本发明涉及一种新疆一枝蒿植物代谢组学的分析方法，具体涉及一种基于液相色谱-串联质谱联用技术的新疆一枝蒿植物代谢组学的分析方法，属于植物代谢组学分析领域。
背景技术：
从药用植物中寻找活性物质、发现新的药源分子一直是新药研究的重要内容。药用植物物种多样，所含化学成分种类繁多，为新药研发提供了丰富资源。然而，传统的药用植物药效成分研究方法难以全面地反映化学成分及其体内分布，生态环境对其体内物质的影响。植物代谢组学研究是从整体出发，系统地分析植物中的所有小分子物质及其随时间、环境的变化，有利于药用植物物质基础及其功能的阐明、物种的判断及预测等。目前，代谢组学研究中常用的分析工具主要是以核磁共振波谱(nuclearmagneticresonance,nmr)和质谱(massspectrometry,ms)技术为核心的分析手段及其与色谱的联用技术，其中液相色谱-串联质谱联用技术(liquidchromatography-tandemmassspectrometry,lc-ms/ms)具有高灵敏、高通量、特异性强的特点，能够用于高效、快速、准确地研究植物内源性代谢物的动态变化信息，为阐明药用植物复杂代谢体系提供分子依据，从而已经成为重要的分析手段。
新疆一枝蒿植物(artemisiarupestrisl.)为菊科蒿属、多年生草本植物，主要分布在我国新疆天山、阿尔泰等地区，全草入药。作为新疆维吾尔医学的传统用药，新疆一枝蒿具有抗炎、保肝、抗过敏、抗病毒、抑菌、抗肿瘤等多方面的药效作用，有较高的药用价值。新疆一枝蒿中化学成分种类繁多，含有黄酮类、生物碱类、倍半萜类、多糖类等。文献报道该植物中黄酮类和倍半萜类化合物是含量较为丰富的活性成分，例如倍半萜类次生代谢物一枝蒿酮酸是代表性的特征有效成分。新疆一枝蒿药材资源多依靠野生采挖，由于该植物具有独特的生态特性，自然繁殖极为困难，并且近年来被大量开发利用，加上矿山开采、过度放牧等原因，野生药材资源已经匮乏，因而新疆一枝蒿的引种、驯化、人工栽培研究得到了重视，并在临床上采用人工栽培品种代替野生品种使用。然而，人工栽培品种与野生品种的药效物质基础是否一致尚存争议。目前，新疆一枝蒿的药效物质基础研究主要包括化学成分的分离鉴定、有效成分的含量测定、质量标准分析等。但这些研究多采用传统分析方法，分离提取过程耗时，分析通量有限，且仅针对少数几个化合物，无法高效、系统、全面地表征新疆一枝蒿的药效物质基础。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种基于液相色谱-串联质谱联用技术的新疆一枝蒿植物代谢组学的分析方法，本发明建立了基于lc-ms/ms技术的新疆一枝蒿植物代谢组学分析方法，该方法样品前处理操作简便，分析方法稳定性好、灵敏度高、代谢物覆盖范围宽，可高效、全面地获取该植物的代谢组信息。
本发明提供的一种新疆一枝蒿植物代谢组学的分析方法，包括如下步骤：1)取新疆一枝蒿不同组织器官的干粉末，分别用有机溶剂提取、超声、离心、浓缩，得到浓缩物，然后将所述浓缩物进行复溶、所述超声、所述离心、过滤，取不同组织器官的代谢组的上清液；
2)将所述不同组织器官的代谢组的上清液采用液相色谱-串联质谱法进行测定，对得到的数据进行处理；然后采用多变量统计分析得到差异变量，根据差异代谢物的高分辨质荷比及串联质谱数据，结合代谢物数据库metlin检索对比分析，即得到新疆一枝蒿不同组织器官的植物代谢组的差异。
上述的方法中，所述不同组织器官为根、茎、枝、叶和花中的至少一种；
所述有机溶剂为甲醇-水、乙腈-水、乙酸乙酯-水和甲醇-氯仿-水中的至少一种；
