本发明属于食品检测方法技术领域，具体涉及一种核磁共振氢谱结合气相色谱外标法检测食用油氧化产物的方法。
背景技术：
油脂和含油脂的食品是人类重要的营养和能量来源，油脂氧化酸败不但导致食物失去原有的风味，而且造成有益脂肪酸和微量营养物的严重损失，伴随产生的特定氧化产物甚至会危害人体健康。表征食用油氧化产物的指标包括脂肪酸组成、环氧化物、醇类、醛类等，其中环氧化物、醇类、醛类等需采用气相色谱质谱联用的方法检测，需消耗大量有机溶剂，预处理耗时，操作繁琐。因此，迫切需要一种更为快捷且可靠的食用油氧化产物的检测方法。
核磁共振氢谱法检测食用油品质，具备测试速度快、成本低廉、重现性好的优点。现有应用核磁共振氢谱法检测食用油氧化产物的方法为：以nmr方法检测待测油脂样品→nmr检测所得亚麻酸、亚油酸、油酸、环氧、醛类、酮类相应信号为分子，以nmr方法检测所得甘油基亚甲基氢积分为分母→计算得亚麻酸、亚油酸、油酸、环氧、醛类、酮类的相对浓度。
以亚麻酸含量检测为例，专利cn102636510b论述了利用核磁共振氢谱检测食用油脂中亚油酸含量的方法，计算公式为亚麻酸含量＝[4*(ch＝ch-ch2-ch3亚麻酸链的氢的积分)]/[3*(ch2-cooh所有脂肪酸链的氢的积分)]，公式以链接酯键的亚甲基基团的氢为分母，然而一旦油脂氧化酸败严重，生成的醛类和环氧化物都会干扰分母中的氢含量，造成计算结果与真值的严重偏差。随着核磁共振检测仪器灵敏度的提高，martinez-yustaa和guilenmd提出新的计算公式，亚麻酸含量＝亚麻酸甘油酯中3个烯键之间的亚甲基氢/甘油基中的亚甲基氢(martinez-yustaa,guilenmd.monitoringcompositionalchangesinsunfloweroil-deriveddeep-fryingmediaby1hnuclearmagneticresonance[j].europeanjournaloflipidscience&technology,2016,118(7):984-996.)，公式以甘油基中的亚甲基氢为分母，但公式仅适用于油脂中甘一酯和甘二酯含量极少的情况下，油脂氧化过程中此类干扰物质大量生成，计算结果依旧严重偏离。因此，仅现有的核磁共振氢谱检测食用油氧化产物，由于大量干扰物质的生成，计算公式受到严重干扰，造成计算结果不可靠。
因此，如何测得亚麻酸、亚油酸、油酸、环氧、醛类、酮类物质的绝对浓度、并且排除油脂氧化酸败严重时对检测结果造成的干扰，得到准确的绝对浓度，是本领域有待解决的技术问题。
技术实现要素：
本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
鉴于上述的技术缺陷，提出了本发明。
因此，本发明克服现有技术中存在的不足，提供一种核磁共振氢谱结合气相色谱外标法检测食用油氧化产物的方法。
为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种核磁共振氢谱结合气相色谱外标法检测食用油氧化产物的方法，其包括，
绘制氧化产物的标准曲线：制备纯化的食用油；制备标准样品，以气相色谱和核磁共振方法检测标准样品，依据实验结果计算得校正后的甘油基的亚甲基的响应信号ah；向纯化食用油添加环氧化物、醇类和醛类物质纯品，制备不同梯度标准样品，以核磁共振方法测得环氧、醇类和醛类的响应信号，求得环氧、醇类和醛类校正后的核磁共振响应信号；以校正后的物质核磁共振响应信号为纵坐标，以环氧化物、醇类和醛类的绝对浓度为横坐标，绘制环氧、醇类和醛类物质的核磁共振检测标准曲线；
待测样品检测：量取待测油脂样品，通过高场核磁共振仪采集样品的氢谱数据，积分氢谱各目标峰；以气相色谱方法确定待测样品的亚麻酸、亚油酸和/或油酸含量；
