本发明涉及色谱检测领域，具体而言，涉及一种液相色谱法检测果实中类胡萝卜素的流动相配方及果实中类胡萝卜素检测的hplc方法。
背景技术：
类胡萝卜素是自然界分布最广、种类最丰富的天然色素，广泛存在于植物、动物和藻类中。类胡萝卜素通常是指c40的碳氢化合物(胡萝卜素)和它们的氧化衍生物(叶黄素)两类色素的总称，它们在结构上由8个异戊二烯单位缩合而成，典型的c40类胡萝卜素携带紫罗酮环，环上不同位置的氢原子可被羟基、羰基、环氧基取代。在植物中，类胡萝卜素担当叶绿体光合作用的辅助色素并保护叶绿素免受强光破坏，同时也是合成植物激素aba(abscisicacid，脱落酸)的前体。除八氢番茄红素和六氢番茄红素外，绝大多数类胡萝卜素呈黄色、橙色或红色。约有10％的类胡萝卜素是维生素a的前体，是人和动物的食物中的重要成分。果实是积累类胡萝卜素的重要器官，类胡萝卜素的含量和组成是果实外观、营养品质的直接体现，分析检测类胡萝卜素含量和组分是评价其商品性的一项重要指标。
目前分析类胡萝卜素的方法主要是高效液相色谱法(hplc，highperformanceliquidchromatography)，该方法灵敏、重复性好、适用于批量检测，其中流动相的选择是影响类胡萝卜素分离效果的关键因素。然而，多数研究报道的流动相只适用于特定的检测样品和色谱柱，一旦更改检测条件，往往达不到理想的分离效果；另外，由于不同样品中类胡萝卜素含量和组分的不同，流动相分离的效果也不同。因此在新的样品开始检测之前，通常需要反复摸索优化流动相的组分和比例，以达到最佳分离效果。
有鉴于此，特提出本发明。
技术实现要素：
本发明的第一目的在于提供一种液相色谱法检测果实中类胡萝卜素的流动相配方，该流动相配方对于果实中类胡萝卜素的分离效果好，能用于多种不同果实样品中类胡萝卜素含量和组分的测定，适用于大部分的c18色谱柱，可得到各组分独立、峰型好的多种类胡萝卜素色谱图和测试结果，具有通用性强、灵敏、重复性好的优点。
本发明的第二目的在于提供一种果实中类胡萝卜素检测的hplc方法，该方法采用上述流动相配方对果实中类胡萝卜素进行检测，具有类胡萝卜素分离效果好、通用性强、灵敏、重复性好的优点。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种液相色谱法检测果实中类胡萝卜素的流动相配方，所述配方包括流动相a和流动相b，
流动相a包括以下体积比的成分：乙腈:甲醇:二氯甲烷:正己烷＝(80-90):(1-8):(1-8):(1-8)；
流动相b包括以下体积比的成分：乙腈:甲醇:二氯甲烷:正己烷＝(50-60):(5-15):(15-20):(15-20)。
作为进一步优选的技术方案，流动相a包括以下体积比的成分：乙腈:甲醇:二氯甲烷:正己烷＝(82-88):(3-7):(3-7):(3-7)；
优选地，流动相a包括以下体积比的成分：乙腈:甲醇:二氯甲烷:正己烷＝85:5:5:5。
作为进一步优选的技术方案，流动相b包括以下体积比的成分：乙腈:甲醇:二氯甲烷:正己烷＝(52-58):(7-12):(16-19):(16-19)；
优选地，流动相b包括以下体积比的成分：乙腈:甲醇:二氯甲烷:正己烷＝55:10:17.5:17.5。
第二方面，本发明提供了一种果实中类胡萝卜素检测的hplc方法，采用上述液相色谱法检测果实中类胡萝卜素的流动相配方对果实中类胡萝卜素进行检测。
作为进一步优选的技术方案，所述包括hplc检测的步骤，其中所述流动相配方的混合过程为：
(a)测试样品中含番茄红素：0min-20min，流动相a25％，流动相b75％；
(b)测试样品中无番茄红素：0min-8min，流动相a100％，流动相b0％；