所述有机溶剂中，所述甲醇与所述水的体积比可为50～95:5～50；所述乙腈与所述水的体积比可为50～95:5～50；所述乙酸乙酯与所述水的体积比可为50～95:5～50；所述甲醇、所述氯仿与所述水的体积比可为5～20:5～20:60～90；
进行所述复溶之前所述超声的时间为1～30min；
所述有机溶剂提取的转速可为10000～30000r/min，具体可为25000r/min；进行所述复溶之前所述离心的转速为10000～15000r/min，具体可为13500r/min；
所述复溶的溶剂为乙腈-水；
所述复溶的溶剂中所述乙腈与所述水的体积比可为5～50:50～95；
进行所述复溶之后所述超声的时间可为1～30min，所述离心的转速可为10000～15000r/min，具体可为13500r/min。
上述的方法中，所述有机溶剂为体积比可为80:20的甲醇-水和/或60:20:20的甲醇-氯仿-水；
所述超声的时间可为10min；
所述有机溶剂提取的转速可为25000r/min；进行所述复溶之前所述离心的转速可为13500r/min；
所述复溶的溶剂中所述乙腈与所述水的体积比为50:50；
进行所述复溶之后所述超声的时间为10min，所述离心的转速为13500r/min。
上述的方法中，所述液相色谱条件如下：acquityuplchsst3色谱柱，具体可为100mm×2.1mm、1.8μm、waters公司的acquityuplchsst3色谱柱；含体积百分含量为0.1％的甲酸的水a和含体积百分含量为0.1％甲酸的乙腈b为流动相；流速为0.3ml/min，进样量为5μl，柱温为40℃；洗脱梯度为：每次进样前用初始流动相平衡8min，含体积百分含量为5％～50％的b洗脱0～20min；含体积百分含量为50％～98％b洗脱20～27min；含体积百分含量为98％的b洗脱27～30min；含体积百分含量为98％～5％的b洗脱30～30.1min；
所述质谱条件如下：
离子源为电喷雾(electrosprayionization,esi)源；采用正、负离子检测模式；扫描模式为全扫描；扫描范围:m/z150～1000；分辨率:60000；喷雾电压：3.5kv(正离子模式)，-3kv(负离子模式)；鞘气:0.24mpa；辅助气:0.10mpa；离子源温度:正离子模式为350℃，负离子模式为380℃。
上述的方法中，所述多变量统计分析的方法包括主成分分析(简称pca)和正交偏最小二乘判别分析(简称opls-da分析)对样品进行模式识别，选择对分组贡献较大的变量。
本发明中，在所述多变量统计分析中的多变量为本领域中新疆一枝蒿不同组织器官的代谢组中常规的化学成分；具体以黄酮类化合物为例，黄酮类化合物包括黄酮、异黄酮、黄酮醇、异黄酮醇、黄烷酮、异黄烷酮和查耳酮等多种苷元结构类型以及黄酮氧苷、碳苷等异构体形式的糖苷类化合物。
上述的方法中，在所述多变量统计分析之后还包括采用带有jack-knifed置信区间的载荷图及原始轮廓图进行筛选去除变异较大、组间交差严重的变量，对两组独立样本进行t检验，选择p<0.05的变量的步骤。
上述的方法中，在所述多变量统计分析之后还包括采用pearson相关性分析筛除加合离子、同位素离子及碎片离子，获得差异变量。