氧化产物绝对浓度的确定：对比气相色谱和核磁共振方法所得亚麻酸、亚油酸和/或油酸数据，依据实验结果计算得校正后的甘油基的亚甲基的响应信号ah；求得环氧化物、醇类和醛类校正后的核磁共振响应信号，检索标准曲线，确定油脂中氧化产物的绝对浓度。
作为本发明所述核磁共振氢谱结合气相色谱外标法检测食用油氧化产物的方法的优选方案：所述制备纯化的食用油，其中，将氧化铝在110℃加热6h及再在210℃加热10h，以正己烷溶剂将250g活性氧化铝装填于40×2.5cm的玻璃柱，将50ml油脂溶解于50ml正己烷溶剂注入色谱柱，并以100ml正己烷洗脱，除去溶剂，得到纯化的食用油。
作为本发明所述核磁共振氢谱结合气相色谱外标法检测食用油氧化产物的方法的优选方案：所述计算得校正后的甘油基的亚甲基的响应信号ah，校正公式为：
校正后的ah＝ad/(3*气相色谱测得的亚麻酸含量)；
校正后的ah＝2ac/(3*气相色谱测得的亚油酸含量)；
校正后的ah＝(aa-2ac-ad)/(3*气相色谱测得的油酸含量)。
作为本发明所述核磁共振氢谱结合气相色谱外标法检测食用油氧化产物的方法的优选方案：所述环氧化物，包括反-9，10-环氧化物、顺-9，10-环氧化物；所述醇类，包括仲醇、伯醇；所述醛类，包括反-2-烯醛、反，反-2，4-二烯醛、4，5-环氧化-2-烯醛、4-羟基-反-2-烯醛、顺，反-2，4-二烯醛、n-烷醛和4-氧代-烷醛。
作为本发明所述核磁共振氢谱结合气相色谱外标法检测食用油氧化产物的方法的优选方案：所述环氧化物、醇类和醛类的核磁共振氢谱响应信号计算公式分别为：
反-9，10-环氧化物的响应信号＝ab/校正后的ah；
顺-9，10-环氧化物的响应信号＝ae/校正后的ah；
仲醇的响应信号＝2af/校正后的ah；
伯醇的响应信号＝ag/校正后的ah；
反-2-烯醛的响应信号＝2ai/校正后的ah；
反，反-2，4-二烯醛的响应信号＝2aj/校正后的ah；
4，5-环氧化-2-烯醛的响应信号＝2ak/校正后的ah；
4-羟基-反-2-烯醛的响应信号＝2al/校正后的ah；
顺，反-2，4-二烯醛的响应信号＝2am/校正后的ah；
n-烷醛的响应信号＝2an/校正后的ah；
4-氧代-烷醛的响应信号＝2ao/校正后的ah；
其中，所述aa、ab、ac、ad、ae、af、ag、ah、ai、aj、ak、al、am、an、ao分别对应化学位移1.94～2.14ppm、2.63ppm、2.77ppm、2.80ppm、2.88ppm、3.54～3.59ppm、3.62ppm、4.10～4.32ppm、9.49ppm、9.52ppm、9.55ppm、9.58ppm、9.60ppm、9.75ppm、9.78ppm的氢谱积分面积。
作为本发明所述核磁共振氢谱结合气相色谱外标法检测食用油氧化产物的方法的优选方案：所述绘制氧化产物的标准曲线，以校正后的核磁共振氢谱响应信号作纵坐标y，以环氧、醇类和醛类的绝对浓度为横坐标x，计算得标准曲线y＝k*x+b，其中k和b为标准曲线参数。
作为本发明所述核磁共振氢谱结合气相色谱外标法检测食用油氧化产物的方法的优选方案：所述氧化产物绝对浓度的确定，其中所述计算得校正后的甘油基的亚甲基的响应信号ah，其公式为：
校正后的ah＝ad/(3*气相色谱测得的亚麻酸含量)；
校正后的ah＝2ac/(3*气相色谱测得的亚油酸含量)；
校正后的ah＝(aa-2ac-ad)/(3*气相色谱测得的油酸含量)；
使用三者的平均值，作为后续计算的ah值；
作为本发明所述核磁共振氢谱结合气相色谱外标法检测食用油氧化产物的方法的优选方案：所述环氧化物、醇类和醛类的核磁共振氢谱响应信号计算公式分别为：
反-9，10-环氧化物的响应信号＝ab/校正后的ah；
顺-9，10-环氧化物的响应信号＝ae/校正后的ah；
仲醇的响应信号＝2af/校正后的ah；
伯醇的响应信号＝ag/校正后的ah；
