一种闭合式多元双性电极电化学发光芯片及其应用的制作方法

本发明属于微流控芯片制作及传感分析领域，具体涉及一种闭合式多元双性电极电化学发光芯片及其在多元检测中的应用。

背景技术：

自20世纪60年代后期以来，双性电化学逐渐发展成为一门成熟技术，它充分发挥了双性电极(Bipolar electrode，BPE)的无线特性。驱动电压施加在一对驱动电极上，当电解质溶液与BPE界面电势差足够大时，BPE两极氧化/还原反应就会被触发。BPE体系具有如下几个优点：双性电极不与外部电源直接接触；一对驱动电极能同时控制多个工作电极；所需设备简单、易于操作，无需专业训练。

BPE可分为开放式BPE(open BPE，O-BPE)和闭合式BPE(closed BPE，C-BPE)。对于O-BPE，BPE阴、阳两极处于同一个微通道内，电流不仅通过BPE，还流经溶液。由于很大一部电流都损失在电解质溶液中，O-BPE体系电流效率很低，因而其应用受到了极大限制。而C-BPE体系中BPE阴极和阳极分别处于不同反应溶液中，避免了溶液的交叉污染，同时其电流效率几乎为100％，使得C-BPE体系只需较低的驱动电压。另外，还可以通过直接测量C-BPE上电流实现对法拉第反应速率分析。

在过去几年里，循环伏安法、荧光法、LED发光检测法、电致变色法、电化学发光(ECL)等已经与C-BPE应用相结合。其中，ECL不仅具有灵敏度高、背景噪声低、设备廉价以及操作简单等优点，还可以实现远距离同时监测BPE阵列的工作状态。目前，C-BPE与ECL相结合(即C-BPE-ECL)的微流控芯片已成功用于检测癌症生物标志物、癌细胞、三丙胺、过氧化氢(H2O2)、多巴胺、抗坏血酸等。

尽管先前报道的C-BPE-ECL微流控芯片都具良好的分析性能，但仍面临一些问题。比如，这些C-BPE-ECL芯片无法在同一反应微通道中实现多元分析。

申请人的前期工作，即中国专利申请CN106093015A，公开了一种闭合式双性电极电致化学发光布芯片，该芯片只设计了一个双性电极，无法实现多元检测。

技术实现要素：

为了解决现有的闭合式双性电极电化学发光芯片只含有单个双性电极无法在同一反应微通道中实现多元检测的缺陷，本发明的首要目的在于提供一种闭合式的、含有多个双性电极的芯片，其数个双性电极横跨两个微通道(即支持微通道和报告微通道)，因此能够实现多元检测。

本发明的另一目的在于提供上述芯片在多元检测中的应用，比如在该芯片上可以同时实现对葡萄糖和尿酸的检测。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种芯片，含有报告微通道(也称反应微通道)和支持微通道，阴性驱动电极位于报告微通道中，阳性驱动电极位于支持微通道中；数个闭合式双性电极横跨于两个微通道中；每个闭合式双性电极，其阴极、阳极到对应的驱动电极的距离之和相等；从而实现多元检测；

所述“对应的”是指，闭合式双性电极的阴极到阳性驱动电极的距离；阳极的情况以此类推；

所述的闭合式双性电极，其阳极位于报告微通道中，阴极位于支持微通道中；

所述的多元检测，是指在同一个芯片的两个闭合式双性电极的阳极上分别预固定葡萄糖氧化酶和尿酸氧化酶，在报告微通道中加入含有葡萄糖和尿酸的待测样品后，闭合式双性电极的阳极上发生电化学发光反应，通过检测发光强度，即可以同时实现对葡萄糖和尿酸的检测。本发明的芯片，在单一报告微通道中含有数个闭合式双性电极，从而实现多元检测。

所述的芯片，每个闭合式双性电极，其阴极、阳极到对应的驱动电极的距离之和相等，这是为了保证每个双性电极阴、阳两极之间电势差相等。这是因为，一方面对于某一种检测物，只有在电势差相等的情况下，才可以实现多个双性电极上发光强度相同；另一方面，对于某一种电化学发光反应体系，只有在电势差相等的情况下，才可以使得不同检测物受驱动电压的影响是一样的。如此，该芯片可能用于检测所有基于该电化学发光反应体系的检测物，进而实现多元检测。