上述的方法中，步骤(2)中数据处理后得到质荷比(m/z)、保留时间(retentiontime)及其峰面积的二维数据阵；具体处理操作如下：获得正、负离子检测模式下的uhplc-(±)esi-ms谱后，采用数据格式转换软件msconvert将原始数据(.raw格式)转换成为mzxml格式文件，并导入开源数据处理软件xcms进行峰识别、峰对齐、峰填充及峰过滤，最终获得包括质荷比(m/z)、保留时间(retentiontime)及其峰面积的二维数据阵。然后，将上述获得的二维数据阵导入simca-p(version12.0,umetricsab,
本发明中，步骤(2)中结合代谢物数据库metlin(http://metlin.scripps.edu)检索对比分析，对组间变化倍数大于10的差异代谢物结构类别进行了分析；通过本发明别出97个一枝蒿酮酸衍生物、7个绿原酸类化合物以及15个其它类型化合物。
本发明具有以下优点：
本发明对具有民族特色的药用植物新疆一枝蒿为研究对象，采用高通量的lc-ms/ms技术为分析手段，通过前处理方法及分析方法的系统优化，建立了适用于植物代谢组学研究的lc-ms/ms分析方法，该方法样品前处理操作简便，分析方法稳定性好、灵敏度高、代谢物覆盖范围宽，能获得了全面的新疆一枝蒿代谢组信息，同时结合多变量统计分析，对新疆一枝蒿的根、茎、枝、叶、花的代谢组进行分析，发现了不同化学成分及特征活性成分在不同组织器官的分布特征，寻找到新疆一枝蒿不同组织器官之间的代谢组差异，初步揭示了该药用植物的代谢组学特征和规律，并为后续人工栽培品种和野生品种新疆一枝蒿的药效物质基础研究及其质量控制提供了新的分析手段，以此为药材的质量控制、品种改良和合理开发提供了新的研究策略。
附图说明
图1为不同溶剂提取获得的色谱峰数目比较，meoh：甲醇；acn：乙腈；eac：乙酸乙酯；chcl3:氯仿；图1中各个扇形的相对应的数据，其中一个含有有机溶剂简称的数据为有机溶剂水溶液中的体积百分含量，另一个为在此有机溶剂水溶液中提取得到的色谱峰的数目占所有溶剂提取到的峰的数目的百分比。
图2为基于不同提取溶剂获得的(a)uhplc-(-)esi-ms数据和(b)uhplc-(+)esi-ms数据构建的pca模型得分图，meoh：甲醇；acn：乙腈；eac：乙酸乙酯；chcl3：氯仿。
图3为正、负离子检测模式下不同有机相比例的复溶溶剂检测到的色谱峰数目比较，acn：乙腈。
图4为正离子检测模式lc-ms分析获得的新疆一枝蒿的总离子流色谱图。
图5为基于新疆一枝蒿不同组织器官获得的(a)uhplc-(-)esi-ms数据和(b)uhplc-(+)esi-ms数据构建的pca模型得分图。
图6为负离子检测模式下新疆一枝蒿根、茎、叶、枝、花之间差异代谢物的分布热图
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中，超高效液相色谱(ultramate3000，美国thermo公司)；q-ot-qit杂合型质谱仪(orbitrapfusionlumos，美国thermo公司)；移液器(美国thermo公司)；冷冻干燥机与真空离心浓缩仪(德国christ公司)；离心机与混匀仪(德国eppendorf公司)；高速分散机(德国ika公司)；0.22μm滤膜(美国agilent公司)；
对照品一枝蒿酮酸、异槲皮苷、芦丁、紫花牡荆素、洋艾素、金合欢素(辰光生物公司)；刺槐素(成都克洛玛生物科技公司)；蒙花苷(中国食品药品检定研究院)；
乙腈、甲醇(德国merck公司)；甲酸(美国roe公司)；乙酸乙酯(美国honeywell公司)；氯仿(美国mreda公司)；所有试剂均为色谱纯；实验用水为某品牌纯净水。
实施例1、
一、实验部分
样品采集与制备：
