一种检测骨化三醇软胶囊清洁残留量的方法与流程

本发明涉及制药技术领域，具体是涉及一种检测骨化三醇软胶囊清洁残留量的方法。

背景技术：

骨化三醇是维生素d3最重要活性代谢产物之一，可促进肠道对钙的吸收并调节骨的矿化，通常在肾脏内由其前体25-羟基维生素d3(25-hcc)转化而成，每日正常生理性生成量为0.5-1.0ug，在骨质合成增加期内(如生长期或妊娠期)其生成量稍有增加。

在骨化三醇软胶囊的生产过程中，骨化三醇活性药物成分会残留在生产装置上，而骨化三醇难溶于水和常见有机溶剂，一般溶于甘油酯中，且紫外响应较弱，残留限度低(0.0024微克/100平方厘米)，难以准确测定，若不确定清洁残留限度可能会对后一个产品产生交叉污染。因而，检测骨化三醇软胶囊清洁残留量的方法有待进一步研究。

技术实现要素：

本发明的目的是为了在一定程度上解决上述技术问题，提供了一种检测骨化三醇软胶囊清洁残留量的方法。

为达到本发明的目的，本发明的提出了一种检测骨化三醇软胶囊清洁残留量的方法。该方法包括以下步骤：

(1)依次制备对照品储备溶液、中间对照品储备溶液、对照品溶液；

(2)制备空白棉签提取溶液；

(3)擦拭骨化三醇生产装置，制备待测骨化三醇样品溶液；

(4)通过hplc法测得空白棉签提取溶液的hplc谱图，采集骨化三醇对照品的特征峰，对待测骨化三醇样品溶液进行检测；

(5)确定每100平方厘米板取样点上骨化三醇软胶囊清洁残留量；

其中所述hplc法中流动相为50体积份乙腈、40体积份0.1％三乙胺水溶液与10体积份甲醇的混合溶液。

本发明中，所述hplc法的条件进一步包括：hplc色谱柱：c18，3.5微米，3×100毫米或等效柱；流速：0.7毫升/分钟；进样量：1000微升；柱温：35摄氏度；检测波长：265纳米。

本发明中，所述步骤(1)中，骨化三醇对照品储备溶液是按照下列步骤制备的：(i)称取2.5mg骨化三醇对照品置于250ml容量瓶中，(ii)加入甲醇水溶液振摇使其溶解，使用甲醇水溶液定容至250ml；中间对照品储备溶液是按照下列步骤制备的：(iii)取1.0ml对照储备溶液于250ml容量瓶中，(iv)使用甲醇水溶液定容至250ml；骨化三醇对照品溶液是按照下列步骤制备的：(v)取2.0ml骨化三醇中间对照品储备溶液于50ml容量瓶中，(vi)使用甲醇水溶液定容至50ml。

本发明中，所述步骤(2)中，空白棉签提取溶液是按照下列步骤制备的：将2支空白棉签放入玻璃小瓶中，加入1.5ml甲醇水溶液，将玻璃小瓶密封并依次进行超声、涡旋处理，得到空白棉签提取溶液。

本发明中，所述步骤(3)中，待测骨化三醇样品溶液是按照下列步骤制备的：在骨化三醇生产装置中随机选择取样点，每个取样点的面积为100平方厘米，其中每个取样点配一玻璃小瓶并分别贴好相应标签加以区分，在玻璃小瓶中放入2支空白棉签并加入1.5ml甲醇水溶液，用2支空白棉签在各取样点按从左到右或从上到下方向擦拭，擦拭完将棉签放入相应的玻璃小瓶中，将玻璃小瓶密封依次进行超声、涡旋处理，得到待测骨化三醇样品溶液。

