本发明涉及葡萄糖检测技术，尤其涉及一种纤维素基葡萄糖传感器材料及其制备方法。
背景技术：
纤维素是地球上最常见的有机化合物，占植物界碳含量的50%以上。其中，棉花的纤维素含量高达90%，为天然的最纯纤维素来源。纤维素及其衍生化产品已经广泛应用于纺织、造纸、化工、食品、生物和医学等诸多领域。纤维素作为一种取之不尽、用之不竭的可再生资源，在工业应用中具有不可替代的优势。用纤维素为原料制备的产品具有无毒无害、良好的生物相容性和生物可降解性以及成本低的特点，进一步开发和利用纤维素资源对开发新能源、发展新型材料和改善生态环境等都具有重要意义。
当前，糖尿病在世界范围内以前所未有的速度增长，在过去二十年中已成为严重的健康问题，这也是20-79岁年龄段人群的主要死亡原因之一。由于其发病率迅速上升，世界卫生组织（WHO）宣布它为全球性流行病。中国是世界上糖尿病病人最多的国家，目前中国有1.1亿糖尿病患者，而在2011年时这一数字是9000万。糖尿病患者的一个很重要的指标就是高血糖，尽管目前有很多精密仪器用来检测人体血糖，但高昂的测试费用和特定的场所给人们带来了很多的不便。目前，纸基类生物传感器材料已经受到越来越多的学者和社会的关注，
纤维素膜表面通过修饰一些新基团或高分子链，能提高其界面性能，应用于生物载体、吸附、传感器等领域。在专利号为CN201710641176.9的专利中公开了一种以细菌纤维素和藻类凝絮体为载体固化的葡萄糖氧化酶的制备方法，具体制备方法为：将葡萄糖氧化酶加入到细菌纤维素溶液中，振荡挥发溶剂，密封，低温静置，取出，得到吸附葡萄糖氧化酶的细菌纤维素溶液；将藻类生物质中加入吸附葡萄糖氧化酶的细菌纤维素溶液，顺序投入阴离子聚合物和阳离子表面活性剂，或者阳离子聚合物和阴离子表面活性剂，低速搅拌，过滤截留得到藻类凝絮体包覆的葡萄糖氧化酶；将藻类凝絮体固定的葡萄糖氧化酶加入到溶剂中，加入助剂，混合均匀，得到以细菌纤维素和藻类凝絮体为载体固化的葡萄糖氧化酶。本发明的葡萄糖氧化酶通过吸附作用吸附于纤维素基体上，酶在基体上的稳定性差，载酶量低，酶的活性低，不利于长期保存。现有技术中用于检测葡萄糖的器件，检测灵敏度低，设备使用较为繁杂。
技术实现要素：
为解决现有技术中检测葡萄糖的器件，检测灵敏度低，载酶量低，酶的稳定性和附着性差的技术问题，本发明提出一种纤维素基葡萄糖传感器材料，包含以葡萄糖氧化酶或类似物为成分的酶、显色剂和三维网状结构的纤维素基体，所述酶通过化学键键合于所述纤维素基体，所述显色剂通过物理吸附分散于所述纤维素基体表面。
酶通过化学键固定在纤维素基体上，显色剂吸附于纤维素基体表面，在检测葡萄糖时在葡萄糖氧化酶的作用下产生葡萄糖酸和过氧化氢，再进而和显色剂反应进行显色，通过颜色的深浅辨别葡萄糖的含量高低。纤维素的三维网状结构孔隙率很高利于酶的附着。
本发明还提出一种上述纤维素基葡萄糖传感器材料的制备方法，包括以下步骤。
将纤维素膜在强氧化剂中进行氧化改性，得到带有醛基的改性纤维素膜。
具体可以为：将纤维素溶剂进行预冷，纤维素溶剂可以为氢氧化钠的质量分数为6 ~ 10%和尿素的质量浓度为2 ~ 20%的混合液；加入纤维素，搅拌溶解得到纤维素溶液，使得纤维素溶液中纤维素所占质量百分比为1 ~ 15%。将所得纤维素溶液脱泡、除杂后流延刮膜，并在凝固浴中凝固成形，再进行水洗，得到再生纤维素膜；将再生纤维素膜浸泡在强氧化剂溶液中，避光条件下反应2 ~ 4 h，得到改性纤维素膜。强氧化剂可以为高锰酸钾、高碘酸钠、重铬酸钾和氯酸钾中的一种或多种。
使所述改性纤维素膜、带有氨基的酶进行Schiff - Base反应3h得到载酶纤维素膜，反应温度可以为10 ~ 40℃。所述酶可以为葡萄糖氧化酶、过氧化物酶、磷酸盐缓冲液的混合液。