8min-13min，流动相a由100％降到0％，流动相b由0％增加到100％：
13min-20min，流动相a0％，流动相b100％。
作为进一步优选的技术方案，检测器为waters2998型二极管阵列检测器；
优选地，检测用色谱柱为c18色谱柱；
优选地，测试样品用流动相a溶解，浓度调整到od450＝0.2-0.7；
优选地，进样量为10μl；
优选地，流速为0.5-1.5ml/min；
优选地，柱温为20-40℃。
作为进一步优选的技术方案，在所述hplc检测之前还包括制备类胡萝卜素测试样品的步骤。
作为进一步优选的技术方案，所述制备类胡萝卜素测试样品的步骤包括：
(a)将粉碎后的样品与丙酮和正己烷的混合液混合，抽滤，直到提取液无色；
或，将液体样品与丙酮、乙酸乙酯和正己烷的混合液混合，萃取，直到萃取液无色；
(b)合并步骤(a)中的提取液或萃取液，减压浓缩至干燥得浓缩好的类胡萝卜素测试样品。
作为进一步优选的技术方案，步骤(b)中减压浓缩至干燥后还包括皂化的步骤：
(c)用甲醇溶解干燥的丙酮粗提物，然后加入等体积的30％甲醇-koh皂化4小时以上得皂化液；
(d)减压浓缩皂化液到最小体积，加乙酸乙酯和正己烷的混合液进行萃取，直到萃取液无色；
(e)合并步骤(d)中的萃取液，用水洗去皂化时的碱液，取上层萃取液减压浓缩至最小体积得浓缩好的类胡萝卜素测试样品。
作为进一步优选的技术方案，步骤(a)中丙酮和正己烷的体积比为1:1；
优选地，步骤(a)中丙酮、乙酸乙酯和正己烷的体积比为1:1:1；
优选地，步骤(d)中乙酸乙酯和正己烷的体积比为1:1。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明提供的液相色谱法检测果实中类胡萝卜素的流动相配方综合考量了果实中类胡萝卜素的分布状况，根据“相似相溶”的规律，选用最佳的成分，并通过限定各成分的比例从而确定其中极性溶剂和非极性溶剂的比例，从而确保各色素提取完全，得到可靠的分析结果。因此，上述流动相配方对于果实中类胡萝卜素的分离效果好，能用于多种不同果实样品中类胡萝卜素含量和组分的测定，包括玉米、番茄、西瓜、南瓜、胡萝卜等，适用于大部分的c18色谱柱，可得到各组分独立、峰型好的多种类胡萝卜素色谱图和测试结果，具有通用性强、灵敏、重复性好的优点。
本发明提供的果实中类胡萝卜素检测的hplc方法采用上述流动相配方对果实中类胡萝卜素进行检测，具有类胡萝卜素分离效果好、通用性强、灵敏、重复性好的优点。另外，对于无番茄红素的样品，通过利用流动相配方梯度混合的方法调整流动相中极性溶剂和非极性溶剂的混合比例，达到更加理想的分离效果；对于含番茄红素的样品，通过利用流动相配方等度混合的方法使得出峰时间更快，分离出更多的组分。
附图说明
图1(a)、图1(b)和图1(c)分别为实施例1中玉米1、玉米2和玉米3中类胡萝卜素的hplc图谱；
图2(a)和图2(b)分别为实施例2中黄色番茄和青色番茄中类胡萝卜素的hplc图谱；
图3(a)和图3(b)分别为实施例3中利用梯度流动相分离西瓜中类胡萝卜素的hplc图谱；
图4(a)和图4(b)分别为实施例3中利用等度流动相分离西瓜中类胡萝卜素的hplc图谱。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。
作为本发明的一个方面，在一些实施例中提供了一种液相色谱法检测果实中类胡萝卜素的流动相配方，所述配方包括流动相a和流动相b，
流动相a包括以下体积比的成分：乙腈:甲醇:二氯甲烷:正己烷＝(80-90):(1-8):(1-8):(1-8)；
