一种以氮掺杂石墨烯量子点为基质的激光解吸离子化质谱分析方法与流程

本发明属于基质辅助激光解吸离子化质谱分析技术领域，特别涉及一种以氮掺杂石墨烯量子点为基质的激光解吸离子化质谱分析方法。

背景技术：

基质辅助激光解吸离子化质谱，英文名称为：matrix-assistedlaserdesorption/ionizationmassspectrometry，简写为maldims，是一种高通量、软电离的分析技术，为生物领域内提供了一种很好的分析方法，广泛应用于代谢组学和蛋白质组学中。在典型的maldims检测中，基质起着十分重要的作用，它吸收激光的能量传递给分析物，同时为分析物提供/剥夺离子或自由基等，帮助分析物解吸附和离子化。maldims在检测生物大分子方面有着优异的性能，比如：蛋白质、dna以及多糖[参见：harvey,d.j.massspectrum.rev.1999,18,349-450]等。但是maldims在检测小分子(分子量小于500da)存在着很多的限制，因为基于传统有机基质的质谱分析中，基质分子自身会在低质荷比区域产生很强的背景峰，使得谱图难以解析，并且会抑制目标分析物信号，干扰分析物检测鉴定。

为了解决这个难题，研究者使用各种纳米材料取代有机基质，降低基质分子本身的背景峰，例如金纳米颗粒、多孔硅、金属及其氧化物纳米粒子和碳基底材料等。其中石墨烯由于其具有良好的能量传导能力和较宽的光谱吸收，符合maldims基质的要求，在这一领域起到了十分关键的作用[参见：h.-w.tang,k.-m.ng,w.luandc.-m.che,analyticalchemistry,2009,81,4720-4729]。同时传统有机基质(如dhb等)，在检测时会与分析物形成不均一的结晶，降低了信号的重现性和检测的灵敏度，因此寻找一种解吸离子化效率高、分散性好、背景信号低的替代基质在maldims用于小分子检测方面尤为重要。

中国专利zl201410020300.6公开了一种具有选择性的用于小分子maldi-tofms检测的基质及其应用，该基质为氧化石墨烯接枝4-乙烯基苯硼酸，用于选择性识别含有顺式邻二羟基结构的小分子化合物；但该方法只能用于检测含有顺式邻二羟基结构的小分子化合物，待测物较为单一，普适性不足，且复合物存在不稳定的问题；此外，上述专利中的检测均在正离子模式下进行，在分析物检测时会出现多重碱金属加合峰，使得谱图复杂难以解析。

技术实现要素：

本发明解决现有技术中存在的上述技术问题，提供一种以氮掺杂石墨烯量子点为基质的激光解吸离子化质谱分析方法。

为解决上述问题，本发明的技术方案如下：

一种以氮掺杂石墨烯量子点为基质的激光解吸离子化质谱分析方法。

氮掺杂的石墨烯量子点(nitrogendopedgraphenequantumdots,ngqds)作为一种新型的碳纳米材料，尺寸小于10nm，具有良好的化学稳定性、导电性、量子尺寸效应等；ngqds保留了石墨烯的π共轭结构，掺杂引入的氮原子独特的电子结构可以作为电子转移和接受的载体，促进负离子模式下分析物解吸和离子化的过程中分析物的去质子化。

优选地，所述激光解吸离子化质谱分析方法在负离子模式下进行。

优选地，激光解吸离子化质谱分析方法包括以下步骤：在进样靶板上滴加氮掺杂的石墨烯量子点水溶液，待自然干燥后，再滴加目标分析物溶液，在室温下晾干，进行maldi-tofms检测。

优选地，所述氮掺杂的石墨烯量子点水溶液的浓度为0.2-1mg/ml。

优选地，所述目标分析物溶液的浓度为10pm-1mm。

优选地，所述氮掺杂的石墨烯量子点的合成方法包括以下步骤：

步骤1，将氧化石墨烯与三聚氰胺按1:10的质量比混合，研磨成灰色粉末，放入管式炉中；向管式炉中通入高纯氮气除去氧气，继续在缓慢稳定的氮气流中将管式炉以5℃/min的升温速度加热到800℃，反应30min，随后缓慢冷却至室温，制得氮掺杂的石墨烯；

步骤2，取步骤1制得的氮掺杂的石墨烯，加入浓硝酸和浓硫酸，放入微波炉中反应一段时间，冷却至室温后，调节溶液ph值至中性，透析纯化，制得氮掺杂的石墨烯量子点；其中，所述加入浓硝酸和浓硫酸的体积比为2:1，所述氮掺杂的石墨烯的加入量为：每3毫升混合酸溶液对应1毫克氮掺杂的石墨烯。

优选地，所述步骤2放入微波炉中的反应条件为：功率400w，反应3h。

优选地，所述氮掺杂的石墨烯量子点尺寸为3-7nm。

优选地，所述氮掺杂的石墨烯量子点在300-500nm有较强吸光度；在355nm处有很好的吸收。

相对于现有技术，本发明的优点如下，

与商业化的基质chca相比，本发明以氮掺杂石墨烯量子点为基质，在maldims负离子模式下可检测氨基酸、脂肪酸、碱基、抗癌药物等多种小分子化合物，目标分析物去质子化特征峰强信号强，而基质chca在相同条件下只检测到了自身背景峰，没有检测到分析物的特征峰；