盛花期新疆一枝蒿采自新疆维吾尔自治区富蕴县(人工栽培品种，于2014年8月育苗，2015年6月底-7月初移栽至大田)，采集后立即置于装有干冰的保温盒中暂存，并尽快转移至-80℃冰箱。取新疆一枝蒿根、茎、枝、叶、花，使用研钵在液氮中研磨成粉，粉末置于冷冻干燥机48h。称取50±1mg冻干粉末于匀浆管中，冰浴条件下使用1ml甲醇-水(80:20，v/v)在高速分散器中提取3min(25000r/min，1min；3000r/min，1min；25000r/min，1min)，超声10min后离心10min(13500r/min)，置于真空离心浓缩仪中浓缩3h。将浓缩物复溶于1ml乙腈-水(50:50，v/v)，超声混匀后离心10min，使用0.22μm微孔滤膜过滤上清液，备检。
色谱条件：
acquityuplchsst3色谱柱(100mm×2.1mm，1.8μm，waters公司)；水(含0.1％甲酸，a)和乙腈(含0.1％甲酸，b)为流动相；流速为0.3ml/min，进样量为5μl，柱温为40℃；洗脱梯度为：每次进样前用初始流动相平衡8min，0～20min，5％～50％b；20～27min，50％～98％b；27～30min，98％b；30～30.1min，98％～5％b。上述百分含量均为质量百分含量。
质谱条件：
离子源为电喷雾(electrosprayionization,esi)源；采用正、负离子检测模式；扫描模式为全扫描；扫描范围:m/z150～1000；分辨率:60000；喷雾电压：3.5kv(正离子模式)，-3kv(负离子模式)；鞘气:0.24mpa；辅助气:0.10mpa；离子源温度:350℃(正离子模式)，380℃(负离子模式)。
数据处理：
获得正、负离子检测模式下的uhplc-(±)esi-ms谱后，采用数据格式转换软件msconvert将原始数据(.raw格式)转换成为mzxml格式文件，并导入开源数据处理软件xcms进行峰识别、峰对齐、峰填充及峰过滤，最终获得包括质荷比(m/z)、保留时间(retentiontime)及其峰面积的二维数据阵。然后，将上述获得的二维数据阵导入simca-p(version12.0,umetricsab,
方法学验证：
1、仪器精密度
取新疆一枝蒿花的冻干粉末，如2.2.1节的方法制作提取液，对同一样品连续进样6次，计算一枝蒿酮酸、异槲皮苷、芦丁、紫花牡荆素、洋艾素、金合欢素、蒙花苷、刺槐素8个内源性代谢物峰面积的rsd，对仪器精密度进行考察。
2、方法精密度
同一天内平行制备提取液6份，计算不同时间洗脱的8个内源性代谢物峰面积的rsd，评估方法的批内精密度；三天内连续制备18份提取液，计算上述8个内源性代谢物峰面积的rsd，评估方法的批间精密度。
二、实验结果与讨论
1、提取溶剂的选择及其比例的优化结果：
为覆盖更广极性范围的代谢物，在文献调查的基础上[19]，本研究首先比较了甲醇-水(95:5；80:20；50:50，v/v)、乙腈-水(95:5；80:20；50:50，v/v)、乙酸乙酯-水(95:5；80:20；50:50，v/v)、甲醇-氯仿-水(90:5:5；80:10:10；60:20:20，v/v)作为提取溶剂时的提取效果。获得的原始谱图数据，经格式转化及xcms软件进行预处理后，各提取溶剂体系获得的色谱峰数目如图1所示。结果显示，80:20甲醇-水(v/v)提取得到6985个色谱峰，相同溶剂类型下此比例获得峰数目最多；同理，80:20乙腈-水(v/v)提取得到6561个色谱峰，95:5乙酸乙酯-水(v/v)提取得到5284个色谱峰，60:20:20甲醇-氯仿-水(v/v)提取得到7541个色谱峰，分别为各类型提取溶剂的最佳比例。通过不同提取溶剂体系进行比较表明，60:20:20甲醇-氯仿-水(v/v)提取的离子峰数目最多，其次为80:20甲醇-水(v/v)。