Schiff-base反应也叫西佛碱反应，它是指活波醛基与氨基进行缩合生成酰胺，本发明中指氧化后纤维素上的醛基与酶上的氨基进行西佛碱反应而结合。
使显色剂吸附于所述载酶纤维素膜上。显色剂可以为碘化钾、邻甲联苯胺中的一种或两种。①采用碘化钾做显色剂，阳性反应呈棕色、红色，颜色的由葡萄糖的浓度决定，葡萄糖的浓度越高颜色越趋向于红色；②采用邻甲联苯胺作显色剂，阳性反应呈蓝色。其测定原理是葡萄糖氧化酶把葡萄糖氧化成葡萄糖醛酸和过氧化氢，后者再由过氧化物酶催化，而使显色剂呈颜色。例如显色剂可以为浓度为0.5~2 mol/L的碘化钾的，反应条件可为室温下恒温振荡2~6h。
本发明的纤维素基体的三维网状结构比表面积较大，在酶的固定中发挥了重要作用，获得了较高的酶载量，有效地保持了酶的活和检验葡萄糖的灵敏度。酶通过化学键键合于纤维素基体上，酶的固定很牢固。
说明书附图
图1为本发明实施例一中纤维素膜扫描电镜图；
图2为本发明实施例一中得到的纯纤维素膜、改性纤维素膜、载酶纤维素膜的红外光谱图；
图3为本发明实施例一中所得到的纤维素基葡萄糖传感器材料检测葡萄糖的实际效果图。
具体实施方式
实施例一
纤维素基葡萄糖传感器的制备，具体步骤如下：
1）制备再生纤维素膜：以NaOH/尿素水溶液（其中按重量NaOH：尿素：水=7：12：81）预冷到-12℃作溶剂，加入纤维素搅拌溶解得到纤维素溶液，将所得纤维素溶液脱泡、除杂后得到质量浓度为3wt%的纤维素溶液，流延刮膜，并在凝固浴中凝固成形，再进行水洗，得到再生纤维素膜；
2）制备改性纤维素膜：先配制质量浓度为4wt%的高碘酸钠溶液，用剪刀剪一小块纯纤维素膜，浸泡在高碘酸钠溶液中，在避光条件下室温反应2 h，得到改性纤维素膜；
3）制备载酶纤维素膜：先配制0.05mol/L的Na2HPO4溶液和0.05mol/L的KH2PO4溶液，将两种溶液按一定比例混合，直至pH值在5~8之间，再加入酶并使酶液的浓度为0.5mg/mL。再将改性纤维素膜浸泡在酶液中，10℃下恒温振荡3 h，得到载酶的纤维素膜；
4）制备纤维素基葡萄糖传感器：将步骤3）中所得载酶的纤维素膜浸泡在碘化钾溶液（其中碘化钾溶液的浓度为1 mol/L）中，室温下恒温振荡2h，得到所述的纤维素基葡萄糖传感器，即最终产品。
性能测试：
配制一系列浓度梯度的葡萄糖溶液（梯度为3，4，5，6，7，8，9，10mmol / L），取若干长度2cm，宽1cm的产品进行不同浓度葡萄糖溶液的显色检测。图3-a显示的是反应10min后产品的显色情况，图3-b对应不同葡萄糖的浓度，明显发现溶液颜色依次由浅到深，说明检测效果较好，时间短，灵敏度高。图1显示了纯纤维素膜的扫描电镜图，可以看出纯纤维素膜表面是疏松多孔的结构。图2对应于纯纤维素膜、改性纤维素膜、载酶纤维素膜的红外光谱图，改性纤维素表面的醛基和酶上面的氨基通过Schiff-Base反应进行结合，生成碳氮键，在红外谱图上对应波长1640cm-1左右，表明酶很好地通过化学作用固定在膜表面。
实施例二
纤维素基葡萄糖传感器的制备，具体步骤如下：
1）制备再生纤维素膜：以NaOH/尿素水溶液（其中按重量NaOH：尿素：水=7：12：81）预冷到-12℃作溶剂，加入纤维素搅拌溶解得到纤维素溶液，将所得纤维素溶液脱泡、除杂后得到质量浓度为3wt%的纤维素溶液，流延刮膜，并在凝固浴中凝固成形，再进行水洗，得到再生纤维素膜；
2）制备改性纤维素膜：先配制质量浓度为4wt%的高锰酸钾溶液，用剪刀剪一小块纯纤维素膜，浸泡在高锰酸钾溶液中，在避光条件下室温反应4h，得到改性纤维素膜；
3）制备载酶纤维素膜：先配制0.05mol/L的Na2HPO4溶液和0.05mol/L的KH2PO4溶液，将两种溶液按一定比例混合，直至pH值在5~8之间，再加入酶并使酶液的浓度为1mg/mL。再将改性纤维素膜浸泡在酶液中，25℃下恒温振荡3 h，得到载酶的纤维素膜；