传统的基质dhb在质谱检测时会形成针状的结晶，分布不均，形成饱和热点，信号的重现性差。微波高温切割后的氮掺杂石墨烯量子点粒径较小，具有良好的均一性和分散性，对该基质靶点采样分析时不会出现热点(“sweetspots”)，从而保证了信号的重现性；

不同于正离子模式下出现的多重碱金属加合峰，在负离子模式下只会出现分析物的去质子化峰，因而在检测多个分析物时，谱图简单，便于解析。氮掺杂的石墨烯量子点有着连续的π共轭结构，为高效激光吸收和能量转移奠定了基础，最关键的是掺杂引入的氮原子独特的电子结构可以促进负离子解吸离子化过程中分析物的去质子化，在负离子模式下，氮掺杂石墨烯中的吡啶氮可以促进电荷传递过程，产生更多的负离子，使得该基质在负离子模式检测中具有很大的优势，出现很强的信号峰，可以检测到多种不同类别的分析物，检测灵敏度高，具有很好的普适性。

附图说明

图1为本发明中涉及的ngqds扫描电镜图；

图2为本发明中涉及的ngqds电子能谱图；

图3为本发明中涉及的ngqds紫外吸收光谱；

图4为本发明中涉及的ngqds靶点图片；

图5为传统基质dhb的靶点图片；

图6为.maldi-tof在负离子模式下检测氨基酸，图a基质为chca，图b基质为ngqds；

图7为maldi-tof在负离子模式下检测饱和脂肪酸，图a基质为chca，图b基质为ngqds；

图8为maldi-tof在负离子模式下检测碱基，图a基质为chca，图b基质为ngqds

图9为maldi-tof在负离子模式下检测抗癌药物，图a为多柔比星,图b为伊马替尼,图c为达沙替尼；

图10为maldi-tof在负离子模式下检测10pm组氨酸。

具体实施方式

实施例1：

氮掺杂石墨烯量子点的制备

步骤一：合成氧化石墨烯(graphiteoxide，gto)，gto是由通过改进的hummer’s方法从天然石墨粉制备得到(hummers,w.s.,jr.；offeman,r.e.j.am.chem.soc.1958,80,1339)。

步骤二：合成氮掺杂的石墨烯(n-dopedgraphene，ng)，将原料50mggto和500mg三聚氰胺混合在同一个坩埚中，研磨成均匀的灰色粉末，放入管式炉中。通入高纯氮气30min除去氧气，继续在缓慢稳定的氮气流中将管式炉以5℃/min的升温速度加热到800℃，反应30min，随后缓慢冷却至室温。

步骤三：合成氮掺杂的石墨烯量子点，采用微波高温切割法合成ngqds，将10mg的ng放入装有20ml浓硝酸和10ml浓硫酸的250ml烧杯中，放入微波炉中反应3h，功率为400w，溶液冷却至室温后，使用氢氧化钠调节ph值到7左右，使用截留分子量为1000的透析袋，透析7天左右，最终得到的棕黄色溶液为ngqds，烘干，最终配为1mg/ml的溶液。

扫描显微镜来表征了所合成的ngqds材料的形貌特征，如图1所示，ngqds均匀分布在5nm左右，通过电子能谱图(图2)表示，合成的ngqd含有氮元素、氧元素、碳元素，表明氮元素已经成功的掺杂进去。通过扫描ngqds溶液的紫外吸收光谱(图3)，可以看到其在355nm处有较强的吸收，表明ngqds可以吸收maldims激光的能量，满足作为maldims基质的要求。通过靶点照片图3、图4可以看到，商业化的基质dhb在检测时，形成了针状的结晶，而ngqds在靶点上分布十分均一。

实施例2：

质谱分析的样品制备

实施例1制备的ngqds基质以1mg/ml的浓度溶解到水溶液中，chca基质以5mg/ml的浓度溶解在含有0.1％的tfa的乙腈和水(2：1，v/v)溶剂中。实验中所用的分析物组氨酸(his)、脯氨酸(pro)分别以10mm浓度溶解到水中作为储备液，色氨酸(trp)、酪氨酸(tyr)、天冬氨酸(asp)以10mm浓度溶解在水/甲酸(1：1，v/v)中作为储备液，做质谱检测时，用水稀释到0.5mm浓度。饱和脂肪酸c12、c14、c16、c18、c20以10mm浓度溶解到无水乙醇中作为储备液，做质谱检测时，用水稀释到1mm浓度。4种碱基胞嘧啶(c)、鸟嘌呤(g)、腺嘌呤(a)、胸腺嘧啶(t)，以10mm浓度溶于热水中，用水稀释到1mm用于质谱分析。

