一种肌钙蛋白I的胶乳增强免疫比浊检测试剂盒的制作方法

本公开渉及医学、免疫和体外诊断领域，具体渉及一种用免疫透射比浊法检测肌钙蛋白I的试剂盒。
背景技术：
：心肌肌钙蛋白I(cTnI)是心肌肌钙蛋白(cTn)的三种亚基之一，另外两种亚基分别为心肌肌钙蛋白T(cTnT)和肌钙蛋白C(TnC)。cTnI约由209个氨基酸残基组成，分子量23.9kD，等电点9.87，是一种富含α螺旋的蛋白质。cTnI仅3-6％以游离形式存在于细胞质中，绝大部分以复合物的形式存在于细肌丝上。当心肌损伤后，心肌肌钙蛋白复合物释放到血液中，4-6小时后，开始在血液中升高，升高的肌钙蛋白I能在血液中保持6-10天。在这些与肌细胞收缩有关的蛋白质中，肌钙蛋白I具有高度心肌特异性和灵敏度，是唯一不同于骨骼肌中发现的肌钙蛋白I。因而被广泛地研究作为心肌损伤的敏感的和特异的标志物。目前心肌肌钙蛋白I的检测方法较多，如胶体金法、免疫荧光法、酶联免疫法、化学发光法、电化学发光法、胶乳增强免疫比浊法等。胶体金法的缺点在于无法准确进行定量，且批间差异较大，无法持续监控患者肌钙蛋白I的水平；免疫荧光法反应时间较长，对环境要求较高，容易受空气尘埃影响，且多为96人份/盒，使用稀土标记物等缺点也使得此免疫方法无法大规模使用；酶联免疫法操作简便但灵敏度低；化学发光法对仪器要求高且试剂成本高，检测速度相对较慢，普及率低；胶乳增强免疫比浊法试剂应用方便，成本低，自动化强，方便医院推广，但这种试剂多采用多抗制备，灵敏度低，零值负值、以及批间差异大等问题，也给临床应用带来很大的困扰。患者体内存在的类风湿因子(RF)能干扰许多免疫学检测方法。IgM型RF和IgG型RF与检测试剂中的捕获抗体及标记二抗的Fc结合，导致检测假阳性结果。RF对不同检测方法的干扰程度不同，影响程度并不与RF浓度成正比。目前，在临床中使用的检测试剂大多没有很好地采取防止RF干扰的措施(类风湿因子对免疫测定干扰的研究进展，医学综述2015年Vol21，19：3495)。目前，防止RF干扰的策略包括：对于捕获抗体，用F(ab’)2片段替代完整的IgG；待测样本用连接有热变性IgG的固相吸附剂进行预处理(Euroimmune公司)，4℃过夜离心后再检测；检测抗原时，可以用2-巯基乙醇加入到样本稀释液或样本中，使IgM型RF降解。例如，在CN102539784A中公开了一种检测心肌肌钙蛋白I的方法及其检测试剂盒。该试剂盒包括试剂1、试剂2，其中试剂1为缓冲液，试剂2由偶联抗体组合物的聚苯乙烯胶乳颗粒、缓冲液组成。所述缓冲液为PBS缓冲液、Tris缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、柠檬酸磷酸盐缓冲液、碳酸盐碳酸氢盐缓冲液、2-吗啉乙磺酸缓冲液、氯化铵缓冲液中的一种或几种。该试剂盒中采用至少3种以上抗体的组合物，尽可能地满足了高精度cTnI检测抗体所需条件，均衡了抗体对各种测定影响因素的敏感性，可以最小化阴性或阳性干扰，增加了测定方法的精确度；同时，还采用定向偶联法将cTnI抗体包被到胶乳颗粒上，抗体偶联部位为Fc片段，使抗原结合位点指向流动相，不会发生抗体结合力损失的情况；除此之外，由于化学偶联过程中Fc片段发生了结构上的改变，减少了RF和嗜异性抗体的干扰。本领域仍然需要一种灵敏度高、抗干扰性能好的心肌肌钙蛋白I试剂盒。技术实现要素：根据一些实施方案，提供了一种肌钙蛋白I的检测试剂盒，其包含第一试剂和第二试剂。在一些实施方案中，第一试剂包含：在一些实施方案中，所述第二试剂包含：在一些实施方案中，缓冲液选自：甘氨酸缓冲液、Tris缓冲液、MOPS缓冲液、MES缓冲液、Hepes缓冲液。在一些实施方案中，所述第一试剂和所述第二试剂中的缓冲液是相同的或不同的。在一些实施方案中，所述第一试剂和所述第二试剂中的缓冲液是50mM至100mM甘氨酸缓冲液。在一些实施方案中，所述电解质选自：氯化钠、氯化钾、氯化镁、硫酸镁、氯化锌、氯化钙。在一些实施方案中，所述稳定剂选自以下的一种或组合：甘露糖、葡萄糖、壳聚糖、山梨醇、牛血清白蛋白、海藻糖、果糖、蔗糖。在一些实施方案中，所述表面活性剂选自：Triton、Tween20、Tween80、NP40、thesit、BrijL2；优选地Tween80。在一些实施方案中，所述离散剂选自：硫氰酸钾、氯化胆碱。