所述的微通道是亲水性的；所述微通道的四周是疏水性的蜡坝；

所述的一对驱动电极，形状优选矩形且尺寸相同；

所述的电极由导电碳浆制成；

所述芯片的衬底为纸或者布。

上述芯片的制作方法，包括如下步骤：

(1)设计微通道图案和电极图案，然后制作出微通道网板和电极网板；

(2)将衬底放在微通道网板下方，然后用固体蜡、平滑器具在微通道网板上先后涂抹、研磨；接着将微通道网板和衬底一起放在加热板上烘烤数秒钟，从而使蜡融化渗入到衬底中；

(3)取印有微通道的衬底放在电极网板下方(直接印蜡的正面朝上)；然后将导电碳浆倒在电极网板上，刷涂碳浆到衬底上；刷涂完毕，将衬底与电极网板分开，在室温下晾干，制成芯片。

上述的芯片可以用于对葡萄糖和尿酸做同时检测，具体包括以下步骤：

在芯片的两个闭合式双性电极的阳极上分别预固定葡萄糖氧化酶和尿酸氧化酶，然后在报告微通道中加入含有葡萄糖和尿酸的待测样品，接通驱动电极，闭合式双性电极的阳极上发生电化学发光反应，通过检测发光强度，实现对葡萄糖和尿酸的同时检测；

所述含有葡萄糖和尿酸的待测样品，需要预先与鲁米诺溶液混合；

优选地，上述芯片在使用时，可以将芯片固定在一个支架上，支架上与芯片微通道对应的位置挖空，这样既可以保证芯片在使用过程中保持平整，又可以避免通道中的溶液与支架或载物台接触而产生不必要的污染；

上述芯片在使用时，支持微通道中添加的是碳酸盐缓冲液(carbonate buffer solution，CBS)。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)相对于现有的开放式双性电极电化学发光技术而言，本发明的闭合式双性电极的阳极和阴极分别位于两个空间分离的微通道中，从而有效避免了两个反应系统交叉污染和干扰。另外，本发明的驱动电极阳极与双性电极阳极不在一个微流体通道内，避免了驱动电极对分析物的优先消耗，并且可以有效消除来自驱动电极的背景信号干扰。

(2)相对于现有的闭合式双性电极电化学发光技术而言，本发明可在一对驱动电极下，可以实现多个双性电极上等效果的电化学发光，为实现高通量多元检测提供应用潜力。

(3)本发明在应用于H2O2和葡萄糖检测中，具有良好的检测灵敏度和线性范围；在实际样品检测中，可以实现多种类葡萄糖样品的检测。

(4)本发明可以在同一反应微通道中实现葡萄糖和尿酸同时检测，为单一芯片上实现多元检测奠定基础。

(5)本发明芯片的制作方法简单，廉价，环保，操作人员无需特别训练。

附图说明

图1是本发明芯片的实物图；其中，1-阳性驱动电极，2-闭合式双性电极，3-报告微通道，4-阴性驱动电极，5-蜡坝，6-支持微通道。

图2是ECL强度随驱动电压变化的曲线图。

图3是ECL强度随鲁米诺浓度变化的曲线图。

图4是ECL强度随碳酸盐缓冲液(CBS)的pH值变化的曲线图。

图5是同一芯片上三根双性电极(编号1、2和3)阳极上ECL成像图。

图6是同一芯片上三根双性电极(编号1、2和3)阳极上ECL强度柱状图。

图7是ECL强度随H2O2浓度变化的曲线图；其中，插图A为ECL强度与H2O2浓度成线性关系的曲线图(H2O2浓度范围为0.075-0.5mM)，插图B为ECL强度与过氧化氢浓度的对数成线性关系的曲线图(H2O2浓度范围为1-10mM)。

图8是ECL强度随葡萄糖浓度变化的曲线图；其中，插图A为ECL强度与葡萄糖浓度成线性关系的曲线图(葡萄糖浓度范围为0.080-0.5mM)，插图B为ECL强度与葡萄糖浓度对数成线性关系的曲线图(葡萄糖浓度范围为0.75-5mM)。

图9是本发明方法与临床方法用于人血清样品中葡萄糖检测的数据对比图。

图10是本发明方法与临床方法用于人尿液样品中葡萄糖检测的数据对比图。

图11是本发明方法与标准稀释法用于葡萄酒样品中葡萄糖检测的数据对比图。

图12是本发明方法与标准稀释法用于5％葡萄糖注射液样品中葡萄糖检测的数据对比图。

图13是本发明纸芯片在三个不同浓度下同时检测葡萄糖和尿酸的ECL成像图。

图14是本发明芯片在三个不同浓度下同时检测葡萄糖和尿酸的ECL强度柱状图。

图15是本发明芯片的结构示意图；

图16是对比例芯片的结构示意图；

其中，1-阳性驱动电极，2-闭合式双性电极，3-报告微通道，4-阴性驱动电极，5-蜡坝，6-支持微通道。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