流动相b包括以下体积比的成分：乙腈:甲醇:二氯甲烷:正己烷＝(50-60):(5-15):(15-20):(15-20)。
流动相a中各成分的体积比典型但非限制性的为80:8:5:7、82:5:8:5、85:5:5:5、87:8:3:2或90:1:5:4等。流动相b中各成分的体积比典型但非限制性的为50:10:20:20、53:15:15:17、55:10:17.5:17.5、57:8:18:17或60:5:16:19等。
上述液相色谱法检测果实中类胡萝卜素的流动相配方综合考量了果实中类胡萝卜素的分布状况，根据“相似相溶”的规律，选用最佳的成分，并通过限定各成分的比例从而确定其中极性溶剂和非极性溶剂的比例，从而确保各色素提取完全，得到可靠的分析结果。因此，上述流动相配方对于果实中类胡萝卜素的分离效果好，能用于多种不同果实样品中类胡萝卜素含量和组分的测定，包括玉米、番茄、西瓜、南瓜、胡萝卜等，适用于大部分的c18色谱柱，可得到各组分独立、峰型好的多种类胡萝卜素色谱图和测试结果，具有通用性强、灵敏、重复性好的优点。
在一种优选的实施方式中，流动相a包括以下体积比的成分：乙腈:甲醇:二氯甲烷:正己烷＝(82-88):(3-7):(3-7):(3-7)；
优选地，流动相a包括以下体积比的成分：乙腈:甲醇:二氯甲烷:正己烷＝85:5:5:5。
在一种优选的实施方式中，流动相b包括以下体积比的成分：乙腈:甲醇:二氯甲烷:正己烷＝(52-58):(7-12):(16-19):(16-19)；
优选地，流动相b包括以下体积比的成分：乙腈:甲醇:二氯甲烷:正己烷＝55:10:17.5:17.5。
通过进一步优化流动相a和流动相b中各成分的体积比，进一步提高流动相配方对胡萝卜素提取的完全性并减小检测误差。
作为本发明的另一方面，在一些实施例中提供了一种果实中类胡萝卜素检测的hplc方法，采用上述液相色谱法检测果实中类胡萝卜素的流动相配方对果实中类胡萝卜素进行检测。上述果实中类胡萝卜素检测的hplc方法采用上述流动相配方对果实中类胡萝卜素进行检测，具有类胡萝卜素分离效果好、通用性强、灵敏、重复性好的优点。
在一种优选的实施方式中，所述包括hplc检测的步骤，其中所述流动相配方的混合过程为：
(a)测试样品中含番茄红素：0min-20min，流动相a25％，流动相b75％；
(b)测试样品中无番茄红素：0min-8min，流动相a100％，流动相b0％；
8min-13min，流动相a由100％降到0％，流动相b由0％增加到100％：
13min-20min，流动相a0％，流动相b100％。
本优选实施方式中对于无番茄红素的样品，通过利用流动相配方梯度混合(或称为梯度洗脱、梯度分离)的方法调整流动相中极性溶剂和非极性溶剂的混合比例，达到更加理想的分离效果；对于含番茄红素的样品，通过利用流动相配方等度混合(或称为等度洗脱、等度分离)的方法使得出峰时间更快，分离出更多的组分。采用上述优选实施方式对流动相配方进行混合，能够在20min内实现对测试样品中类胡萝卜素的hplc检测，检测时间短、效率高。
应当理解的是，当测试样品中含番茄红素时，按照(a)所述的过程进行流动相配方的混合，即在0min到20min内，流动相a的体积占流动相总体积的25％，流动相b的体积占流动相总体积的75％。
当测试样品中无番茄红素时，按照(b)所述的过程进行流动相配方的混合，即在0min到8min内，流动相a的体积占流动相总体积的100％，无流动相b；在8min到13min内，流动相a的体积从100％逐渐降至0％，流动相a的体积从0％逐渐增加至100％；在13min到20min内，无流动相a，流动相b的体积占流动相总体积的100％。
在一种优选的实施方式中，检测器为waters2998型二极管阵列检测器；