优选的，本发明中，所述步骤(2)和步骤(3)中，进行超声、涡旋处理是指超声处理15min、涡旋处理10-15秒。

优选的，本发明中，所述甲醇水溶液的浓度为40v％。

本发明中，所述待测骨化三醇为生产骨化三醇软胶囊过程中残留在生产装置中的骨化三醇活性药物成分。

本发明中，所述步骤(5)中，基于下式确定每100平方厘米板取样点上所述待测骨化三醇的量：

其中，所述对照品为已知纯度的骨化三醇。

由此可以显著提高测得骨化三醇软胶囊清洁残留量的准确度，避免生产过程中的交叉污染。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

图1是根据本发明一个实施例的稀释剂40v％甲醇水溶液的hplc谱图；

图2是根据本发明一个实施例的空白棉签提取溶液的hplc谱图；

图3是根据本发明一个实施例的骨化三醇对照品的hplc谱图；

图4是根据本发明一个实施例的待测骨化三醇样品的hplc谱图；

图5是根据本发明一个实施例的骨化三醇标准曲线图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

实施例和附图中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

在本发明的一个方面，本发明提出了一种检测骨化三醇软胶囊清洁残留量的方法。下面对根据本发明实施例的检测骨化三醇软胶囊清洁残留量的方法进行详细描述。根据本发明的实施例，该方法包括：

步骤(1)：制备对照品储备溶液

具体的，按照下列步骤制备对照品储备溶液：(a)称取骨化三醇对照品置于250ml容量瓶中，(b)加入甲醇水溶液振摇使其溶解，(c)使用甲醇定容至250ml。

根据本发明的一个实施例，称取骨化三醇对照品的重量并不受特别限制，本领域技术人员可以根据实际需要进行选择，根据本发明的一个具体实施例，称取骨化三醇对照品的重量可以为2.5mg，由此，可以显著提高后续检测步骤中测得骨化三醇软胶囊清洁残留量的准确度。

根据本发明的再一个实施例，甲醇水溶液的浓度并不受特别限制，本领域技术人员可以根据实际需要进行选择，根据本发明的一个具体实施例，甲醇水溶液的浓度可以为40v％，由此，可以进一步提高后续检测步骤中测得骨化三醇软胶囊清洁残留量的准确度。

步骤(2)：制备中间对照品储备溶液

在该步骤中，通过量取对照品储备溶液进行稀释制备中间对照品储备溶液。具体的，按照下列步骤制备中间对照品储备溶液：(d)量取对照储备溶液，(e)用40v％甲醇水溶液定容至250ml容量瓶，振摇使其混匀。

根据本发明的一个实施例，量取对照品储备溶液的体积并不受特别限制，本领域技术人员可以根据实际需要进行选择，根据本发明的一个具体实施例，量取对照品储备溶液的体积可以为1.0ml，发明人通过实验意外地发现，量取该体积的对照品储备溶液可以进一步提高后续检测步骤中测得骨化三醇软胶囊清洁残留量的准确度。

步骤(3)：制备对照品溶液

在该步骤中，通过量取对照品储备溶液进行稀释制备对照品溶液。具体的，按照下列步骤制备骨化三醇对照品：(f)量取骨化三醇中间对照品储备溶液，(g)使用甲醇水溶液定容至50ml容量瓶，振摇使其混匀。

根据本发明的一个实施例，量取中间对照品储备溶液的体积并不受特别限制，本领域技术人员可以根据实际需要进行选择，根据本发明的一个具体实施例，量取对照品储备溶液的体积可以为2.0ml，发明人通过实验意外地发现，量取该体积的对照品储备溶液可以进一步提高后续检测步骤中测得骨化三醇软胶囊清洁残留量的准确度。

根据本发明的再一个实施例，甲醇水溶液的浓度并不受特别限制，本领域技术人员可以根据实际需要进行选择，根据本发明的一个具体实施例，甲醇水溶液的浓度可以为40v％，由此，可以进一步提高后续检测步骤中测得骨化三醇软胶囊清洁残留量的准确度。