一种闭合式多元双性电极电化学发光芯片的制作方法，包括以下步骤：

(1)用Adobe Illustrator CS5软件设计亲水微通道图案和电极图案(包括驱动电极和双性电极)，然后由厂家加工制作出300目聚酯微通道网板和电极网板；

(2)将衬底(纸或布)裁剪成4张同样大小(100mm×100mm)，裁剪好的纸片放在微通道网板下方，然后用蜡笔、平滑器具在微通道网板上先后涂抹、研磨；接着将微通道网板和纸片一起放在90℃加热板(型号YH-946B)上烘烤3～5秒钟，从而使蜡融化渗入到纸中；

(3)取印有微通道的纸片放在电极网板下方(直接印蜡的正面朝上)；然后将导电碳浆(<60Ω/square)倒在电极网板上，刷涂碳浆到纸片上；刷涂完毕，将纸片与电极网板分开，在室温下晾干，以形成P-3C-BPE-ECL芯片。

制得的芯片如图1所示，也可以如图15所示，其含有报告微通道3和支持微通道6，阴性驱动电极4位于报告微通道3中，阳性驱动电极1位于支持微通道6中；数个闭合式双性电极2横跨于两个微通道中；每个闭合式双性电极，其阴极、阳极到对应的驱动电极的距离之和相等；从而实现多元检测；

所述的闭合式双性电极2，其阳极位于报告微通道3中，阴极位于支持微通道6中；

所述的微通道是亲水性的；所述微通道的四周是疏水性的蜡坝5。

实施例2

实施例1制得的芯片在检测H2O2中的应用，包括如下步骤：

(1)将芯片固定在一个PET塑料支架上，支架对应于微通道的区域被挖空，这样既可以保证芯片在使用过程中保持平整，又可以避免通道中的溶液与支架或载物台接触而产生不必要的污染；

(2)两个驱动电极表面上粘贴一层导电双面胶带，并通过带鳄鱼夹的导线连接到设置好输出电压的直流电源(型号LW-6403KDS)上；

(3)将芯片连同导线一起放在暗箱中的可移动机械台(型号S7650)上，设置CCD相机(型号MC15)的摄像参数，并调节可移动机械台和可调焦托架，使镜头对准双性电极阳极发光区域，且在电脑上呈现出清晰图像；

(4)用移液枪向芯片上支持微通道中滴加体积为35μL的CBS，报告微通道中滴加体积为35μL的相应测试液，先后开启CCD自动成像功能(帧速15帧/秒、比特率3000比特/秒)和直流电源开关；触发的ECL过程由CCD实时成像；

(5)将拍摄的视频(WMV格式)先用VGIF软件(http://video-to-gif.watermark-software.com/)进行处理，每25ms截取一张图片(JPG格式)；再用光影魔术手(nEO IMAGING 4.4.1)截取每张图片上的主要发光区域，其大小为82×277像素；接着通过软件Matlab R2012a(Math Works company,USA)的图像自动处理程序分析所得批图片的平均灰度值，从而获得具有最大ECL强度的图片；将该图片平均灰度值乘以发光区域像素点得到发光面积的光子数，将所得数据导入Origin 7.0中做进一步分析，得到ECL强度与一定参数之间的数据图(每个数据点均采用8次重复实验计算所得)。

现以报告微通道中含2mM鲁米诺和5mM H2O2的测试液、支持微通道中含pH值10.0的CBS为例，采用芯片(芯片参数：BPE横跨位置处的微通道长度(LCh-BPE)及宽度(WCh-BPE)分别为15mm和4mm、驱动电极位置处的微通道长度(LCh-DE)及宽度(WCh-DE)分别为5mm和6mm、驱动电极长度(LDE)及宽度(WDE)分别为4mm和7mm、BPE长度(LBPE)及宽度(WBPE)分别为12mm和1mm、BPE根数(NBPE)为1(位于芯片中心位置处))来测试不同驱动电压Etot与ECL强度之间的关系。