进一步使用simca-p软件对各提取溶剂获得的二维数据阵进行pca分析。结果如图2所示，正、负离子检测模式下，甲醇-水与甲醇-氯仿-水之间分组不明显，而二者与乙腈-水、乙酸乙酯-水之间分组明显，表明使用甲醇-氯仿-水作为提取溶剂时获得的整体代谢组信息与甲醇-水相似，与乙腈-水、乙酸乙酯-水差异较大，考虑到所采用溶剂的环保性，尽管甲醇-氯仿-水提取的色谱峰数目最多，本研究最终采用80:20甲醇-水(v/v)代替60:20:20甲醇-氯仿-水(v/v)作为提取溶剂。
2、超声时间的选择结果：
本发明在代谢物提取过程中采用超声进行辅助提取，考察了超声0min、10min、20min、30min对提取效果造成的影响，比较了各超声条件下获得的色谱峰数目。结果显示，超声0min、10min、20min、30min时，可分别提取6347、6349、6146、6479个色谱峰，表明超声30min提取的色谱峰数目最多，但差别不大。为避免提取过程中热量的产生使代谢物信息发生改变，实验不仅需要在冰浴条件下进行提取，超声时间也不应过长。综合以上所述因素，最终选择适宜的超声时间为10min。
3、复溶溶剂比例的优化结果
在复溶溶剂的选择中，为尽量避免造成峰展宽、峰分叉现象的溶剂效应，选择了与流动相匹配的乙腈-水为复溶溶剂，并在此基础上优化有机相比例，考察了乙腈-水的体积比分别为5:95、20:80、50:50、80:20时的提取效果。结果如图3所示，正、负离子模式下50:50乙腈/水(v/v)分别检测到3669和2744个色谱峰，在各比例中数目最多。因此，最终选择复溶溶剂为50:50乙腈-水(v/v)。
4、色谱与质谱条件的优化结果
色谱条件的优化：选用超高效c18色谱柱，考察乙腈-水、甲醇-水等流动相体系及其比例、进样体积、流速、梯度洗脱程序、柱温等对色谱分离的影响。结果显示，甲醇-水为流动相时，弱极性部分的分离效果不如乙腈-水，同时甲酸的加入有利于抑制峰拖尾现象，因此选择乙腈(含0.1％甲酸)-水(含0.1％甲酸)为流动相；优化后的总离子流色谱图(totalionchromatograms,tics)如图4所示，在进样量为5μl，流速为0.3ml/min，梯度洗脱时间为30min，柱温为40℃的条件下，各色谱峰的分离效果良好。
质谱条件的优化：选择一枝蒿酮酸、芦丁、紫花牡荆素、异槲皮苷、金合欢素、刺槐素、蒙花苷和洋艾素等8种对照品的混合溶液，采用蠕动泵直接进样进行分析，以分子离子峰强度较高为判断标准，最终优化后的条件如下：喷雾电压：3.5kv(正离子模式)，-3kv(负离子模式)；鞘气:0.24mpa；辅助气:0.10mpa；离子源温度:350℃(正离子模式)，380℃(负离子模式)。
5、方法学验证
采用上述建立的前处理方法和uhplc-(±)esi-ms分析方法，针对人工栽培品种的新疆一枝蒿样品中上述8个已知内源性代谢物的分析检测情况进行了系统考察，结果如表1所示。
表1正、负离子检测模式下仪器精密度和方法精密度的考察结果
*esi(+)表示化合物的阳离子模式；esi(-)表示化合物的阴离子模式；
rt表示每个化合物的相对保留时间；
—表示化合物未被检测到。
仪器精密度考察结果显示，正、负离子模式下各代谢物提取离子流峰面积的rsd均小于6.3％，表明仪器精密度良好。