反-2-烯醛的响应信号＝2ai/校正后的ah；
反，反-2，4-二烯醛的响应信号＝2aj/校正后的ah；
4，5-环氧化-2-烯醛的响应信号＝2ak/校正后的ah；
4-羟基-反-2-烯醛的响应信号＝2al/校正后的ah；
顺，反-2，4-二烯醛的响应信号＝2am/校正后的ah；
n-烷醛的响应信号＝2an/校正后的ah；
4-氧代-烷醛的响应信号＝2ao/校正后的ah；
作为本发明所述核磁共振氢谱结合气相色谱外标法检测食用油氧化产物的方法的优选方案：所述aa、ab、ac、ad、ae、af、ag、ah、ai、aj、ak、al、am、an、ao分别对应化学位移1.94～2.14ppm、2.63ppm、2.77ppm、2.80ppm、2.88ppm、3.54～3.59ppm、3.62ppm、4.10～4.32ppm、9.49ppm、9.52ppm、9.55ppm、9.58ppm、9.60ppm、9.75ppm、9.78ppm的氢谱积分面积。
作为本发明所述核磁共振氢谱结合气相色谱外标法检测食用油氧化产物的方法的优选方案：所述检索标准曲线，公式为：氧化产物浓度＝(核磁共振响应信号-b)/k，
其中，所述k和b为标准曲线对应的参数。
本发明的有益效果：本发明利用气相色谱检测的脂肪酸组成校正甘油基亚甲基的核磁共振信号，结合以纯化食用油为基底绘制的标准曲线，实现1次进样可得11种氧化产物绝对含量，具有样品需求少，测试速度快、准确度高、可实现绝对定量的优点，尤其适用于严重氧化油脂的品质监控，在食用油氧化评价、安全控制和货架期预测领域具有广泛应用前景。本发明的特点是：以纯化后的食用油为基底，排除基质干扰；样品用量极少，最多仅需100μl；1次进样可同时测得11种氧化产物绝对含量；准确度高、测试速度快、实现了食用油中环氧、醛类、酮类物质的绝对定量。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
图1为本发明方法的检测流程图。
图2为本发明改进前后对绘制标准曲线的影响。
图3为大豆油的核磁共振氢谱及a、b、c、d、e、f、g、h、i、j、k、l、m、n、i峰对应的信息采集图。
图4为四个加热后大豆油的核磁共振氢谱对比图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
本发明包括以下步骤：
1)绘制氧化产物的标准曲线：制备纯化的食用油；向纯化食用油添加亚麻酸、亚油酸、油酸纯品，制备不同梯度标准样品，以气相色谱和核磁共振方法检测标准样品，依据实验结果计算得校正后的甘油基的亚甲基的响应信号ah；向纯化食用油添加环氧、醇类和醛类物质纯品，制备不同梯度标准样品，以核磁共振方法测得环氧、醇类和醛类的响应信号，将上阶段求得的，校正后的ah值带入公式，求得环氧、醇类和醛类校正后的核磁共振响应信号；以校正后的物质核磁共振响应信号为纵坐标，以环氧、醇类和醛类的绝对浓度为横坐标，绘制2种环氧、2种醇类和7种醛类物质的核磁共振检测标准曲线；
2)待测样品检测：量取待测油脂样品，用氘代溶剂溶解样品后，转移到核磁管中，通过高场核磁共振仪采集样品的氢谱数据，积分氢谱各目标峰；以气相色谱方法确定待测样品的亚麻酸、亚油酸和油酸含量；
3)氧化产物绝对浓度的确定：对比气相色谱和核磁共振方法所得亚麻酸、亚油酸和油酸数据，依据实验结果计算得校正后的甘油基的亚甲基的响应信号ah；将上阶段求得的，校正后的ah值带入公式，求得环氧、醇类和醛类校正后的核磁共振响应信号，检索标准曲线，确定油脂中氧化产物的绝对浓度。
步骤1)纯化步骤为：将氧化铝在110℃加热6h及再在210℃加热10h后，以正己烷溶剂将250g活性氧化铝装填于40×2.5cm的玻璃柱，将50ml油脂溶解于50ml正己烷溶剂注入色谱柱，并以100ml正己烷洗脱，除去溶剂得纯化的食用油。