所有分析物都在4℃下保存待用。

实施例3：

质谱分析

本发明所使用的maldims型号为4800plusmaldi-tof/tof串联质谱(absciex)。质谱仪上装有脉冲nd:yag激光器，波长为355nm，在正、负离子模式下检测。调节激光范围(0％～100％)，以获得最优的分辨率和信噪比。每幅质谱图由16幅子图平均得到，每幅子图由25次激光脉冲得到的信号强度叠加而成。

实施例4：

maldi-tof质谱分析氨基酸

将5种氨基酸脯氨酸(mw115.13)、天冬氨酸(mw133.1)、组氨酸(mw155.00)、酪氨酸(mw181.20)、色氨酸(mw204.30)混合，配为0.5mm溶液。在质谱进样靶板上，滴加1ul基质，在空气中放置15min，形成一层均匀薄膜后，再滴加1ul的分析物溶液，进行maldi-tof检测。如图6a所示，在负离子模式下，商业化的基质chca只检测到了自身背景峰[m-h]-的离子峰(m/z，187.95)，但是采用实施例1制备的ngqds作为基质，同时检测5种氨基酸时，可以清晰地检测到高强度的氨基酸的去质子化的离子峰(如图6b)，脯氨酸的[m-h]-的离子峰(m/z，113.85)，天冬氨酸的[m-h]-的离子峰(m/z，131.97)，组氨酸的[m-h]-的离子峰(m/z，154.00)，酪氨酸的[m-h]-的离子峰(m/z，180.00)，色氨酸的[m-h]-的离子峰(m/z，203.01)。

实施例5：

maldi-tof质谱分析脂肪酸

将5种饱和脂肪酸c12(mw200.29)、c14(mw228.35)、c16(mw256.40)、c18(mw284.45)、c20(mw312.50)混合，配为1.0mm溶液。在质谱进样靶板上，滴加1ul基质，在空气中放置15min，形成一层均匀薄膜后，再滴加1ul的分析物溶液，进行maldi-tof检测。如图7a所示，在负离子模式下，商业化的基质chca只检测到了自身背景峰[m-h]^-的离子峰(m/z，187.95)，但是采用实施例1制备的ngqds作为基质，同时检测5种饱和脂肪酸，可以清晰地检测到高强度的饱和脂肪酸的去质子化的离子峰(如图7b)，c12的[m-h]^-的离子峰(m/z，199.10)，c14的[m-h]^-的离子峰(m/z，227.13)，c16的[m-h]^-的离子峰(m/z，255.15)，c18的[m-h]^-的离子峰(m/z，283.18)，c20的[m-h]^-的离子峰(m/z，311.20)。

实施例5：

maldi-tof质谱分析碱基

将4种碱基胞嘧啶(mw111.10)、胸腺嘧啶(mw126.12)、腺嘌呤(mw135.13)、鸟嘌呤(mw151.13)混合，配为1.0mm溶液。在质谱进样靶板上，滴加1ul基质，在空气中放置15min，形成一层均匀薄膜后，再滴加1ul的分析物溶液，自然放干后，进行maldi-tof检测。如图8a所示，在负离子模式下，商业化的基质chca只检测到了自身背景峰[m-h]^-的离子峰(m/z，187.95)，但是采用实施例1制备的ngqds作为基质，同时检测4种碱基，其中包括，可以清晰地检测到高强度的饱和脂肪酸的去质子化的离子峰(如图8b)，胞嘧啶的[m-h]^-的离子峰(m/z，109.93)，胸腺嘧啶的[m-h]^-的离子峰(m/z，124.95)，腺嘌呤的[m-h]^-的离子峰(m/z，133.96)，鸟嘌呤的[m-h]^-的离子峰(m/z，149.98)。

实施例6：

对代谢过程中抗癌药物的检测和调控，时药效动力学和药代动力学研究中不可或缺的工作，在癌症相关的生物医学研究中有着重要的地位。上述对氨基酸和饱和脂肪酸的检测后，我们有对抗癌药物进行了检测，包括常见的抗癌药物：多柔比星(mw543.52)，伊马替尼(mw493.60)，达沙替尼(mw488.01)，浓度均为1mm，进行了maldi-tof分析(采用实施例1制备的ngqds作为基质)，如图9所示，在负离子模式下，三种药物的特征峰均清晰的检测出。图9a为检测多柔比星的质谱图，[m-h]^-离子峰(m/z，396.03)为其特征峰，图9b为检测伊马替尼的质谱图，[m-h]^-离子峰(m/z，492.14)为其特征峰，图9c为检测达沙替尼的质谱图，[m-h]^-离子峰(m/z，486.03)为其特征峰。

实施例7：

同实施例4，仅将ngqds基质的浓度修改为0.2mg/ml，对实验结果未产生影响。

实施例8：

同实施例4，将组氨酸的浓度改配为10pm，maldi-tof进行负离子模式检测，其特征峰[m-h]^-离子峰(m/z，153.90)仍然清晰的检测出来(如图10)。

需要说明的是上述实施例仅仅是本发明的较佳实施例，并没有用来限定本发明的保护范围，在上述基础上做出的等同替换或者替代均属于本发明的保护范围。