4）制备纤维素基葡萄糖传感器：将步骤3）中所得载酶的纤维素膜浸泡在碘化钾溶液（其中碘化钾溶液的浓度为2 mol/L）中，室温下恒温振荡6h，得到所述的纤维素基葡萄糖传感器，即最终产品。
实施例二中的检测结果和实施例1相似。
实施例三
纤维素基葡萄糖传感器的制备，具体步骤如下：
1）制备再生纤维素膜：以NaOH/尿素水溶液（其中按重量NaOH：尿素：水=7：12：81）预冷到-12℃作溶剂，加入纤维素搅拌溶解得到纤维素溶液，将所得纤维素溶液脱泡、除杂后得到质量浓度为3wt%的纤维素溶液，流延刮膜，并在凝固浴中凝固成形，再进行水洗，得到再生纤维素膜；
2）制备改性纤维素膜：先配制质量浓度为4wt%的重铬酸钾溶液，用剪刀剪一小块纯纤维素膜，浸泡在重铬酸钾溶液中，在避光条件下室温反应3h，得到改性纤维素膜；
3）制备载酶纤维素膜：先配制0.05mol/L的Na2HPO4溶液和0.05mol/L的KH2PO4溶液，将两种溶液按一定比例混合，直至pH值在5~8之间，再加入酶并使酶液的浓度为1mg/mL。再将改性纤维素膜浸泡在酶液中，30℃下恒温振荡3 h，得到载酶的纤维素膜；
4）制备纤维素基葡萄糖传感器：将步骤3）中所得载酶的纤维素膜浸泡在碘化钾溶液（其中碘化钾溶液的浓度为1.5 mol/L）中，室温下恒温振荡5h，得到所述的纤维素基葡萄糖传感器，即最终产品。
实施例三中的检测结果和实施例1相似。
实施例四
纤维素基葡萄糖传感器的制备，具体步骤如下：
1）制备再生纤维素膜：以NaOH/尿素水溶液（其中按重量NaOH：尿素：水=7：12：81）预冷到-12℃作溶剂，加入纤维素搅拌溶解得到纤维素溶液，将所得纤维素溶液脱泡、除杂后得到质量浓度为3wt%的纤维素溶液，流延刮膜，并在凝固浴中凝固成形，再进行水洗，得到再生纤维素膜；
2）制备改性纤维素膜：先配制质量浓度为4wt%的氯酸钾溶液，用剪刀剪一小块纯纤维素膜，浸泡在氯酸钾溶液中，在避光条件下室温反应4h，得到改性纤维素膜；
3）制备载酶纤维素膜：先配制0.05mol/L的Na2HPO4溶液和0.05mol/L的KH2PO4溶液，将两种溶液按一定比例混合，直至pH值在5~8之间，再加入酶并使酶液的浓度为1mg/mL。再将改性纤维素膜浸泡在酶液中，25℃下恒温振荡3 h，得到载酶的纤维素膜；
4）制备纤维素基葡萄糖传感器：将步骤3）中所得载酶的纤维素膜浸泡在邻甲联苯胺溶液（其中邻甲联苯胺溶液的浓度为2 mol/L）中，室温下恒温振荡6h，得到所述的纤维素基葡萄糖传感器，即最终产品。
实施例四中的检测结果和实施例1相似，不同之处是实施例四中的颜色是蓝色逐渐加深。
本发明的有益效果：
1、本发明以来源丰富的天然高分子纤维素为原料，用氢氧化钠/尿素水溶液作为溶剂来溶解纤维素，再在凝固浴中流延成膜。纤维素的溶解和膜的制备过程未发生化学反应，技术绿色环保。
2、本发明采用强氧化剂对再生纤维素膜进行改性，将纤维素表面部分羟基氧化成醛基，再通过Schiff - Base反应制得载酶纤维素膜。整个过程是直接在纤维素膜表面进行化学反应，具有操作简单，反应效率高的特点。
3、本发明提供的制备方法操作便利，成本低廉，灵敏度高，无毒无污染，能够应用于较低浓度葡萄糖的检测，方便糖尿病患者的初期诊断，可用于纤维素基葡萄糖传感器的大规模制备。
4、纤维素基体的三维网状结构比表面积较大，在酶的固定中发挥了重要作用，获得了较高的酶载量，有效地保持了酶的活和检验葡萄糖的灵敏度。酶通过化学键键合于纤维素基体上酶固定的牢固。
本发明不局限于上述具体的实施方式，本发明可以有各种更改和变化。凡是依据本发明的技术实质对以上实施方式所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围。