在一些实施方案中，所述防腐剂选自：叠氮钠、苯酚、对羟基苯甲酸、PC300。在一些实施方案中，所述单克隆抗体源自：鼠、兔或禽。在一些实施方案中，所述阻断剂选自：小鼠IgG、小鼠IgM、小鼠血清。在一些具体的实施方案中，所述阻断剂是小鼠IgM。在一些具体的实施方案中，所述阻断剂是小鼠抗人IgM单克隆抗体。不希望限于具体的理论限制，然而可以理解为，本申请的发明人出乎意料地发现非特异性抗体(如小鼠IgG、小鼠IgM、小鼠血清)对RF具有亲和性，从而阻断RF，以避免假阳性。在一些具体的实施方案中，所述表面活性剂是10g/L至20g/LTween80。在一些具体的实施方案中，所述胶乳颗粒是聚苯乙烯胶乳颗粒，表面修饰基团是羧基。在一些具体的实施方案中，所述阻断剂的浓度是12g/L至18g/L，优选15g/L。在另一些具体的实施方案中，抗人肌钙蛋白I单克隆抗体包含两种不同的鼠源抗人肌钙蛋白I单克隆抗体，分别识别人肌钙蛋白I的不同表位(表位aa60-90以及aa20-40)。在一些具体的实施方案中，两种不同的抗人肌钙蛋白I单克隆抗体的物质的量的比是2：1。在一些具体的实施方案中，本申请的检测试剂盒还包含校准品或质控品。校准品或质控品可以自行配制也可以是市售的。根据一些实施方案，提供了一种肌钙蛋白I的检测试剂盒，其包含第一试剂和第二试剂；其中，所述第一试剂包含：所述第二试剂包含：所述阻断剂是纯化的小鼠抗人IgM单克隆抗体。根据一些实施方案，还提供了阻断剂在抗干扰中的用途。所述阻断剂选自以下的一种或组合：小鼠IgG、小鼠IgM、小鼠血清。在一些实施方案中，提供了纯化的小鼠抗人IgM单克隆抗体在改善肌钙蛋白I检测中抗干扰能力的用途。优选地，干扰是指类风湿因子的干扰；更具体地，干扰是指由于类风湿因子的干扰而导致的肌钙蛋白I检测结果假阳性。根据一些实施方案，还提供了纯化的小鼠抗人IgM单克隆抗体在改善肌钙蛋白I检测的假阳性结果中的用途。根据一些实施方案，还提供了一种改善肌钙蛋白I检测中抗干扰能力的方法，包括步骤：在肌钙蛋白I检测试剂中引入阻断剂，所述阻断剂选自以下的一种或组合：小鼠IgG、小鼠IgM、小鼠血清。根据一些实施方案，还提供了一种改善肌钙蛋白I检测中假阳性的方法，包括步骤：在肌钙蛋白I检测试剂中引入阻断剂，所述阻断剂选自以下的一种或组合：小鼠IgG、小鼠IgM、小鼠血清。在一些实施方案中，肌钙蛋白I检测试剂是指胶乳增强免疫比浊检测试剂。根据一些实施方案，还提供了阻断剂和表面活性剂的组合在改善肌钙蛋白I检测中抗干扰能力的用途。所述阻断剂选自以下的一种或组合：小鼠IgG、小鼠IgM、小鼠血清；且所述表面活性剂是Tween80。在一些实施方案中，抗干扰能力选自以下的一种或组合：抗RF干扰、抗结合胆红素干扰、抗维生素C干扰、抗Intralipid脂肪乳剂干扰、抗肝素钠干扰、抗血红蛋白干扰。在一些实施方案中，阻断剂和表面活性剂在同一试剂中的质量比为3：2。附图说明图1：本公开肌钙蛋白I试剂盒标准曲线。具体实施方式实施例1：本申请的试剂盒的制备1.第一试剂制备过程如下：第一试剂包含室温条件下，按照上述进行第一试剂的配制，所述阻断剂是纯化的小鼠抗人IgM单抗(购自美国加州ScantibodiesLaboratoryInc.9336AbrahamWay，Santee，92071，货号3KC542；纯度大于95％)。2.第二试剂制备过程如下：将0.5ml直径300nm的聚苯乙烯胶乳溶液(浓度10％)加入4.5ml0.05MMES(PH6.0)和100μlEDC(碳化二亚胺，浓度5mg/mL)，于37℃静置1小时；肌钙蛋白I单克隆抗体用5ml0.05MTris缓冲液(PH7.5)稀释后立即加入到上述缓冲液中，在37℃反应2小时；加入1ml0.1M甘氨酸缓冲液(PH7.0)搅拌1小时终止反应；用20ml100mM的甘氨酸缓冲液(PH7.0)洗涤，离心去上清，洗涤3次；用保存缓冲液重悬胶乳微球使之分散成白色胶乳悬浮液；第二试剂中肌钙蛋白I单克隆抗体包被的聚苯乙烯胶乳颗粒浓度为0.25％(％表示g/100ml)；抗体在第二试剂中的浓度是0.08g/L。其中，所述保存缓冲液的组成：作为一个更加优选的示例：第二试剂中的单克隆抗体可以不止一种单克隆抗体，例如两种或更多种单克隆抗体，其分别识别肌钙蛋白I的不同位点(不同单克隆抗体的包被方法也按上述步骤进行)。