步骤(4)：制备空白棉签提取溶液，验证专属性

在该步骤中，首先制备空白棉签提取溶液，具体的，将空白棉签放入玻璃小瓶中，加入甲醇水溶液，将玻璃小瓶密封并依次进行超声、涡旋处理，以便得到空白棉签提取溶液。

根据本发明的一个实施例，甲醇水溶液的浓度并不受特别限制，本领域技术人员可以根据实际需要进行选择，根据本发明的一个具体实施例，甲醇水溶液的浓度可以为40v％；加入稀释剂40v％甲醇水溶液的体积并不受特别限制，本领域技术人员可以根据实际需求进行选择，根据本发明的一个具体实施例，加入稀释剂40v％甲醇水溶液的体积可以为1.5ml，由此，可以显著提高后续检测步骤中测得骨化三醇软胶囊清洁残留量的准确度。

根据本发明的再一个实施例，超声、涡旋处理的条件并不受特别限制，本领域技术人员可以根据实际需求进行选择，根据本发明的一个具体实施例，超声、涡旋处理的条件可以为超声15分钟、涡旋10-15秒，由此，可以进一步提高后续检测步骤中测得骨化三醇软胶囊清洁残留量的准确度。

步骤(5)：擦拭骨化三醇生产装置，制备待测骨化三醇样品溶液

在该步骤中，通过使用棉签擦拭骨化三醇生产装置，以便得到待测骨化三醇样品溶液。具体的，在骨化三醇生产装置中随机选择多个取样点，每个取样点的面积为100平方厘米，其中每个取样点配一玻璃小瓶并分别贴好相应标签加以区分，在玻璃小瓶中放入2支空白棉签并加入甲醇水溶液，用2支空白棉签在各取样点按从左到右或从上到下方向擦拭，擦拭完将棉签放入相应的玻璃小瓶中，将玻璃小瓶密封并依次进行超声、涡旋处理，以便得到待测骨化三醇样品溶液。

根据本发明的一个实施例，甲醇水溶液的浓度并不受特别限制，本领域技术人员可以根据实际需要进行选择，根据本发明的一个具体实施例，甲醇水溶液的浓度可以为40v％；根据本发明的一个实施例，加入40v％甲醇水溶液的体积并不受特别限制，本领域技术人员可以根据实际需求进行选择，根据本发明的一个具体实施例，加入40v％甲醇水溶液的体积可以为1.5ml，由此，可以显著提高后续检测步骤中测得骨化三醇软胶囊清洁残留量的准确度。

根据本发明的再一个实施例，超声、涡旋处理的条件并不受特别限制，本领域技术人员可以根据实际需求进行选择，根据本发明的一个具体实施例，超声、涡旋处理的条件可以为超声15分钟、涡旋10-15秒，由此，可以进一步提高后续检测步骤中测得骨化三醇软胶囊清洁残留量的准确度。

步骤(6)：采集骨化三醇特征峰

在该步骤中，通过hplc法采集骨化三醇对照品和待测骨化三醇样品的特征峰。具体的，所述hplc法条件包括：hplc色谱柱：c18，3.5微米，3×100毫米或等效柱；流动相：50体积份乙腈、40体积份0.1％三乙胺水溶液与10体积份甲醇的混合溶液；流速：0.7毫升/分钟；进样量：1000微升；柱温：35摄氏度；检测波长：265纳米。由此，采用该方法可以准确测定骨化三醇软胶囊清洁残留量。

发明人通过实验意外地发现，检测步骤中的色谱条件能够显著影响检测得到的骨化三醇软胶囊清洁残留量的准确性。有鉴于此，发明人通过大量实验，从中确定了上述色谱条件，由此，可以显著提高骨化三醇软胶囊清洁残留量的准确度。