结果如图2所示，可以看出：随着驱动电压Etot从2V变化到10V，ECL强度逐渐增强；当驱动电压Etot小于2V时，几乎观察不到ECL信号；当驱动电压Etot大于10V时，ECL信号开始下降。因此，优选驱动电压Etot为10V，可接受的范围是8-10V。

实施例3

对影响实施例2中芯片ECL强度的两个重要因素(鲁米诺浓度、CBS的pH值)进行优选

a)优选鲁米诺浓度

1、其他条件同实施例2，即芯片LCh-BPE＝15mm、WCh-BPE＝4mm、LCh-DE＝5mm、WCh-DE＝6mm、LDE＝4mm、WDE＝7mm、LBPE＝12mm、WBPE＝1mm、NBPE＝1(位于芯片中心位置处)；驱动电压Etot＝10V；报告微通道中测试液体积为35μL、H2O2浓度为5mM；支持微通道中CBS体积为35μL；CBS的pH值为10.0。

2、设置若干实验组：鲁米诺浓度设置为几个不同值(0.5mM、1mM、1.5mM、2mM、2.5mM)。

3、芯片P-3C-BPE-ECL检测过程同实施例2，测试结果如图3所示。

从实验结果可以看出：当鲁米诺浓度为0.5-2mM时，随着鲁米诺浓度增加，ECL强度逐渐增大；当鲁米诺浓度为2-2.5mM时，随着鲁米诺浓度增加，ECL强度开始减小。因此，优选鲁米诺浓度为2mM，可接受的范围是1.5-2mM。

b)优选CBS的pH值

1、其他条件相似于a)，即芯片LCh-BPE＝15mm、WCh-BPE＝4mm、LCh-DE＝5mm、WCh-DE＝6mm、LDE＝4mm、WDE＝7mm、LBPE＝12mm、WBPE＝1mm、NBPE＝1(位于芯片中心位置处)；驱动电压Etot＝10V；报告微通道中测试液体积为35μL、鲁米诺浓度为2mM、H2O2浓度为5mM；支持微通道中CBS体积为35μL。

2、设置若干实验组：CBS的pH值设置为几个不同值(9.0、9.5、9.75、10.0、10.25、10.5、11.0)。

3、芯片P-3C-BPE-ECL检测过程同实施例2，测试结果如图4所示。

从实验结果可以看出：当CBS的pH值为9.0-10.0时，随着pH值升高，ECL强度逐渐增强；当CBS的pH值为10.0-11.0时，随着pH值升高，ECL强度开始减弱。因此，优选CBS的pH值为10.0，可接受范围是9.75-10.0。

实施例4

探究芯片上各双性电极ECL强度均一性问题(即多个双性电极上等效果的ECL问题)

1、采用与实施例2相似的条件以及实施例3优选的测试条件：芯片LCh-BPE＝15mm、WCh-BPE＝4mm、LCh-DE＝5mm、WCh-DE＝6mm、LDE＝4mm、WDE＝7mm、LBPE＝12mm、WBPE＝1mm；驱动电压Etot＝10V；报告微通道中测试液体积为35μL、鲁米诺浓度为2mM、H2O2浓度为5mM；支持微通道中CBS体积为35μL；CBS的pH值为10.0。

2、设置BPE根数NBPE为3(中间的BPE位于芯片中心位置处，其它两根左右对称分布)。

3、芯片P-3C-BPE-ECL检测过程同实施例2，测试结果如图5和图6所示。

从ECL成像图上可以看出：同一芯片报告微通道中三根双性电极阳极上发光亮度相近(图5)。就8次重复实验发光强度来看，这三根双性电极阳极上ECL强度偏差很小(0.3-2.4％)(图6)。因此，芯片上三个双性电极上能产生等效果ECL，这为实现高通量多元检测提供强的应用潜力。

实施例5

以实施例3摸索到的优选条件利用芯片检测H2O2

1、采用与实施例2相似的条件以及实施例3优选的测试条件：芯片LCh-BPE＝15mm、WCh-BPE＝4mm、LCh-DE＝5mm、WCh-DE＝6mm、LDE＝4mm、WDE＝7mm、LBPE＝12mm、WBPE＝1mm；驱动电压Etot＝10V；报告微通道中测试液体积为35μL、鲁米诺浓度为2mM；支持微通道中CBS体积为35μL；CBS的pH值为10.0。

2、设置若干实验组：H2O2浓度设置为几个不同值(0mM、0.075mM、0.1mM、0.25mM、0.375mM、0.5mM、1mM、2.5mM、5mM、7.5mM、10mM)。