在一个实例中，两种单抗的质量比(或物质的量比)是2:1，分别识别肌钙蛋白I的表位aa60-90以及aa20-40。实施例2：对照试剂盒的制备制备方法同实施例1的方法，差别仅在于将单克隆抗体替换成多克隆抗体。实施例3.表面活性剂的比较按照实施例1的方法制备试剂盒，差别仅在于：将第一试剂中的Tween80替换成下表中各种不同浓度的各表面活性剂；并分别测试不同浓度的标准品，结果如下。表1.表面活性剂的比较S1-S6的数据是定标反应吸光度，反应梯度(即斜率)越大，空白反应吸光度(即S1反应吸光度)越低越好。从结果可以看出，Tween80为10g/L时效果最好，20g/LTween80时次之。实施例4.表面活性剂对抗干扰能力的影响按照实施例1的方法制备试剂盒，步骤差别仅在于以下：将Tween80替换成下表所示的各种不同浓度的不同表面活性剂。用制备的各个试剂盒测试含有或者不含干扰物(DB(结合胆红素，也称为直接胆红素)、Vc、Intralipid脂肪乳剂、肝素钠、血红蛋白)的样本。结果如下：表2.表面活性剂对抗干扰能力的影响从结果可以看出，当试剂加入10g/LTween80抗干扰效果更好；8g/L的Tween80次之。实施例5.不同阻断剂的比较按照实施例1的方法制备试剂盒，步骤差别仅在于不含阻断剂。用制备的各个试剂盒测试含有或者不含RF的样本。结果如下：表3.不同阻断剂的比较从数据可以看出，含有阻断剂时明显具有抗RF干扰效果，且对特异性吸光度影响相对较小。实施例6.确定阻断剂的浓度按照实施例1的方法制备试剂盒，步骤差别仅在于阻断剂浓度不同(见下表)。用制备的各个试剂盒测试含有或者不含RF的样本。结果如下：表4.不同阻断剂浓度的比较从结果可以看出，阻断剂最优用量是15g/L，18g/L次之。实施例7.阻断剂对定标的影响按照实施例1的方法制备试剂盒，步骤差别仅在于无阻断剂。用制备的各个试剂盒测试不同浓度的标准品。结果如下：表5.有无阻断剂的比较定标曲线的拟合度越小，说明曲线拟合越好。实施例8.阻断剂改善假阳性按照实施例7的方法分别制备含有或不含有阻断剂的试剂盒，并用各试剂盒分别测试假阳性样本，以及常规样本(即真阳性和真阴性样本)。西门子测值为阴性或者测值较低的样本，本申请试剂如果不添加阻断剂，个别样本会出现极高值，如下表所示，加入阻断剂之后假阳性有显著改善。表6.有无阻断剂的比较表7.有无阻断剂的比较结果表明，加入阻断剂纠正了假阳性问题，对真阳性和真阴性样本的测值无统计学显著影响。实施例9.批间差比较实验方法：按下表实验参数表进行试验，实施例1(涉及两种单抗时)取3批试剂，实施例2取2批试剂(目前仅有2批抗体)，定标并检测10例样本。表8.实验参数表R1:R2:S150:50:15副/主波长无/600读点19-34定标类型spline反应方向递增点(point)/跨距点(spanpoint)6/3表10.实施例1试剂盒定标结果表11.实施例2试剂盒定标结果表12.10例样本检测结果的比较从定标结果和样本检测结果都能明显看出，实施例1(本公开)可以改善多抗肌钙蛋白I胶乳增强免疫比浊试剂存在的批间差问题，而实施例2定标结果和样本检测结果都存在明显差异。实施例10.重复性实验方法：用本申请实施例1的试剂盒(涉及采用两种单抗时)检测低值样本和高值样本，重复测试10次，计算均值和变异系数。表13.重复性实验结果测序低浓度样本高浓度样本11.1474.79421.1494.7131.1934.72241.1474.81151.1864.78961.2014.78471.1344.46181.1284.75691.1954.732101.0954.747均值1.15754.7306SD0.0350.100CV3.02％2.12％上表显示低浓度样本和高浓度样本的CV分别为3.02％和2.12％，结果表明本公开测值重复性良好。实施例11.加速稳定性实验方法：将本申请实施例1的试剂放入37℃温箱进行加速处理7天，比较加速前后定标反应信号及样本测值的变化。表14.加速处理前后定标反应信号表15.加速处理前后样本测值的变化样本号加速前加速后11.651.6522.172.1932.222.1741.611.6051.551.5961.972.0670.851.09810.3610.58911.3711.05105.004.47当前第1页1 2 3