优选地，检测用色谱柱为c18色谱柱；
优选地，测试样品用流动相a溶解，浓度调整到od450＝0.2-0.7；
优选地，进样量为10μl；
优选地，流速为0.5-1.5ml/min；
优选地，柱温为20-40℃。
检测采用waters的高效液相检测系统，检测器为waters2998型二极管阵列检测器。c18色谱柱可选spherisorbods2色谱柱，粒径为5μm，型号为250×4.6mm。流速典型但非限制性的为0.5ml/min、0.6ml/min、0.7ml/min、0.8ml/min、0.9ml/min、1.0ml/min、1.1ml/min、1.2ml/min、1.3ml/min、1.4ml/min或1.5ml/min。柱温典型但非限制性的为20℃、22℃、24℃、26℃、28℃、30℃、32℃、34℃、36℃、38℃或40℃。上述“浓度调整到od450＝0.2-0.7”是指溶解后调节溶液体积使od450的吸光值范围处于0.2-0.7的范围内，样品浓度在该浓度范围内时，吸光值与含量的线性关系良好，定量分析结果更为准确。
本优选实施方式进一步优化了检测器类型、色谱柱类型、流速、柱温等色谱条件，通过对以上条件的优化，实现更好的分离效果，实现分离度的优化和峰型的最佳化。其中，流速决定了样品的出峰时间，柱温对柱效和产品分离也有一定影响，通过对流速和柱温的设定，以获得良好的分离效果。
在一种优选的实施方式中，在所述hplc检测之前还包括制备类胡萝卜素测试样品的步骤。
在一种优选的实施方式中，所述制备类胡萝卜素测试样品的步骤包括：
(a)将粉碎后的样品与丙酮和正己烷的混合液混合，抽滤，直到提取液无色；
或，将液体样品与丙酮、乙酸乙酯和正己烷的混合液混合，萃取，直到萃取液无色；
(b)合并步骤(a)中的提取液或萃取液，减压浓缩至干燥得浓缩好的类胡萝卜素测试样品。
本优选实施方式提供了一种不需要进行皂化的类胡萝卜素测试样品的制备步骤，通过将原料样品进行抽滤或萃取以及浓缩和干燥，得到浓缩好的类胡萝卜素测试样品。
在一种优选的实施方式中，步骤(b)中减压浓缩至干燥后还包括皂化的步骤：
(c)用甲醇溶解干燥的丙酮粗提物，然后加入等体积的30％甲醇-koh皂化4小时以上得皂化液；
(d)减压浓缩皂化液到最小体积，加乙酸乙酯和正己烷的混合液进行萃取，直到萃取液无色；
(e)合并步骤(d)中的萃取液，用水洗去皂化时的碱液，取上层萃取液减压浓缩至最小体积得浓缩好的类胡萝卜素测试样品。
本优选实施方式提供了一种需要进行皂化的类胡萝卜素测试样品的制备步骤，步骤(c)中的“丙酮粗提物”是指步骤(a)中得到的提取液或萃取液经减压浓缩干燥后所得的物质，该丙酮粗提物经过皂化和萃取后进一步进行浓缩，最终得到浓缩好的类胡萝卜素测试样品。
优选地，对于浓缩好的类胡萝卜素测试样品，将其转移到1.5ml的ep管(离心管)中，用n2气吹干剩余的溶剂，-20℃保存备用。
在一种优选的实施方式中，步骤(a)中丙酮和正己烷的体积比为1:1；
优选地，步骤(a)中丙酮、乙酸乙酯和正己烷的体积比为1:1:1；
优选地，步骤(d)中乙酸乙酯和正己烷的的体积比为1:1。
本优选实施方式中优化了在制备类胡萝卜素测试样品过程中步骤(a)和步骤(d)中各混合液中各成分的体积比，经验证，当各成分的体积比为以上比值时，萃取效果最好。
为了进一步了解本发明的具体操作过程和检测效果，下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的说明。
实施例1
玉米中类胡萝卜素检测的hplc方法，包括以下步骤：
(a)制备类胡萝卜素测试样品：
