本发明涉及肉类品质检测技术领域，具体涉及牦牛肉中17种氨基酸含量的测定方法。
背景技术：
当前，食品中的氨基酸成份也成为人们更多的关注点。氨基酸含量及比例构成是影响肉 品风味及消费者可接受性的重要因子。有研究表明，牦牛肉中的氨基酸总量随年龄的增加而 显著增加，必需氨基酸与非必需氨基酸的含量随年龄的变化呈波动变化。牦牛肉中的氨基酸 组成合理，是优质蛋白质的来源。因此，对牦牛肉的氨基酸监测也是保证食品安全的措施之 一。但是目前国家标准中只有食品中氨基酸的测定方法，而没有简单明了的针对牦牛肉中氨 基酸含量的测定方法。
技术实现要素：
本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了可具体明了测定牦牛肉中17种 氨基酸含量的测定方法。
为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：牦牛肉中17种氨基酸含量的测定方法， 包括有以下步骤：
1)配制缓冲液：
a)分别配制pH2.2、pH3.3、pH4.0和pH6.4的柠檬酸钠Na3C6H5O7.2H2O缓冲液；
b)配制pH5.2的乙酸锂溶液；
2)配制茚三酮溶液：
取150ml二甲基亚砜C2H6OS和乙酸锂溶液50ml加入4g水合茚三酮C9H4O3.H2O和0.12g还 原茚三酮C18H10O6.2H2O搅拌至完全溶解即可；
3)配制冷冻剂：
将市售食盐与冰按质量比1:3的比例混合即可；
4)配制水解液：
取优级纯的浓盐酸与水按照体积比1:1混合均匀，即得到所需的6mol/L的水解液；
5)制备混合标准贮备液：
准确吸取17种氨基酸的混标液0.2ml，加入1.3ml的样品贮备液，制备得到混合标准贮备液；6)牦牛肉样品前处理：
采集海北牦牛肉、大通牦牛肉样品各20份，将样品粉碎后置于硫酸纸上精密称取0.2000g， 放入水解管中，用移液管加入6mol/L的步骤4)配制的水解液10ml，置于步骤3)配制的 冷冻剂中10min，用真空泵抽真空并封口后置于110℃烘箱中水解22小时；取出水解好的样 品，将其置于室温下至冷却至室温；将水解管中的液体移出，用蒸流水反复冲洗水解管，将 所有的液体移出后，定容在100ml容量瓶中，再用滤纸过滤定容好的液体，吸取10ml过滤 液用旋转蒸发仪蒸干，加入10ml样品稀释液，经0.45μmol的滤膜过滤，即得到前处理后 的牦牛肉样品；
7)氨基酸含量分离检测：
色谱柱规格为LCAK06/Na4.6×200mm，柱温为74/58℃，流动相为：步骤1)步骤a)中配制 的pH3.3、pH4.0和pH6.4的柠檬酸钠Na3C6H5O7.2H2O缓冲液，步骤1)步骤b)中配制的pH5.2 的乙酸锂溶液和步骤2)中配制的茚三酮溶液，流动相流率为0.45ml/min，准确吸取0.200ml 17种氨基酸混合标准品，置入1.5ml进样瓶中，加入1.3ml样品稀释液，此上机测定用的 氨基酸标准稀释液浓度为0.333mmol/ml，用全自动氨基酸分析仪以外标法测定试样测定牦牛 肉样品中的17种氨基酸含量；同时还需进行精密度试验和稳定性试验。
进一步的，上述的牦牛肉中17种氨基酸含量的测定方法，所述步骤1)步骤a)中pH2.2 的柠檬酸钠Na3C6H5O7.2H2O缓冲液的配制方法为：称取19.6g柠檬酸钠和16.5ml浓盐酸加水 稀释到1000ml，用浓盐酸或500g/L的氢氧化钠溶液调节pH至2.2；所述样品稀释液、样品 加载液和样品贮备液均为pH2.2的柠檬酸钠Na3C6H5O7.2H2O缓冲液。
进一步的，上述的牦牛肉中17种氨基酸含量的测定方法，所述步骤1)步骤a)中pH3.3 的柠檬酸钠Na3C6H5O7.2H2O缓冲液的配制方法为：
称取19.6g柠檬酸钠和12ml浓盐酸加水稀释到1000ml，用浓盐酸或500g/L的氢氧化钠溶液 调节pH至3.3；
进一步的，上述的牦牛肉中17种氨基酸含量的测定方法，所述步骤1)步骤a)中pH4.0 的柠檬酸钠Na3C6H5O7.2H2O缓冲液的配制方法为：
称取19.6g柠檬酸钠和9ml浓盐酸加水稀释到1000ml，用浓盐酸或500g/L的氢氧化钠溶液 调节pH至4.0。
进一步的，上述的牦牛肉中17种氨基酸含量的测定方法，所述步骤1)步骤a)中pH6.4 的柠檬酸钠Na3C6H5O7.2H2O缓冲液的配制方法为：
称取19.6g柠檬酸钠和46.8g优级纯的氯化钠加水稀释到1000ml，用浓盐酸或500g/L的氢 氧化钠溶液调节pH至6.4。
进一步的，上述的牦牛肉中17种氨基酸含量的测定方法，所述步骤1)步骤b)中pH5.2 的乙酸锂溶液的配制方法为：
称取168g氢氧化锂LiOH7.H2O,加入优级纯的冰乙酸279ml，加水稀释到1000ml，用浓盐酸 或500g/L的氢氧化钠溶液调节pH至5.2。
进一步的，上述的牦牛肉中17种氨基酸含量的测定方法，所述步骤7)中，精密度试验 的操作方法为：取同一批号的牦牛肉供试品贮备液，加混合标准贮备液后，过滤进样，按外 标法以峰面积测定17种氨基酸的含量；在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差 值需小于等于算术平均值的12％。