3、芯片P-3C-BPE-ECL检测过程同实施例2，测试结果如图7所示。

从实验结果可以看出：当H2O2浓度在0-10mM范围内时，ECL强度随H2O2浓度增加而增大。此外，当H2O2浓度在0.075-0.5mM范围内变化时，ECL强度(用Y表示)和H2O2浓度(用X表示)呈一定线性关系，其拟合方程为Y＝4.491X–0.184(R²＝0.9922)(插图A)；当H2O2浓度在1-10mM范围内变化时，ECL强度(用Y表示)和H2O2浓度对数(用X表示)表现出一定线性关系，其拟合方程为Y＝0.812X+2.490(R²＝0.9970)(插图B)。最后，利用拟合方程计算所得H2O2检测限为0.041mM，其中检测限的计算方法为：YL＝Yb+3Sb(Yb表示空白对照对应的ECL强度，Sb表示空白对照对应ECL强度的标准偏差)，利用所得YL值计算出相应的H2O2浓度即为检测限。

实施例6

芯片P-3C-BPE-ECL检测葡萄糖时，除芯片报告微通道中双性电极阳极预固定着GOD、CBS的pH值为10.5、测试液中含葡萄糖以及加样后酶促反应3min不同之外，其它均与实施例5中检测H2O2的条件相同，这些条件包括测试过程、芯片参数、驱动电压等。

1、芯片报告微通道中双性电极阳极预固定着GOD过程为：向双性电极阳极端滴加0.8μL GOD溶液(5unit/μL)，约2min晾干后，再滴加0.5μL相同酶溶液并晾干约2min，然后放入4℃冰箱内干燥保存。

2、设置若干实验组：葡萄糖浓度设置为几个不同值(0mM、0.075mM、0.1mM、0.25mM、0.375mM、0.5mM、0.75mM、1mM、2.5mM、3.75mM、5mM)。

3、芯片P-3C-BPE-ECL检测过程同实施例2，测试结果如图8所示。

从实验结果可以看出：当葡萄糖浓度在0-5mM范围内时，ECL强度随葡萄糖浓度增加而增大。此外，葡萄糖浓度在0.08-0.5mM范围内变化时，ECL强度(用Y表示)和葡萄糖浓度(用X表示)表现出一定线性关系，其拟合方程为Y＝3.301X–0.099(R²＝0.9843)(插图A)；当葡萄糖浓度在0.75-5mM范围内变化时，ECL强度(用Y表示)和葡萄糖浓度对数(用X表示)表现出一定线性关系，其拟合方程为Y＝0.847X+1.840(R²＝0.9894)(插图B)。最后，利用拟合方程计算所得的葡萄糖检测限为0.03mM，其中检测限的计算方法为：YL＝Yb+3Sb(Yb表示空白对照对应的ECL强度，Sb表示空白对照对应ECL强度的标准偏差)，利用所得YL值计算出相应葡萄糖浓度即为检测限。

实施例7

利用芯片P-3C-BPE-ECL实现实际样品(人血清、人尿液、葡萄酒以及5％葡萄糖注射液)中的葡萄糖检测

a)以人血清为实际样品

1、其他条件同实施例6。

2、设置若干实验组：选8个人血清样品，其葡萄糖浓度分别为4.88mM、8.97mM、12.09mM、15.06mM、17.04mM、20.46mM、22.41mM、40.76mM。

3、将一定量血清样品用pH值为10.5的CBS稀释10倍，接着将稀释后的血清样品与4mM鲁米诺(pH值10.5的CBS稀释而成)等体积混合得到测试液。

4、芯片P-3C-BPE-ECL检测过程同实施例2。

测试结果如图9所示，图中Y轴表示使用本发明所述的芯片检测得到的血清样品中葡萄糖浓度，X轴表示使用临床方法测量的葡萄糖浓度。两种方法所测葡萄糖浓度之间的数值对应关系为Y＝1.007X–0.430(R²＝0.9981)，具有良好的相似性。

b)以人尿样为实际样品

1、其他条件同实施例6。

2、设置若干实验组：选5个人尿液样品，其葡萄糖浓度分别为5.6mM、8.3mM、11mM、17mM、28mM。

3、将一定量尿液样品用pH值为10.5的CBS稀释10倍，接着将稀释后的血清样品与4mM鲁米诺(pH值10.5的CBS稀释而成)等体积混合得到测试液。

4、芯片P-3C-BPE-ECL检测过程同实施例2。

测试结果如图10所示，图中Y轴表示使用本发明所述芯片检测得到的人尿液样品中葡萄糖浓度，X轴表示使用临床方法测量的葡萄糖浓度，两种方法所测葡萄糖浓度之间的数值对应关系为Y＝0.999X+0.117(R²＝0.9970)，具有良好的相似性。

c)以葡萄酒为实际样品

1、其他条件同实施例6。

2、设置若干实验组：将葡萄糖浓度为93.8mM的葡萄酒用pH值为10.5的CBS逐级稀释得到葡萄糖浓度分别为0.25mM、1.25mM、2.25mM、3.25mM、4.25mM的葡萄酒样品。