(a)将粉碎后的玉米样品(取三种不同品种的玉米样品，分别记为玉米1、玉米2和玉米3)与体积比为1:1的丙酮和正己烷的混合液混合，抽滤，直到提取液无色；
(b)合并步骤(a)中的提取液，减压浓缩至干燥得丙酮粗提物；
(c)用甲醇溶解干燥的丙酮粗提物，然后加入等体积的30％甲醇-koh皂化4小时以上得皂化液；
(d)减压浓缩皂化液到最小体积，加体积比为1:1的乙酸乙酯和正己烷的混合液进行萃取，直到萃取液无色；
(e)合并步骤(d)中的萃取液，用水洗去皂化时的碱液，取上层萃取液减压浓缩至最小体积得浓缩好的类胡萝卜素测试样品；
(b)hplc检测：其中所述流动相配方的混合过程为：
测试样品中无番茄红素：0min-8min，流动相a100％，流动相b0％；
8min-13min，流动相a由100％降到0％，流动相b由0％增加到100％：
13min-20min，流动相a0％，流动相b100％。
实施例1所用的仪器如下：waters的高效液相检测系统；检测器为waters2998型二极管阵列检测器。
色谱条件：c18色谱柱(spherisorbods2，5μm，250×4.6mm)；测试样品用流动相a溶解，浓度调整到od450＝0.2-0.7，用0.45μm的滤膜过滤后进样，进样量为10μl；流速为1.0ml/min；柱温为30℃；
流动相配方如下：流动相配方包括流动相a和流动相b，
流动相a包括以下体积比的成分：乙腈:甲醇:二氯甲烷:正己烷＝85:5:5:5；
流动相b包括以下体积比的成分：乙腈:甲醇:二氯甲烷:正己烷＝55:10:17.5:17.5。
如图1(a)-图1(c)所示分别为不同品种玉米(玉米1、玉米2和玉米3)中类胡萝卜素的hplc图谱，其中峰1为叶黄素，峰2为玉米黄质，峰3为β-胡萝卜素，可以看出，在第6分钟到8分钟之内，即可将结构相似的叶黄素和玉米黄质很好的分离出来，且峰型好。
实施例2
番茄中类胡萝卜素检测的hplc方法，检测步骤与实施例1相同，不同之处仅在于所用色谱柱为vydac201tp54色谱柱。
如图2(a)和图2(b)所示分别为黄色番茄和青色番茄中类胡萝卜素的hplc图谱，其中峰1为叶黄素，峰2为β-胡萝卜素，可以看出，在第4分钟到12分钟内可将黄色番茄中的叶黄素和β-胡萝卜素分离出来，峰型好，青色番茄中未检测到β-胡萝卜素。
实施例3
西瓜中类胡萝卜素检测的hplc方法，检测仪器和色谱条件与实施例2相同，不同之处在于本实施例分别对同一西瓜材料采用了两种不同的分离方法，一种利用等度流动相进行分离，即(a)0min-20min，流动相a25％，流动相b75％；另一种利用梯度流动相进行分离，即(b)0min-8min，流动相a100％，流动相b0％；8min-13min，流动相a由100％降到0％，流动相b由0％增加到100％：13min-20min，流动相a0％，流动相b100％。
如图3(a)和图3(b)所示为利用梯度流动相分离西瓜中类胡萝卜素的hplc图谱，其中峰1为番茄红素，峰2为β-胡萝卜素，可以看出，在第6分钟到12分钟内可将番茄红素和β-胡萝卜素分离出来，峰型好。
图4(a)和图4(b)所示为利用等度流动相分离西瓜中类胡萝卜素的hplc图谱，其中峰1为番茄红素，峰2为β-胡萝卜素，峰3为六氢番茄红素，峰4为八氢番茄红素，可以看出，在第4分钟到8分钟内可将番茄红素和β-胡萝卜素分离出来，出峰时间更快，峰型好，且分离出的组分更多，相对于利用梯度流动相分离来说，能将六氢番茄红素和八氢番茄红素进一步分离出来。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以做出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。