进一步的，上述的牦牛肉中17种氨基酸含量的测定方法，所述步骤7)中，稳定性试验 的操作方法为：取另一批号的牦牛肉样品溶液于室温避光放置0-72h后，分别进样测定，每 份样品20μl；在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值需小于等于算术平均值 的12％。
本发明的有益效果为：本发明提供的牦牛肉中17种氨基酸含量的测定方法，能够具体 明了测定牦牛肉中氨基酸含量的方法，具有操作简便快速、结果准确可靠、测定时间方面限 制较小的优点,同样适用于其他肉类。
附图说明
图1显示为17种氨基酸标准样品的检测结果。
图2显示为牦牛肉样品中17种氨基酸含量的检测结果。
具体实施方式
实施例1：
1、材料和方法：
1.1、材料：
1.1.1试剂：
浓盐酸(色谱纯)，国药集团化学试剂有限公司，上海；
苯酚，国药集团化学试剂有限公司，上海；
柠檬酸钠(Na3C6H5O7.2H2O)，国药集团化学试剂有限公司，上海；
氢氧化锂(LiOH7.H2O)，国药集团化学试剂有限公司，上海；
冰乙酸(优级纯)，国药集团化学试剂有限公司，上海；
氢氧化钠，国药集团化学试剂有限公司，上海；
氯化钠(优级纯)，国药集团化学试剂有限公司，上海；
二甲基亚砜(C2H6OS、)，国药集团化学试剂有限公司，上海；
乙酸锂，国药集团化学试剂有限公司，上海；
水合茚三酮(C9H4O3.H2O)，国药集团化学试剂有限公司，上海；
还原茚三酮(C18H10O6.2H2O)，国药集团化学试剂有限公司，上海；
6mol/L盐酸溶液，优级纯的浓盐酸与水1:1混合均匀。
1.1.2标准品：
17种氨基酸的混和标准液：
SIGMA-ALORICH，product of Germany；
17种氨基酸的混和标准贮备液的制备方法：
准确吸取Sigma公司提供的17种氨基酸的混和标准液0.2ml，加入1.3ml的样品贮备 液，制成混合标准贮备液，备用。
1.1.3样品：
海北牦牛肉、大通牦牛肉均采自青海屠宰场。
1.2、方法：
1.2.1前处理方法：
在青海省采集海北牦牛肉、大通牦牛肉样品各20份。将粉碎样品置于硫酸纸上精密称 取0.2000g牦牛肉鲜样于特质的上细下粗的水解管中，为防止样品粘在水解管壁上，用称样 用的硫酸纸将样品卷住置于水解管中。用移液管加入10ml 6mol/L的盐酸溶液，用真空泵 抽真空并封口后置于110℃烘箱中水解22小时。取出水解好的样品，将其置于室温下至冷却 至室温。将水解管打开，将管中的液体移出，用蒸流水反复冲洗水解管，将所有的液体移出 定容在100ml容量瓶中，再用滤纸过滤定容好的液体，吸取10ml过滤液用旋转蒸发仪蒸干， 加入10ml样品稀释液，经0.45μmol的滤膜过滤，备用上机。
1.2.2仪器及条件：
英国Biochrom30+全自动氨基酸分析仪，瑞士华嘉有限公司；瑞士Buchi公司的B400均 质仪；旋转蒸发仪RE52AA，郑州市亚荣仪器有限公司；BSA224S电子天平，赛多利斯科学仪 器有限公司；KQ-250DE型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司。
色谱柱：LCAK06/Na4.6×200mm，柱温：74/58，流动相：pH3.3、pH4.0和pH6.4的柠檬 酸钠Na3C6H5O7.2H2O缓冲液及pH5.2的乙酸锂溶液，流动相流率：0.45ml/min，准确吸取0.200 ml 17种氨基酸混合标准品，置入1.5ml进样瓶中，加入1.3ml稀释液，此标准稀释液浓度 为0.333mmol/ml，作为上机测定用的氨基酸标准，用全自动氨基酸分析仪以外标法测定试样 测定夜的氨基酸含量。
1.2.3计算公式：
式中：
X：试样氨基酸的含量，单位为g/100g；
C：17种氨基酸的标样浓度，单位为μmol/ml；
F：试样稀释倍数；
V：水解后试样定容体积，单位为ml；
M：氨基酸分子量；
m：样品质量(g)；
A1：标样氨基酸的峰面积；
A2：样品氨基酸的峰面积。
2、结果显示：
17种氨基酸标准样品检测结果如图1所示；牦牛肉样品含量如图2所示。
表1为17种组份峰面积(Area)测定的精密度结果。在重复性条件下获得的两次独立测定 结果的绝对差值不得超过算术平均值的12％。
表2为本发明样品加标回收率结果。回收率在80-120之间均为合格。
表3为稳定性试验结果。在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术 平均值的12％。
其中检出量单位为g/100g，表1、表3所测样品均为牦牛肉样品，表2为标准样品。
表1
表2
表3
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管 参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前 述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发 明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围 之内。