计算校正后的甘油基的亚甲基的响应信号ah的公式为：
校正后的ah＝ad/(3*气相色谱测得的亚麻酸含量)
校正后的ah＝2ac/(3*气相色谱测得的亚油酸含量)
校正后的ah＝(aa-2ac-ad)/(3*气相色谱测得的油酸含量)
使用三者的平均值，作为后续计算。
步骤1)中不同浓度梯度的标准物质，亚麻酸、亚油酸和油酸的浓度梯度为10％、20％、30％、40％、50％、60％和70％，环氧化物的梯度为0、100mmol/kg、200mmol/kg、300mmol/kg、400mmol/kg、500mmol/kg、600mmol/kg和700mmol/kg，两种醇类的梯度为0、100mmol/kg、200mmol/kg、300mmol/kg、400mmol/kg、500mmol/kg、600mmol/kg和700mmol/kg，七种醛类的梯度为0、100mmol/kg、200mmol/kg、300mmol/kg、400mmol/kg、500mmol/kg、600mmol/kg和700mmol/kg。
步骤1)中，2种环氧化物具体为反-9，10-环氧化物和顺-9，10-环氧化物，2种醇类具体为仲醇和伯醇，7种醛类具体为反-2-烯醛、反，反-2，4-二烯醛、4，5-环氧化-2-烯醛、4-羟基-反-2-烯醛、顺，反-2，4-二烯醛、n-烷醛和4-氧代-烷醛。
步骤1)中，2种环氧化物、2种醇类和7种醛类的核磁共振氢谱响应信号计算公式分别为：
反-9，10-环氧化物的响应信号＝ab/校正后的ah
顺-9，10-环氧化物的响应信号＝ae/校正后的ah
仲醇的响应信号＝2af/校正后的ah
伯醇的响应信号＝ag/校正后的ah
反-2-烯醛的响应信号＝2ai/校正后的ah
反，反-2，4-二烯醛的响应信号＝2aj/校正后的ah
4，5-环氧化-2-烯醛的响应信号＝2ak/校正后的ah
4-羟基-反-2-烯醛的响应信号＝2al/校正后的ah
顺，反-2，4-二烯醛的响应信号＝2am/校正后的ah
n-烷醛的响应信号＝2an/校正后的ah
4-氧代-烷醛的响应信号＝2ao/校正后的ah
其中：aa，ab，ac，ad，ae，af，ag，ah，ai，aj，ak，al，am，an，ao分别对应化学位移1.94～2.14ppm，2.63ppm，2.77ppm，2.80ppm，2.88ppm，3.54～3.59ppm，3.62ppm，4.10～4.32ppm，9.49ppm，9.52ppm，9.55ppm，9.58ppm，9.60ppm，9.75ppm，9.78ppm的氢谱积分面积。
步骤1)中标准曲线，以校正后的核磁共振氢谱响应信号作纵坐标y，以环氧、醇类和醛类的绝对浓度为横坐标x，计算得标准曲线y＝k*x+b，其中k和b为标准曲线参数。
步骤3)中计算校正后的甘油基的亚甲基的响应信号ah的公式为：
校正后的ah＝ad/(3*气相色谱测得的亚麻酸含量)
校正后的ah＝2ac/(3*气相色谱测得的亚油酸含量)
校正后的ah＝(aa-2ac-ad)/(3*气相色谱测得的油酸含量)
使用三者的平均值，作为后续计算。
步骤3)中2种环氧化物、2种醇类和7种醛类的核磁共振氢谱响应信号计算公式分别为：
反-9，10-环氧化物的响应信号＝ab/校正后的ah
顺-9，10-环氧化物的响应信号＝ae/校正后的ah
仲醇的响应信号＝2af/校正后的ah
伯醇的响应信号＝ag/校正后的ah
反-2-烯醛的响应信号＝2ai/校正后的ah
反，反-2，4-二烯醛的响应信号＝2aj/校正后的ah
4，5-环氧化-2-烯醛的响应信号＝2ak/校正后的ah
4-羟基-反-2-烯醛的响应信号＝2al/校正后的ah
顺，反-2，4-二烯醛的响应信号＝2am/校正后的ah
n-烷醛的响应信号＝2an/校正后的ah
4-氧代-烷醛的响应信号＝2ao/校正后的ah