3、将一定量葡萄酒样品用pH值为10.5的CBS适当稀释，接着将稀释后的葡萄酒样品与4mM鲁米诺(pH值10.5的CBS稀释而成)等体积混合得到测试液。

4、芯片P-3C-BPE-ECL检测过程同实施例2。

测试结果如图11所示，图中Y轴表示使用本发明所述芯片检测得到的葡萄酒样品中葡萄糖浓度，X轴表示使用标准稀释法得到的葡萄糖浓度，两种方法所测葡萄糖浓度之间的数值对应关系为Y＝1.021X-0.012(R²＝0.9982)，具有良好的相似性。

d)以5％葡萄糖注射液为实际样品

1、其他条件同实施例6。

2、设置若干实验组：将葡萄糖浓度为277.5mM的葡萄糖注射液用pH值为10.5的CBS逐级稀释得到葡萄糖浓度分别为0.5mM、1mM、2.5mM、3.5mM、5mM的葡萄糖注射液样品。

3、将一定量葡萄糖注射液样品用pH值为10.5的CBS适当稀释，接着将稀释后的葡萄糖注射液样品与4mM鲁米诺(pH值10.5的CBS稀释而成)等体积混合得到测试液。

4、芯片P-3C-BPE-ECL检测过程同实施例2。

测试结果如图12所示，图中Y轴表示使用本发明所述芯片检测得到的葡萄糖注射液样品中葡萄糖浓度，X轴表示使用标准稀释法得到的葡萄糖浓度，两种方法所测葡萄糖浓度之间的数值对应关系为Y＝1.035X-0.017(R²＝0.9973)，具有良好的相似性。

实施例8

芯片P-3C-BPE-ECL同时检测葡萄糖和尿酸以实现单一报告通道中二元检测，除芯片上含两根双性电极、报告微通道中两根双性电极阳极分别预固定着GOD和UOD、测试液中含葡萄糖和尿酸不同之外，其它均与实施例6中检测葡萄糖的条件相同，这些条件包括测试过程、芯片参数、驱动电压等。

1、芯片报告微通道中两根双性电极阳极分别预固定着GOD和UOD过程为：首先向一根双性电极阳极滴加0.8μL GOD溶液(5unit/μL)，立即再向另一个双性电极阳极滴加0.8μL UOD溶液(0.1unit/μL)；约2min晾干后，再分别滴加0.5μL相同酶溶液至两阳极处并晾干约2min，然后放入4℃冰箱内干燥保存。

2、先配制一定浓度葡萄糖溶液；再将尿酸母液(用0.1M NaOH配制)用pH值为10.5的CBS稀释得到与上述葡萄糖溶液相同浓度的尿酸溶液；然后将得到的相同浓度值的葡萄糖溶液和尿酸溶液等体积混合，所得混合液再与4mM鲁米诺溶液(pH值10.5的CBS稀释而成)等体积混合以得到二元检测的测试液。

3、设置若干实验组：每个测试液中葡萄糖和尿酸浓度相同，分别为0mM、0.25mM、1mM。

4、芯片P-3C-BPE-ECL检测过程同实施例2，测试结果如图13和图14所示。

从ECL成像图上可以看出：报告微通道中检测物浓度越大，两根双性电极阳极上发光就越亮(图13)。就8次重复实验发光强度来看，这两根双性电极阳极上ECL强度随着检测物浓度变大而增强(图14)。因此，本发明可以实现对葡萄糖和尿酸的同时检测，具有多元检测的能力。

对比例

一种芯片，其结构示意图如图16所示，与本发明芯片的不同之处在于驱动电极与闭合式双性电极的位置关系不同。如图16所示的芯片，三个双性电极电势差并不相等，而是随着与驱动电极之间距离的增大而减小，进而影响多元检测的有效性，无法实现多元检测。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。