步骤(7)：确定每100平方厘米板取样点上骨化三醇软胶囊清洁残留量

在该步骤中，基于下式确定每100平方厘米取样点上所述待测骨化三醇的量：

由此，可以显著提高测得骨化三醇软胶囊清洁残留量的准确度。

下面参考具体实施例，对本发明进行描述，需要说明的是，这些实施例仅仅是描述性的，而不以任何方式限制本发明。

一般方法：

除非特别说明，在后面的实施例中采用下列方法进行hplc检测：

hplc法条件包括：hplc色谱柱：c18，3.55微米，3×100毫米或等效柱；流动相：50体积份乙腈、40体积份0.1％三乙胺水溶液与10体积份甲醇的混合溶液；流速：0.7毫升/分钟；进样量：1000微升；柱温：35摄氏度；检测波长：265纳米。骨化三醇的保留时间为9.2min。

实施例1

在本实施例中，发明人按照一般方法的描述测得了稀释剂40v％甲醇水溶液的hplc谱图，参考图1，稀释剂的出峰位置与骨化三醇特征峰位置间无干扰。

实施例2

在本实施例中，发明人将2支空白棉签放入玻璃小瓶中，加入1.5ml的稀释剂40v％甲醇水溶液，将玻璃小瓶密封并超声15分钟、涡旋10-15秒，以便得到空白棉签提取溶液，然后按照一般方法的描述测得空白棉签提取溶液的hplc谱图，参考图2，空白棉签提取溶液的出峰位置与骨化三醇特征峰位置间无干扰。

实施例3

在本实施例中，发明人制备了骨化三醇对照品储备溶液、骨化三醇中间对照品储备溶液和骨化三醇对照品溶液，并按照一般方法的描述测得了骨化三醇对照品溶液的hplc谱图。具体的，骨化三醇对照品储备溶液是按照下列步骤制备的：(i)称取2.5mg骨化三醇对照品置于250ml容量瓶中，(ii)加入40％甲醇水溶液振摇使其溶解，使用40％甲醇水溶液定容至250ml。骨化三醇中间对照品储备溶液是按照下列步骤制备的：(iii)取1.0ml对照储备溶液于250ml容量瓶中，(iv)使用40v％甲醇水溶液定容至250ml。骨化三醇对照品溶液是按照下列步骤制备的：(v)取2.0ml骨化三醇中间对照品储备溶液于50ml容量瓶中，(vi)使用40v％甲醇水溶液定容至50ml。参考图3，骨化三醇对照品的特征峰与稀释剂40v％甲醇水溶液峰及其他杂峰间无干扰。

实施例4

在本实施例中，发明人通过使用棉签擦拭骨化三醇生产装置，得到待测骨化三醇样品溶液。具体的，在骨化三醇生产装置中随机选择多个取样点，每个取样点的面积为100平方厘米，其中每个取样点配一玻璃小瓶并分别贴好相应标签加以区分，在玻璃小瓶中放入2支空白棉签并加入1.5ml稀释剂40v％甲醇水溶液，用2支空白棉签在各取样点按从左到右或从上到下方向擦拭，擦拭完将棉签放入相应的玻璃小瓶中，将玻璃小瓶密封并依次超声处理15min、涡旋处理10-15秒，得到待测骨化三醇样品溶液，然后按照一般方法的描述测得了待测骨化三醇样品溶液的hplc图谱，参考图4，因骨化三醇软胶囊生产装置未清洗干净，有骨化三醇残留，故检测到骨化三醇特征峰。

实施例5

在本实施例中，发明人考察了骨化三醇在浓度0.88ng/ml～7.00ng/ml范围内的线性。具体的，发明人配制了5份骨化三醇溶液，浓度分别为0.8ng/ml、0.96ng/ml、1.6ng/ml、3.2ng/ml和6.4ng/ml，然后按照一般方法的描述测定了其特征峰面积，以峰面积对浓度作图，参考图5，骨化三醇在浓度0.88ng/ml～7.00ng/ml范围内的线性良好，r²＝0.99。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。