其中：aa，ab，ac，ad，ae，af，ag，ah，ai，aj，ak，al，am，an，ao分别对应化学位移1.94～2.14ppm，2.63ppm，2.77ppm，2.80ppm，2.88ppm，3.54～3.59ppm，3.62ppm，4.10～4.32ppm，9.49ppm，9.52ppm，9.55ppm，9.58ppm，9.60ppm，9.75ppm，9.78ppm的氢谱积分面积。
步骤3)中，检索氧化产物的标准曲线公式为：
氧化产物浓度＝(核磁共振响应信号-b)/k
其中k和b为标准曲线对应的参数。
试验仪器和条件：
agilent7890气相色谱仪和brukeravance400核磁共振仪。
气相色谱测定油脂脂肪酸组成的方法，依据《gb/t17376动植物油脂脂肪酸甲酯制备》和《gb/t17377动植物油脂脂肪酸甲脂的气相色谱分析》。核磁共振仪采集参数，光谱宽度5000hz，松弛延迟3s，扫描次数64次，采集时间3.744s，脉冲宽度90°，总采集时间12min54s，温度25℃。频率400mhz，光谱宽度5000hz，松弛延迟3s，扫描次数64次，采集时间3.744s，脉冲宽度90°，总采集时间12min54s，温度25℃。
实施例1：
绘制氧化产物的标准曲线：制备纯化的食用油；向纯化食用油添加亚麻酸、亚油酸、油酸纯品，制备不同梯度标准样品，以气相色谱和核磁共振方法检测标准样品，依据实验结果计算得校正后的甘油基的亚甲基的响应信号ah；向纯化食用油添加环氧、醇类和醛类物质纯品，制备不同梯度标准样品，以核磁共振方法测得环氧、醇类和醛类的响应信号，将上阶段求得的，校正后的ah值带入公式，求得环氧、醇类和醛类校正后的核磁共振响应信号；以校正后的物质核磁共振响应信号为纵坐标，以环氧、醇类和醛类的绝对浓度为横坐标，绘制2种环氧、2种醇类和7种醛类物质的核磁共振检测标准曲线；标准曲线结果如表1所示。
表1标准曲线汇总
待测样品检测：大豆油样品，购于无锡本地超市，分别以120℃加热3.07h，以110℃加热5.87h，以105℃加热8.08h，以100℃加热11.80h，以90℃加热24.45h，量取待测油脂样品，50μl油样置于5mm直径的核磁管，以500μl氘化氯仿溶解，溶剂以0.03％四甲基甲硅烷(tms)作为零点内标，通过高场核磁共振仪采集样品的氢谱数据，积分氢谱各目标峰；以气相色谱方法确定待测样品的亚麻酸、亚油酸和油酸含量；
氧化产物绝对浓度的确定：对比气相色谱和核磁共振方法所得亚麻酸、亚油酸和油酸数据，依据实验结果计算得校正后的甘油基的亚甲基的响应信号ah；将上阶段求得的，校正后的ah值带入公式，求得环氧、醇类和醛类校正后的核磁共振响应信号，检索标准曲线，确定油脂中氧化产物的绝对浓度。
实施例2：
按照公式，计算得各氧化产物的含量，如表2所示。图1为图1为本发明方法的检测流程图。图2为本发明改进前后对绘制标准曲线的影响。图3为大豆油的核磁共振氢谱及a、b、c、d、e、f、g、h、i、j、k、l、m、n、i峰对应的信息采集图。图4为四个加热后大豆油的核磁共振氢谱对比图。
表2计算所得食用油中氧化产物含量
表3检测结果与真值的平均偏差(％)汇总
本发明利用气相色谱检测的脂肪酸组成校正甘油基亚甲基的核磁共振信号，结合以纯化食用油为基底绘制的标准曲线，实现1次进样可得11种氧化产物绝对含量，具有样品需求少，测试速度快、准确度高、可实现绝对定量的优点，尤其适用于严重氧化油脂的品质监控，在食用油氧化评价、安全控制和货架期预测领域具有广泛应用前景。本发明的特点是：以纯化后的食用油为基底，排除基质干扰；样品用量极少，最多仅需100μl；1次进样可同时测得11种氧化产物绝对含量；准确度高、测试速度快、实现了食用油中环氧、醛类、酮类物质的绝对定量。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。