为红色，检测线无颜色，即阳性患者的200份试纸中，198份检测为阳性，2份为阴性；阴性人员的200份试纸中，检质控线均为红色，检测线无颜色，即阴性人员的200份试纸中，均检测为阴性.本发明中试纸检测的准确率为99.75％。本发明使用便捷，准确率高，使用时安全无创伤，可广泛用于医疗机构临床科室对患者进行的梅毒抗体初筛试验，也可用于疾控中心等单位对高危人群进行的梅毒抗体初筛试验，还可用于高危人群自行梅毒抗体自查。
本发明中用于检测唾液中梅毒抗体的胶体金试纸也可采用以下方法使用：将口腔采集棒的海绵取样端擦拭上下牙龈多次后放入1.0mL样品稀释液收集瓶中充分搅拌后的样品，滴加2-3滴至试纸的样品垫上开始检测。
对本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及形变，而所有的这些改变以及形变都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。