方法精密度考察结果显示，8个代谢物提取离子流峰面积的批内rsd和批间rsd分别小于11.8％和14.7％，表明方法精密度良好；连续测定3天，各代谢物保留时间的rsd在0.5％之内，说明色谱系统稳定性良好。综上所述，在仪器精密度良好的前提条件下，本研究建立的分析方法精密度、稳定性良好，可用于新疆一枝蒿植物样本的分析。
6、新疆一枝蒿不同组织器官的代谢组学研究
采用建立的lc-ms/ms代谢组学方法分析了新疆一枝蒿根、茎、枝、叶、花不同组织器官的代谢组。由各组织器官的二维数据阵构建pca模型得分图，如图5所示。结果表明，正、负离子检测模式下，各组之间具有明显的分组趋势，表明各组织器官的代谢组有显着差异，尤其是花与其它组织器官之间的差异最为明显。
为了获得各组间最大程度的分组，筛选出可靠的差异变量，进一步构建有监督的opls-da模型，选取对分组有贡献的变量(vip>1)，采用带有jack-knifed置信区间的载荷图及原始轮廓图进行筛选去除变异较大、组间交差严重的变量，并对两组独立样本进行t检验，选择p<0.05的变量；运用pearson相关性分析进一步筛除加合离子、同位素离子及碎片离子。最终筛选到的差异变量数、变化倍数>10的差异变量数如表2所示。该分析结果表明，相比于传统植物化学的分离分析方法，本研究建立的lc-ms/ms代谢组学分析方法获得了更为全面的成分信息，充分展现了该方法全面、高效、快速的特点。
表2lc-ms/ms代谢组学方法获得的花与根、茎、枝、叶之间的差异代谢物数目
*esi(+)表示化合物的阳离子模式；esi(-)表示化合物的阴离子模式。
进一步根据差异代谢物的高分辨质谱及ms/ms谱数据，结合代谢物数据库metlin(http://metlin.scripps.edu)检索，对上述组间变化倍数大于10的差异代谢物结构类别进行了分析。以黄酮类化合物为例：黄酮类化合物包括黄酮、异黄酮、黄酮醇、异黄酮醇、黄烷酮、异黄烷酮和查耳酮等多种苷元结构类型以及黄酮氧苷、碳苷等异构体形式的糖苷类化合物，且质谱裂解行为具有明显规律。比较分析表明，相比于正离子检测模式，黄酮苷类化合物在负离子检测模式下灵敏度更高，其酚羟基失去质子产生[m-h]-离子，[m-h]-的(-)esi-ms/ms谱易丢失糖基产生苷元离子(y0-)与自由基苷元离子([y0-h]-·)。例如，黄酮醇o-糖苷类化合物，b环为单羟基取代时，易产生m/z285.0398(y0-)、m/z284.0321([y0-h]-·)；b环为双羟基取代时，易产生m/z301.0347(y0-)、m/z300.0269([y0-h]-·)。采用该方法共分析判别出61个黄酮类化合物。同理，结合其它类化合物的裂解规律与数据库检索，最终判别出97个一枝蒿酮酸衍生物、7个绿原酸类化合物以及15个其它类型化合物。
进一步采用聚类热图分析，对上述180个差异代谢物在不同组织器官的分布情况进行表征，结果如图6所示。由图6可知，第一，盛花期人工栽培品种新疆一枝蒿中绝大部分黄酮类和绿原酸类化合物在花中含量最高，提示这些化合物可能主要是在花中合成；第二，绝大部分倍半萜类化合物在花或叶中含量较高，表明花与叶可能是此类化合物的生物合成或积累部位。其中，新疆一枝蒿的特征有效成分“一枝蒿酮酸”在花中含量最高，在叶、枝、茎、根中依次降低，这与文献报道的结论一致，该结果也表明本方法的可靠性。新疆一枝蒿为全草入药，黄酮类和倍半萜类化合物是主要活性成分，通过建立的代谢组学分析方法获得的物质分布特征表明，花与叶中其有效成分含量较高，本发明为新疆一枝蒿有效部位的合理利用提供了重要依据。